一株邻苯二甲酸酯高效降解芽孢杆菌的筛选鉴定及其应用

摘要

本发明提供一株从大量使用过地膜的土壤中分离的对邻苯二甲酸酯有高效降解能力的菌株JF，属于生物技术领域。该菌株生长速度快，产生芽孢，对外界环境抵抗力强，在宽温度（30℃-45℃）和宽pH（pH5.0-8.0）范围内对邻苯二甲酸酯的降解率在90%以上。该菌株经鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），登录号为KF364634，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2013年07月22日，保藏编号：CGMCC No. 7950。该菌株可用于被邻苯二甲酸酯所污染的土壤、污水的生物修复或生物净化，保护生态环境，进而保障农产品安全。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株高效降解邻苯二甲酸酯芽孢杆菌的筛选鉴定及其应用。 

背景技术

邻苯二甲酸酯（Phthalates,PAEs,酚酞酯）是世界上生产量大、应用面广的人工合成有机化合物之一，属芳香族二羧酸酯,多为高沸点、低蒸气压、无色无味的液体，它们被广泛应用于塑料助剂、油漆溶剂、合成橡胶和涂料等的增塑剂和软化剂，以增大塑料的可塑性和韧性,提高塑料的强度。PAEs类化合物是大约30种化合物的总称，由邻苯二甲酸和相应的醇化合而成的，我国常用的品种有：邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）、邻苯二甲酸二辛酯（DOP）、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二壬酯(DNP)等，其中DBP和DEHP用量最大，DBP和DEHP被美国环保局列为优先控制污染物，欧盟也将DBP作为高风险评估的管控物质，中国也已经将其列入环境优先污染物黑名单。 

近年来，随着邻苯二甲酸酯（Phthalates,PAEs）在工业中的大量使用，PAEs已经普遍存在于土壤、底泥、水体、空气以及大气沉降物等环境中，成为环境中重要的污染物之一。目前普遍认为PAEs是一种环境内分泌干扰物，而其中的某些种类对人体和动物具有致畸、致癌、致突变作用，邻苯二甲酸酯类可通过消化系统、呼吸系统及皮肤接触等途径进入人体，具有生殖毒性和发育毒性，这种危害是隐蔽而漫长的。 

邻苯二甲酸酯在环境中半衰期长，其水解和光解的速率非常缓慢，属难降解物质, PAEs的微生物降解是自然环境中的主要途径,目前仅见余志晟等报道的Gordonia sp.QH-9 可降解邻苯二甲酸酯的专利。曾巧云等研究了PAEs可通过土壤及自身的挥发进入农作物，且在农作物内具有富集特性，经食用进入人体，直接危害人体健康。由于芽孢杆菌能形成芽孢，在自然环境中的抵抗力强于其他微生物，因此,获得PAEs高效降解菌尤其是高效降解芽孢杆菌具有重要的实践意义，可为消除环境PAEs污染、保护生态环境和保障农产品安全提供菌种资源和技术支撑。 

本专利是从四川省雅安市雨城区使用地膜的蔬菜田地的土壤中分离到的一株可高效降解邻苯二甲酸二丁酯的菌株，经16S rDNA测序鉴定，该菌株基因序列与Bacillus subtilis菌株序列高度同源。经过试验可知该菌株可利用邻苯二甲酸二丁酯作为唯一碳源和能源生长繁殖，在14h内可将LB培养基中200mg/L DBP完全降解，且在宽温度（30℃-45℃）和宽pH（pH5.0-8.0）范围内均对邻苯二甲酸二丁酯均有较好的降解能力；同时，该菌对邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸丁苄酯、邻苯二甲酸二壬酯等均具有较强的降解能力。充分说明该菌株在处理含有邻苯二甲酸酯类化合物污染的生物修复方面具有独特的应用潜力。 

发明内容

本发明的目的是提供一株可高效降解邻苯二甲酸酯类化合物的菌株及其应用。 

本发明所提供的降解菌株经鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.7950，保藏日期为2013年07月22日。 

