一种利用高山被孢霉突变株生产花生四烯酸油脂的方法及其生产的花生四烯酸油脂

摘要

本发明涉及一种利用高山被孢霉突变株生产花生四烯酸油脂的方法及其生产的花生四烯酸油脂。该方法为将高山被孢霉突变株发酵，收集发酵产物，后处理即得花生四烯酸油脂；所述的高山被孢霉突变株（高山被孢霉ZR36，Mortierella alpine ZR36）于2013年9月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2013419。该高山被孢霉突变株生产的花生四烯酸油脂中饱和脂肪酸特别是二十碳以上长链饱和脂肪酸的总含量比较低（低于15wt%），且花生四烯酸油脂的凝固点也比较低（可低至4℃），其即使在较低温度下也不会凝固结晶析出饱和脂肪酸，可保持清亮透明，具有较高的品质。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用高山被孢霉突变株生产花生四烯酸油脂的方法及其生产的花生四烯 酸油脂。

背景技术

微生物油中存在多种不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸主要包括单不饱和脂肪酸和多不饱和 脂肪酸，它们均对人体健康有很大益处。多不饱和脂肪酸可以合成二十二碳六烯酸（DHA）、 二十碳五烯酸（EPA）、花生四烯酸（ARA），它们在体内具有降血脂、改善血液循环、抑制 血小板凝集、阻抑动脉粥样硬化斑块和血栓形成等功效，对心脑血管病也有良好的防治效果。

花生四烯酸油脂目前已经进入工业化生产阶段，但是，目前研究多只关注于油脂中花生 四烯酸的含量，却忽略了油脂中其他成分，特别是长链饱和脂肪酸的含量。而长链饱和脂肪 酸的含量对油脂的品质影响非常大，如花生四烯酸油脂中长链饱和脂肪酸在体系中所占的比 例对油脂的凝固点起着决定作用，特别是二十碳以上的饱和脂肪酸，例如花生酸(C20:0)，山 嵛酸(C22:0)，木蜡酸(C24:0)等，并且饱和脂肪酸的凝固点一般是随烷基碳链长度(即碳原子 数)的增加而增加。目前，市售高山被孢霉所生产的花生四烯酸油脂产品中，二十碳以上的长 链饱和脂肪酸的含量在20wt%左右。该油脂在12℃时即会析出饱和脂肪酸、出现体系浑浊的 现象，这样就影响了花生四烯酸油脂的质量。

中国发明专利公开号为CN1362522A的专利申请公开了一种以高山被孢霉为出发菌株进 行粒子束诱变的方法得到一种花生四烯酸产量较高的菌株。但是，本发明未提及如何降低长 链饱和脂肪酸的含量。中国发明专利公布号为CN101709297的专利申请公开了一种采用紫外 的方法对高山被孢霉进行诱变，从而能生产出较高产量的花生四烯酸。但是，本发明也未提 及如何降低长链饱和脂肪酸的含量。中国发明专利公开号为CN1662642的专利涉及一种微生 物油，含有至少90％的甘油三酯，PUFA含量为至少40％，其过氧化值(POV)低于1.5(或1.0)， 和/或其茴香胺值(AnV)低于15，可选地，低于12。本申请主要关注的也只是微生物油脂中不 饱和脂肪酸的含量、过氧化值及茴香胺值等，而并未提及长链饱和脂肪酸的含量。

因此，鉴于现有高山被孢霉所制得的花生四烯酸油脂中长链饱和脂肪酸的含量都比较高， 提供一种新的长链饱和脂肪酸含量较低的花生四烯酸油脂及其生产方法实为必要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用高山被孢霉突变株生产花生四烯酸油脂的 方法及其生产的花生四烯酸油脂。其生产的花生四烯酸油脂含有至少90wt%的甘油三酯，油 脂中花生四烯酸含量至少为35wt%，二十碳以上的长链饱和脂肪酸含量低于15wt%。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种利用高山被孢霉突变株生产花生四烯酸油脂的方法，其特征在于：将高山被孢霉突 变株发酵，收集发酵产物，后处理即得花生四烯酸油脂；所述的高山被孢霉突变株（高山被 孢霉ZR36，Mortierella alpine ZR36）于2013年9月13日保藏于中国典型培养物保藏中心 （CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2013419。

按上述方案，所述利用上述高山被孢霉突变株生产花生四烯酸油脂的方法的具体步骤为：

（1）孢子悬浮液的准备：将上述高山被孢霉突变接种到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养 基平板上培养至孢子生成并成熟，获得孢子悬浮液；

