一种高效花生根瘤固氮菌株及其应用

摘要

本发明涉及一种新的根瘤固氮菌菌株，所述菌株具有较高的生物固氮活性，对植物真菌病害有一定的防治作用，且具有较好的耐盐碱性和耐高温特性，可起到固氮防病、抗逆、增产的作用。所述根瘤固氮菌（Rhizobiumleguminosarum）已经于2013年7月15日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7924。研究表明，所述菌株可以使花生根部结瘤、对灰霉病菌和腐霉病菌具有良好的抑制效果、具有耐盐碱性以及耐高温性能。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株对花生具有良好固氮和抑菌作用的根瘤固氮菌株及其在制备生物固氮菌肥中的应用。 

背景技术

氮素是植物生长最重要的营养元素之一，作物增产常需要施用大量氮肥。植物在土壤中生长主要依靠化学肥料和生物固氮作用来提供氮源。由于化学肥料的生产成本较高，利用率较低以及对土壤及环境所造成的巨大影响，使得生物固氮成为研究者关注的重点。生物固氮是固氮微生物将空气中的N₂转化为NH₃的过程，该过程是高效、环保和经济有效的。目前，研究最为广泛、固氮效率较高的是与豆科植物共生的根瘤固氮菌。它具有固氮能力强、固氮量大、抗逆能力强等优点，不仅可以提高土壤肥力，也可以减少化肥的使用量, 降低生产成本, 减少环境污染。 

随着研究的深入，发现根瘤固氮菌与一些微量元素复配，可以明显增加豆科植物的生物学产量。比如在花生根瘤固氮菌肥中适当添加钼元素, 能够明显提高花生的固氮效果, 进一步研究表明钼是固氮酶的组分之一, 是豆科植物与根瘤固氮菌之间共生固氮过程中所必需的营养元素之一,  花生上缺钼时常表现根瘤发育不良，瘤偏小且少、固氮能力下降。还有研究发现，铁肥与根瘤固氮菌混施情况下，可以促进根瘤固氮菌与花生的共生固氮效应，增加植株干重，提高植株全氮含量和叶绿素含量。另据报道，适宜浓度的钴也能促进根瘤固氮菌的生长繁殖、有助于结瘤的形成及植株的生长发育，如施用氯化钴后可以改善豆科植物花生和大豆的外观, 提高了叶绿素含量、植株固氮能力及植株干重。综合研究表明经接种花生根瘤菌后，再追施钼磷、钼氮、磷氮及钼磷氮等混合肥料比仅接种根瘤菌时增产更加明显，而以根瘤菌+钼磷氮混合施用效果最好。 然而，由于不同根瘤固氮菌对微量元素的耐受性和土壤环境有所差异，因此“根瘤固氮菌+微量元素”复合菌肥的研制中，根瘤固氮菌与适宜的微量元素的配伍，以及二者的复合比例也是需要进行选择和优化的。  

此外，根瘤固氮菌株与其他有益菌株的合理复配能够进一步增强植株的固氮能力，促进营养吸收和提高抗病抗逆能力，比如溶磷钾微生物巨大芽孢杆菌（ACCC10008 Bacillus megaterium）能够分泌一些生长调节物质，促进花生对营养物质的吸收和根系生长，但这方面的研究也是处于探索阶段。

目前，结合土壤肥力水平和高效菌株的选育，研制和应用高效微生物肥料对提高作物产量和品质、降低成本、保护生态环境、发展绿色农业和生态农业具有重要的意义。目前国内外科研人员在根瘤固氮菌的分离筛选方面做了大量的工作，以期获得一些高效的根瘤固氮菌株。本发明从我国北方地区土壤中分离得到一种新的根瘤固氮菌株，不仅有高效地固氮能力，还具有对植物病原菌很好的拮抗作用和耐盐碱、 耐高温特性，并确定其在生物固氮肥料中的应用。 

发明内容

 本发明目的是提供一种新的根瘤固氮菌菌株，所述菌株具有较高的生物固氮活性，对植物真菌病害有一定的防治作用，且具有较好的耐盐碱性和耐高温特性，可起到固氮、防病、抗逆、增产的作用。 

本发明所述的豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）已经于2013年7月15日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.7924。 

本发明所提供的根瘤固氮菌株是2012年7月在山东潍坊花生种植基地分离得到的，其实验室命名为MSB1103。 

将菌株MSB1103在YMA固体培养基上培养，所述YMA固体培养基的组分为：甘露醇 10 g，K₂HPO₄ 0.25 g，MgSO₄ 0.2 g，KH₂PO₄ 0.25 g，NaCl 0.1 g，CaCO₃ 3 g，酵母粉 3 g，琼脂 15 g，蒸馏水 1000 mL。通过观察发现，初期菌落为半透明点状物，后期菌落为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐。革兰氏阴性菌，无芽孢存在。显微观察菌体为杆状，运动，有鞭毛。利用生理生化对其进行鉴定：主要包括明胶水解、接触酶试验、固氮能力及5%NaCl呈阳性；淀粉水解、吲哚产生、柠檬酸盐利用、V-P测定、卵磷脂降解、硝酸盐还原呈阴性。然后利用分子生物学手段对采用16S rDNA基因特异引物对16S rDNA进行扩增，将扩增产物回收并测序，将测序结果进行Blast分析，结果发现与菌株MSB1103高度同源的菌株均是Rhizobium leguminosarum，同源性95% 以上。 