本发明所提供的降解菌株Bacillus subtilis strain JF的生物学特性：兼性厌氧，革兰氏染色阳性的芽孢杆菌，对葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇发酵均呈阳性；能水解明胶和淀粉；苯丙胺酸脱氢酶和卵黄卵磷脂酶呈阴性。 

本发明所提供的降解菌株的分离与筛选： 

取四川省雅安市雨城区使用地膜的蔬菜田地的土壤样品4份，分别拌匀，各取5g，置于装有30mL LB培养基的250 mL锥形瓶中，于80℃下加热10min，冷至室温再加入邻苯二甲酸二丁酯使其质量浓度为50 mg/L，于35℃、180 r/min振荡培养168h。培养结束后按5%接种量再依次进行3次富集培养，每次培养168 h，并逐步提高培养基中邻苯二甲酸二丁酯浓度，使之分别达到100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L。将最后一级梯度驯化后的培养液按5%（v/v）接种量转接于30 mL 含100 mg/L邻苯二甲酸二丁酯的LB培养基中，并用无菌生理盐水作空白对照，于35℃、180 r/min振荡培养120 h，测定各培养液中邻苯二甲酸二丁酯残留量。

将确定有邻苯二甲酸二丁酯减少的培养液进行菌株分离，取培养液稀释涂布于含100 mg/L邻苯二甲酸二丁酯的LB平板中，35℃培养72 h后，对生长出的菌落进行分离纯化。将纯化后的菌株于含100 mg/L邻苯二甲酸二丁酯的LB斜面上划线培养，用无菌生理盐水洗下培养物制成种子液（调整细胞浓度约10⁸cfu/mL）。将种子液按5%接种量接种于30 mL含100 mg/L邻苯二甲酸二丁酯的LB培养基中，并用无菌生理盐水设置空白对照。35℃、180 r/min摇振培养120 h后，测定各培养液中邻苯二甲酸二丁酯的残留量，确定分离菌株对邻苯二甲酸二丁酯的降解能力。 

菌株形态鉴定：革兰氏染色阳性,芽孢杆菌，菌落近圆形，扁平，不透明，微黄色，不反光，表面皱褶，边缘不整齐。 

菌株生理生化鉴定 

表1 菌株JF生理生化测定结果。 

菌株JF分子遗传学鉴定。 

菌株JF经16S rDNA序列测定，获得如下序列：   

gagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatgcttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcgatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtgatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaggggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttaggagccagccgccgaaggtgggacagatgattggggtgaagtcgtaacaaggtagccgta。

该菌株的16S rDNA基因测序结果与GenBank数据库中序列进行Blast同源性对比，该菌株序列与Bacillus subtilis菌株基因序列高度同源，得到登录号为KF364634。 

本发明所提供的高效降解邻苯二甲酸酯类化合物的菌株JF是从四川省雅安市雨城区使用地膜的蔬菜田地的土壤样品富集得到的，该菌株在宽温度和宽pH范围内均对邻苯二甲酸二丁酯有很高的降解能力，其生长速度快，产生芽孢，对外界环境抵抗力强，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.7950，保藏日期为2013年07月22日。 

本发明所用培养基为：Luria-Bertani培养基(LB)：酵母浸膏（Yeast extract）5.0g;胰蛋白胨(Casein tryptone)10g;氯化钠（Sodium chloride）10g;蒸馏水（H₂O）1000mL;调pH至7.0；基础培养基（MM）：硫酸铵((NH₄)₂SO₄)1.5g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.5g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)1.5g，硫酸镁(MgSO₄)0.2g，氯化钠(NaCl)0.5g，去离子水（H₂O）1000mL，调pH至7.0。此两种固体培养基是在液体培养基中再加20g/L琼脂(Agar)制成的。培养基于121℃，灭菌20min备用。 