（2）种子培养：将上述孢子悬浮液接种于摇瓶培养基中振摇培养获得种子培养液；

（3）发酵培养：待上述步骤（2）振摇培养的种子培养液接种到装有发酵培养基的发酵 瓶中发酵培养；

或根据最终发酵罐的大小，将上述步骤（2）振摇培养的种子培养液逐级扩大培养，获得 种子扩大培养液，然后接种到发酵罐中进行发酵培养；

（4）将发酵液经发酵后处理得到花生四烯酸油脂。

按上述方案，所述的步骤（1）为：将高山被孢霉菌株接种到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA） 培养基平板上，在25-28℃下培养6-9天至孢子生成并成熟，取下培养基上的菌丝和孢子，用 无菌水配制成孢子悬浮液。

按上述方案，所述的步骤（2）为：将步骤（1）的孢子悬浮液接种到摇瓶中进行培养， 接种量为10-20%（体积比），培养温度25-30℃，培养时间36-50h，摇床振摇转速为120-300 转/分钟，所述摇瓶中的种子培养基为：碳源20-50g/l；氮源5-30g/l；pH5.5-8.5。

按上述方案，所述步骤（3）为：当步骤（2）中种子培养液菌浓达到15%～30%（体积浓 度）时，按照10%～20%（体积比）的接种量接入到发酵瓶中振荡培养，所述振摇培养的温度 为25-30℃，培养时间为8-12天，摇床速率为120-300转/分钟，所述发酵培养基为：碳源 50-80g/l；氮源为10-30g/l；pH5.5-8.5；

或根据最终发酵罐的大小，将上述步骤（2）摇瓶培养的种子培养液逐级扩大培养，所述 逐级扩大培养过程中用的种子培养基为：碳源20-50g/l；氮源10-20g/l；pH5.5-8.5，并在菌 浓达到15-30%（体积浓度）时进行下一步扩大培养；每级培养时间为24-50h，培养温度为 25-30℃，通气量为1-2vvm（L/L.min）即每升发酵液中每分钟所需要的空气通入量为1-2L， 罐压0.05-0.15MPa，搅拌速度为150-300转/min；然后将上述获得的种子扩大培养液接种到 最终发酵罐中进行发酵培养，接种量10-20%（体积比），发酵罐温度25-30℃，搅拌速度200-300 转/分钟，通气量1-2vvm（L/L.min）即每升发酵液中每分钟所需要的空气通入量为1-2L，罐 压0.05-0.15Mpa，培养150-180h，并在发酵过程中通过流加碳源来控制发酵液中碳源浓度在 5-20g/L，所述发酵罐中的发酵培养基为：碳源30-50g/l；氮源10-20g/l；pH5.5-8.5。

按上述方案，所述的碳源选自葡萄糖、蔗糖或淀粉；氮源选自酵母粉、酵母浸膏、酵母 浸粉。

按上述方案，所述步骤（4）的后处理为将发酵液分离后的湿菌体烘干得到干菌体，然后 加入萃取剂提取。

一种由上述方法生产的花生四烯酸油脂，所述花生四烯酸油脂含有至少90wt%的甘油三 酯，油脂中花生四烯酸含量至少为35wt%，二十碳以上长链饱和脂肪酸含量低于15wt%。所 述的二十碳以上的长链饱和脂肪酸包括花生酸、山嵛酸、木蜡酸。

按上述方案，所述的花生四烯酸油脂中木蜡酸(C24:0)的含量小于8wt%。

按上述方案，所述花生四烯酸油脂的凝固点为4℃-11℃。

上述菌浓是即将培养液离心后下层菌体的体积占总体系体积的比例。

本发明的有益效果：

利用该发明所述的高山被孢霉突变株生产花生四烯酸油脂的方法生产的花生四烯酸油脂 中饱和脂肪酸特别是二十碳以上长链饱和脂肪酸的总含量比较低（低于15wt%），且花生四烯 酸油脂的凝固点也比较低（可低至4℃），其即使在较低温度下也不会凝固结晶析出饱和脂肪 酸，可保持清亮透明，具有较高的品质。特别地，长链的饱和脂肪酸木蜡酸(C24:0)的含量较 低（小于8wt%），由此可更有效地降低花生四烯酸油脂的凝固点，更好地保证花生四烯酸油 脂的品质。