附图说明

图1为降解菌株JF培养48h的菌落培养特征。 

图2为降解菌株JF的细胞形态图。 

图3为具体实施方式实例1中降解菌株JF的生长与邻苯二甲酸二丁酯的降解关系的曲线。 

图4为温度对菌株JF降解邻苯二甲酸二丁酯速率的影响。 

图5为pH值对菌株JF降解邻苯二甲酸二丁酯速率的影响。 

图6为底物质量浓度对菌株JF降解邻苯二甲酸二丁酯速率的影响。 

具体实施方式

实例1：确定邻苯二甲酸酯降解菌株JF的生长情况与邻苯二甲酸二丁酯降解的关系 

菌种活化：挑取降解邻苯二甲酸酯的菌株JF至LB液体培养基中，35℃，180r/min振荡培养24h;然后连续划线、挑取单菌落培养两次（35℃），挑取单菌落接种至LB斜面35℃培养2d备用。

用无菌生理盐水洗下斜面上菌体并调整细胞浓度为10⁸cfu/mL，制成种子液。 

生长曲线的测定：将降解菌株JF的种子液按5%接种量接种于含有200mg/L邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的LB液体培养基中,分装30 mL/250mL锥形瓶,35℃、180r/min培养48h，取样时间为0h-36h期间每2h取样1瓶，36h-48h期间每4h取样1瓶，样品存放于4℃冰箱内，测OD₆₀₀。 

降解曲线的测定：将降解菌株JF的种子液按5%接种量接种于含有200mg/L邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的LB液体培养基中, 分装30 mL/250mL锥形瓶,设接种5%无菌水为空白对照，35℃、180r/min振荡培养，取样时间为0h-36h期间每2h取样1瓶，36h-48h期间每4h取样1瓶，再从锥形瓶中取均匀培养液1mL，用乙腈定容至10mL，混匀后于10000r/min离心10min，取上清液供液相色谱（HPLC）分析用。测定条件：色谱柱为Gemini 100? C18柱（150mm×4.60mm，5.0μm）；流动相为乙腈:水（83:17，V/V），流速1.0mL/min；紫外检测器，其波长为210nm；柱温为25℃；进样量10μL。 

由结果可知降解菌株经过48h培养，对照组的邻苯二甲酸二丁酯几乎无降解，实验组中约100%邻苯二甲酸二丁酯被降解菌株JF降解，14h内，邻苯二甲酸二丁酯与降解菌株JF生长呈正相关，菌株对邻苯二甲酸二丁酯降解速率较快，24h菌体生物量达到最大，此后菌体生长趋于稳定。 

实例2：菌株JF降解邻苯二甲酸二丁酯的降解特性 

底物浓度对菌株JF降解邻苯二甲酸二丁酯速率的影响：按5.0%（v/v）的接种量，将种子液（1.0×10⁸ 个/mL）接种于邻苯二甲酸二丁酯浓度不同的LB液体培养基（pH7.0, 100 mg/L, 200 mg/L, 300 mg/L,400 mg/L）中，分装30 mL/250 mL锥形瓶，35℃、180 r/min振荡培养，间隔4h取样。用[0024]所述方法测定邻苯二甲酸二丁酯降解率。

培养温度对菌株JF降解邻苯二甲酸二丁酯速率的影响： 按5.0%（v/v）的接种量，将种子液（1.0×10⁸ 个/mL）接种于邻苯二甲酸二丁酯质量浓度为200 mg/L的LB液体培养基（pH7.0）中，分装30 mL/250 mL锥形瓶，不同温度下(30℃，35℃，40℃,45℃)180 r/min振荡培养，间隔4h取样。用[0024]所述方法测定邻苯二甲酸二丁酯降解率。 

pH对菌株JF降解邻苯二甲酸二丁酯速率的影响：按5.0%（v/v）的接种量，将种子液（1.0×10⁸ 个/mL）接种于不同pH（5.0,6.0,7.0,8.0）的邻苯二甲酸二丁酯质量浓度为200 mg/L的LB液体培养基中，分装30 mL/250 mL锥形瓶，35℃，180 r/min振荡培养，间隔4h取样。用[0024]所述方法测定邻苯二甲酸二丁酯降解率。 