具体实施方式

以下实施例用来详细说明本发明的具体内容，但本发明并不限于以下实施例的内容。

实施例1.高山被孢霉突变株的选育方法

（1）取市售高山被孢霉为出发菌株。

（2）将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上在28℃恒温条件下培养8天至 孢子成熟。

（3）通过纱布或滤纸过滤得到纯的孢子液，将孢子液注入到无菌培养皿上经过紫外灯照 射,紫外灯照射距离为30厘米，照射时间为60秒，紫外灯的功率为30瓦。

（4）经过紫外诱变后的孢子液经无菌风风干，成为菌斑。将含菌斑的培养皿无菌移入高 能粒子束注入机中，经过高能离子束注入诱变。

（5）将菌斑用无菌水洗脱，稀释，涂于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上进行培 养，随机挑取10个单菌落。

（6）将上述挑取的单菌落进行液体摇瓶培养，根据各菌获得的微生物油酯的脂肪酸分布， 选取长链饱和脂肪酸花生酸（C20:0）、山嵛酸（C22:0）、木蜡酸（C24:0）总含量最低（低于 10wt%）的菌和花生四烯酸含量最高的菌(高于50wt%)。将由此筛选的两株菌分别接到马铃薯 葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上，于25℃，湿度50%的恒温培养箱培养5天，在两株菌的 结合区域挑取菌丝或孢子，转接到新鲜的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上进行培养， 得到本发明的高山被孢霉突变株（高山被孢霉ZR36，Mortierella alpine ZR36），该菌株于2013 年9月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大 学，保藏编号为CCTCC NO:M2013419。

上述高山被孢霉菌株CCTCC NO:M2013419具有以下生理生化特性：

（1）生长于PDA斜面培养基，在28℃下生长2天后，在培养基表面会形成白色菌落， 3天后生长进入对数生长期，气生菌丝颜色雪白，6天后，菌丝布满整个斜面；

（2）孢子形成期非常晚，7天后气生菌丝顶部开始变黄，之后开始分化为黄色孢子囊；

（2）最适宜培养温度为28℃；

（4）用于培养的培养基中可利用的碳源为：葡萄糖、蔗糖、淀粉，不利用或很少利用甘 油；可利用的氮源主要为酵母粉、酵母浸膏、酵母浸粉。

实施例2利用高山被孢霉突变株生产花生四烯酸

a)孢子悬浮液准备：分别取市售的高山被孢霉和本发明所述的保藏编号：CCTCC M2013419 的高山被孢霉突变株接种到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上，25-28℃培养7天 至孢子成熟，，后将马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上的孢子和菌丝刮到装有10 毫升无菌水，震荡获得孢子悬浮液。

b)种子摇瓶培养：将步骤（1）的孢子悬浮液接种到放有培养基的种子瓶中，接种量10%（体 积比），置于25℃，120转/分钟的摇床上培养36小时，所述的培养基为：碳源葡萄糖20 g/l；氮源酵母粉5g/l；pH5.5。

c)发酵瓶培养：待种子瓶中菌浓达到15%（体积比），接入到放有发酵培养基的发酵瓶中， 接种量10%（体积比），置于25℃，120转/分钟的摇床上培养9天。所述发酵培养基为： 碳源葡萄糖50g/l；氮源酵母粉10g/l；pH5.5。

d)后处理：将发酵培养得到的发酵液分离，得到湿菌体，烘干得到干菌体30g。向干菌体 中加入萃取剂正己烷进行萃取，萃取后分离得到的固相物转入萃取容器中进行重复萃取， 如此，直至萃取液中无油时结束萃取过程，第一次萃取时加入200毫升正己烷，之后每 次加入150毫升正己烷，将每次萃取充后过滤分离得到的混合油，脱溶，得到微生物油 酯。

e)将该微生物油脂进行气相色谱分析，同时进行凝固点试验，该微生物油脂中的主要不饱 和脂肪酸和长链饱和脂肪酸的含量包括棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚 油酸(C18:2)、γ-亚麻酸(C18:3)、花生酸(C20:0)、二十碳三烯酸(C20:3)、花生四烯酸 (C20:4)、山嵛酸(C22:0)、木蜡酸(C24:0)见下表：

表1实施例2中花生四烯酸油脂中各脂肪酸含量

  市售菌种(wt%) 本发明用菌种(wt%) 棕榈酸(C16:0) 7.99 9.19 硬脂酸(C18:0) 6.52 10.2 油酸(C18:1) 9.52 9.21 亚油酸(C18:2) 8.22 8.45 γ-亚麻酸(C18:3) 5.21 6.33 二十碳三烯酸(C20:3) 8.09 5.46 花生四烯酸(C20:4) 35.3 35.6 花生酸(C20:0) 3.28 3.43 山嵛酸(C22:0) 4.1 4.12 木蜡酸(C24:0) 11.78 7.26

本实施例用高山被孢霉突变株菌种所制备的花生四烯酸油脂中，甘油三脂的含量为 91wt%，另结合表1可知：该花生四烯酸油脂中花生四烯酸油脂的含量为35.3wt%，三种长 链饱和脂肪酸即花生酸（C20:0）、山嵛酸（C22:0）、木蜡酸（C24:0）的总含量为14.81wt%， 其中木蜡酸（C24:0）的含量为7.26wt%。明显低于市售菌种所制备的花生四烯酸油脂中三种 长链饱和脂肪酸的总含量（19.16wt%），而木蜡酸（C24:0）的含量也明显低于市售菌种所制 备的花生四烯酸油脂中木蜡酸（C24:0）的含量（11.78wt%）。另，经凝固点测定:本发明用 高山被孢霉突变株菌种所制备的花生四烯酸油脂凝固点为9℃，其远低于市售菌种所制备的 花生四烯酸油脂的凝固点（18℃）。

实施例3利用高山被孢霉突变株生产花生四烯酸

a)孢子悬浮液准备：分别取市售的高山被孢霉和本发明所使用的高山被孢霉（保藏编号： CCTCC M2013419）接种到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上，25-28℃培养8天 至孢子成熟，后将马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上的孢子和菌丝刮到装有20毫 升无菌水，震荡获得孢子悬浮液。

b)摇瓶种子培养：将步骤（1）的孢子悬浮液接种到放有培养基的种子瓶中，接种量15%（体 积比），置于28℃，220转/分钟的摇床上培养48小时，所述培养基为：碳源蔗糖35g/l； 氮源酵母浸粉12g/l；pH7。

c)种子扩大培养：最终发酵罐培养采用50L的容积，因此种子罐选用10L种子扩大发酵罐。 将步骤（2）的摇瓶种子发酵液接种到种子罐中进行种子扩大培养，其中的种子培养基碳 源蔗糖35g/l；氮源酵母浸粉12g/l，控制pH7，发酵温度为28℃，搅拌速度220转/分钟， 通气量1vvm（L/L.min），罐压0.1Mpa，培养42h。

d)发酵培养：种子罐中菌浓达到20%后，通过移种管道接入到装有30L发酵培养基的50L 发酵罐中进行培养，接种量15%（体积比），发酵罐控制温度28℃，搅拌速度220转/分 钟，通气量1vvm（L/L.min），罐压0.1Mpa，培养170h。发酵过程中通过流加碳源来控 制发酵液中碳源浓度在10g/L，所述发酵罐中的发酵培养基为：碳源蔗糖35g/l；氮源酵 母浸粉12g/l；pH7。

e)后处理：将发酵培养得到的发酵液分离，得到湿菌体，烘干得到干菌体40g。向干菌体 中加入萃取剂正己烷进行萃取，萃取后分离得到的固相物转入萃取容器中进行重复萃取， 如此，直至萃取液中无油时结束萃取过程，第一次萃取时加入200毫升正己烷，之后每 次加入150毫升正己烷，将每次萃取充后过滤分离得到的混合油，脱溶，得到微生物油 酯。

f)将该微生物油脂进行气相色谱分析，同时进行凝固点试验，该微生物油脂中的主要不饱 和脂肪酸和长链饱和脂肪酸的含量包括棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚 油酸(C18:2)、γ-亚麻酸(C18:3)、花生酸(C20:0)、二十碳三烯酸(C20:3)、花生四烯酸 (C20:4)、山嵛酸(C22:0)、木蜡酸(C24:0)如下：

表2实施例3中花生四烯酸油脂中各脂肪酸含量

本实施例用高山被孢霉突变株菌种所制备的花生四烯酸油脂中，甘油三脂的含量为 93wt%，另结合表2可知：该花生四烯酸油脂中花生四烯酸油脂的含量为40.8wt%，三种长 链饱和脂肪酸，即花生酸（C20:0）、山嵛酸（C22:0）、木蜡酸（C24:0）的总含量为10.3wt%， 其中木蜡酸（C24:0）的含量为3.2wt%，明显低于市售菌种所制备的花生四烯酸油脂中三种 长链饱和脂肪酸的总含量（18.73wt%），另木蜡酸（C24:0）的含量也明显低于市售菌种所制 备的花生四烯酸油脂中木蜡酸（C24:0）的含量（11.23wt%）。另，经凝固点测定:本发明生产 的花生四烯酸油脂凝固点为6℃。其远低于市售菌种所制备的花生四烯酸油脂的凝固点 （15℃）。