菌株JF降解邻苯二甲酸二丁酯的降解特性结果：在测试的底物(邻苯二甲酸二丁酯)质量浓度、温度、pH值范围内，邻苯二甲酸二丁酯半衰期为3.1 h ～7.0h，远远低于其自然降解半衰期(4.4 d ~15.1d)，在底物质量浓度为100mg/L时12h内可完全降解邻苯二甲酸二丁酯，进一步证明了菌株JF可以高效降解邻苯二甲酸二丁酯，且菌株的生长速率较快。温度在30～45℃范围内，菌株对邻苯二甲酸二丁酯降解率变化比较大，且呈现逐渐升高的趋势；pH值对邻苯二甲酸二丁酯降解率影响不大；底物浓度在100～400mg/L范围内，邻苯二甲酸二丁酯降解率变化较大，底物质量浓度达到400mg/L时，邻苯二甲酸二丁酯降解率较低，显然邻苯二甲酸二丁酯抑制了菌株的生长。这一研究结果可为菌株JF应用于污水处理和土壤修复提供一定的数据参考。 

实例3： 邻苯二甲酸酯降解菌株JF在MM培养基中对邻苯二甲酸二丁酯的降解效果 

将降解菌株的种子液按5%接种量接种于200mg/L邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的MM液体培养基中, 分装30 mL/250mL锥形瓶,设接种5%无菌水为空白对照,35℃、180r/min振荡培养。

培养60h后取样，用[0024]所述方法测定培养液中邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的残留量，对照组邻苯二甲酸二丁酯(DBP)几乎没有降解，实验组中约92.66%邻苯二甲酸二丁酯(DBP)被菌株JF降解。 

实例4：邻苯二甲酸酯降解菌株JF对邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯(DEHP)的降解效果 

将降解菌株的种子液按5%接种量接种于200mg/L邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯(DEHP)的LB液体培养基中, 分装30 mL/250mL锥形瓶,设接种5%无菌水为空白对照,35℃、180r/min振荡培养。

培养20h后取样，用[0024]所述方法测定培养液中邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯的残留量，对照组邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯几乎无降解，实验组中约97.01%邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯被菌株JF降解。 

实例5：邻苯二甲酸酯降解菌株JF对被污染土壤中的邻苯二甲酸酯的降解效果 

从四川省雅安市雨城区使用地膜的蔬菜田地的土壤中取一定量的土壤样品，添加邻苯二甲酸二丁酯(DBP)使其质量浓度约为200mg/L,将降解菌株的种子液按5%接种量接种（实验组），设接种5%无菌水为空白对照,35℃培养，每24h取样，用[0024]所述方法测定土壤样品中DBP的残留量。

通过HPLC检测样品中邻苯二甲酸二丁酯的残留量，空白土壤样品中邻苯二甲酸二丁酯含量变化较小，实验组的土壤样品在5d时几乎检测不到邻苯二甲酸二丁酯。 

实例6：邻苯二甲酸酯降解菌株JF对塑胶厂污水中邻苯二甲酸酯的降解效果 

从四川省成都市某塑胶厂的污水中取一定量的污水样品，添加邻苯二甲酸二丁酯(DBP) 使其浓度约为200mg/L,将降解菌株的种子液按5%接种量接种（实验组），设接种5%无菌水为空白对照, 35℃培养，每24h取样，用[0024]所述方法测定污水样品中DBP的残留量。

通过HPLC检测样品中邻苯二甲酸二丁酯的残留量，空白污水样品中邻苯二甲酸二丁酯含量变化较小，实验组的污水样品在4d时几乎检测不到邻苯二甲酸二丁酯。 

以上的实例仅仅是对本发明的实施方式进行描述，而并非对本发明的范围进行限定，对于本领域的技术人员来说，可以对上述说明进行改进或变形，但所有的这些改进或变形均应落入本发明的权利要求确定的保护范围。