实施例4利用高山被孢霉突变株生产花生四烯酸

a)孢子悬浮液准备：分别取市售的高山被孢霉和本发明所使用的高山被孢霉突变株（保藏

编号：CCTCC M2013419）接种到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上，？-？℃培 养8天至孢子成熟，后将马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上的孢子和菌丝刮到装 有30毫升无菌水，震荡获得孢子悬浮液。

b)摇瓶种子培养：将步骤（1）的孢子悬浮液接种到放有培养基的种子瓶中，接种量20%（体 积比），置于30℃，300转/分钟的摇床上培养50小时，所述培养基为：碳源蔗糖50g/l； 氮源酵母浸粉12g/l；pH8.5。

c)种子扩大培养：最终发酵罐的体积为200m³，依次选用容积为10L，50L，5m³，50m³的 种子罐扩大培养种子液，种子罐中培养基装量为60%（体积比），培养过程工艺控制为： 温度30℃，搅拌速度300转/分钟，通气量1.5vvm（L/L.min），培养时间48h。所述种子 罐中的种子培养基为：碳源淀粉50g/l；氮源酵母浸膏20g/l；pH8.5，将上述步骤的摇瓶 培养液逐级扩大培养。

d)发酵培养：待50m³种子罐中的菌浓达到30%（体积比）后，通过移种管道接入到装有130m³发酵培养基的200m³发酵罐中进行培养，接种量20%（体积比），发酵罐控制温度30℃， 搅拌速度300转/分钟，通气量1.5vvm（L/L.min），罐压0.15Mpa，培养180h。发酵过程 中通过流加碳源来控制发酵液中碳源浓度在20g/L，所述发酵罐培养基为：碳源淀粉50 g/l；氮源酵母浸膏20g/l；pH8.5。

e)后处理：将发酵培养得到的发酵液分离，得到湿菌体，烘干得到干菌体50g。向干菌体 中加入萃取剂正己烷进行萃取，萃取后分离得到的固相物转入萃取容器中进行重复萃取， 如此，直至萃取液中无油时结束萃取过程，第一次萃取时加入200毫升正己烷，之后每 次加入150毫升正己烷，将每次萃取充后过滤分离得到的混合油，脱溶，得到微生物油 酯。

f)将该微生物油脂进行气相色谱分析，同时进行凝固点试验，该微生物油脂中的主要不饱 和脂肪酸和长链饱和脂肪酸的含量包括棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚 油酸(C18:2)、γ-亚麻酸(C18:3)、花生酸(C20:0)、二十碳三烯酸(C20:3)、花生四烯酸 (C20:4)、山嵛酸(C22:0)、木蜡酸(C24:0)如下：

表3实施例4中花生四烯酸油脂中各脂肪酸含量

  对照菌种(ｗt%) 本发明所用菌种(ｗt%) 棕榈酸(C16:0) 7.99 9.78 硬脂酸(C18:0) 7.31 10.52 油酸(C18:1) 6.77 9.32 亚油酸(C18:2) 7.36 8.37 γ-亚麻酸(C18:3) 2.65 3.1 二十碳三烯酸(C20:3) 4.63 6.27 花生四烯酸(C20:4) 44.97 44.56 花生酸(C20:0) 3.1 1.5 山嵛酸(C22:0) 4 3.08 木蜡酸(C24:0) 12 2.92

本实施例用高山被孢霉突变株菌种所制备的花生四烯酸油脂中，甘油三脂的含量为 95wt%，另结合表2可知：该花生四烯酸油脂中花生四烯酸油脂的含量为44.97wt%，三种长 链饱和脂肪酸，即花生酸（C20:0）、山嵛酸（C22:0）、木蜡酸（C24:0）的总含量为7.5wt%， 其中木蜡酸（C24:0）的含量为2.92wt%，明显低于市售菌种所制备的花生四烯酸油脂中三种 长链饱和脂肪酸的总含量（19.1wt%），另木蜡酸（C24:0）的含量也明显低于市售菌种所制备 的花生四烯酸油脂中木蜡酸（C24:0）的含量（12wt%）。另，经凝固点测定:本发明生产的花 生四烯酸油脂凝固点为4℃，其远低于市售菌种所制备的花生四烯酸油脂的凝固点（15℃）。

综合以上实施例可以看出，利用本发明所述的高山被孢霉突变株生产的花生四烯酸油脂， 其花生四烯酸的含量与市售产品差别不大，但是二十碳以上长链饱和脂肪酸的总含量明显较 低，特别是二十四碳饱和脂肪酸的含量明显较低，由此使花生四烯酸油脂的凝固点也比较低 （最低可低至4℃），其即使在较低温度下也不会凝固结晶析出饱和脂肪酸，可保持清亮透明， 具有较高的品质。