进一步地，本发明提供上述根瘤固氮菌株在花生植株中的固氮及防治植物病害的用途。 

优选地，所述植物病害的病原体为腐霉病菌（Pythium sp.）或灰霉病菌（Botrytis cinerea）。 

进一步地，本发明是提供上述根瘤固氮菌株在花生植株上共生固氮以及在生物固氮菌肥中的应用。 

进一步地，本发明的上述根瘤固氮菌株可单独用于制备固氮菌菌剂；即将所述菌株在YMA培养基中培养，所述YMA培养基为甘露醇 10 g，K₂HPO₄ 0.25 g，MgSO₄ 0.2 g，KH₂PO₄ 0.25 g，NaCl 0.1 g，CaCO₃ 3 g，酵母粉 3 g，蒸馏水 1000 mL；培养温度为25-30℃，以200 rpm发酵3d，待菌液浓度达到1×10⁹个/mL发酵结束，即制得本发明的液态的固氮菌菌剂。 

进一步地，本申请还提供一种复合微生物菌肥，即将上述固氮菌菌剂与其他有益成分进行复配，所述有益成分为微量元素肥料、其它有益的微生物菌株、有机肥或无机氮磷钾肥料等。 

本申请涉及一种复合微生物菌肥，即将上述固氮菌菌剂与微量元素肥料以重量比为1:3进行混合，所述微量元素肥料选自碳酸锰锌、硼镁肥、钼酸钠、螯合态铜或磷酸铵铁中的一种或多种； 

进一步地，本申请涉及另一种复合微生物菌肥，即将上述固氮菌菌剂与微量元素肥料和拮抗微生物混合制得，三者的重量比为3：4：3，所述微量元素肥料选自碳酸锰锌、硼镁肥、钼酸钠、螯合态铜或磷酸铵铁中的一种或多种；所述拮抗微生物为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilus），例如武大绿洲生物生产的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilus）。

进一步地，本申请涉及另一种复合微生物菌肥，即将上述固氮菌菌剂与微量元素肥料和有机肥混合制得，三者的重量比为1:3:6；所述微量元素肥料选自碳酸锰锌、硼镁肥、钼酸钠、螯合态铜或磷酸铵铁中的一种或多种；所述有机肥为堆肥或沼气肥。 

本申请的上述复合微生物菌肥将原料按比例充分搅拌，混合均匀，随后用传送带经粉碎后送入滚筒造粒机，在滚筒内喷射蒸汽使物料加热至20-40℃，通过滚筒不停转动使物料成球状颗粒。将成球颗粒送入烘干滚筒，输入热风烘干。将烘干的成球经冷却、筛分、罐装或袋装成成品。 

  

本发明的效果

1、在温室试验中，本发明的根瘤固氮菌株可以使花生根部结瘤，说明本发明菌株具有固氮能力。

2、在平板对峙法中，本发明的根瘤固氮菌株对灰霉病菌和腐霉病菌具有良好的抑制效果，抑制率均在60%以上，说明本发明菌株具有一定的抑菌性。 

3、在耐盐碱性试验中，本发明的根瘤固氮菌株可在pH为9甚至11的培养基中有效生长，说明本发明菌株具有一定的耐碱性。 

4、在耐高温试验中，本发明的根瘤固氮菌株可在温度为45℃条件下有效生长，说明本发明菌株具有一定的耐高温性。 

  

附图说明：

图1本发明的根瘤固氮菌MSB1103在花生上结瘤

图2本发明的根瘤固氮菌MSB1103菌落形态图

图3本发明的根瘤固氮菌MSB1103革兰氏染色图

图4本发明的根瘤固氮菌MSB1103固氮基因nifH部分序列鉴定电泳图谱

图5本发明的根瘤固氮菌MSB1103耐盐碱性检测

图6本发明的根瘤固氮菌MSB1103耐高温检测

图7本发明的根瘤固氮菌MSB1103拮抗真菌效果

具体实施方式

本发明公开了一种具有高固氮活性、耐高温、耐盐碱、且对植物真菌病害具有防治作用的根瘤固氮菌株，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数来实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，这些都被视为包括在被发明内。本发明所述的根瘤固氮菌株已经通过较规范的实施例进行了描述，相关人员明显能在不摆脱本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动和适当的变更与组合，来实现和应用本发明技术。 

下面结合实施例，进一步阐述本发明。 

实施例1、本发明根瘤固氮菌MSB1103的分离获取 

2012年7月在山东潍坊花生种植基地采集到一株结瘤多生长茂盛的花生，对其根部根瘤进行分离及纯化：取新鲜的根瘤，用水冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分；将根瘤放入95%的酒精中处理3 min，再放入0.1%的HgCl₂中，灭菌3-5 min，取出后用无菌水冲洗5-6次；将经灭菌的根瘤放在灭菌的载玻片上切成两半，用无菌的镊子夹住半个瘤，切口面向YMA培养基表面划线，倒置28℃培养箱培养，所述YMA培养基的组成为：甘露醇 10 g，K₂HPO₄  0.25 g，MgSO₄ 0.2 g，KH₂PO₄ 0.25 g，NaCl 0.1 g，CaCO₃ 3 g，酵母粉 3 g，琼脂 15 g，蒸馏水 1 000 mL。

实施例2、接种鉴定 

按照实施例1所述，本发明共筛选得到11株固氮菌，将11株固氮菌进行接种鉴定。试验用灭菌的质量比为1:1的蛭石和营养土的混合物作为培养基质。选取饱满的花生种子，在75%酒精中处理1 min，水洗5-6次，然后用0.1%的升汞表面灭菌6 min，水洗6-7次，在无菌水中浸种过夜至吸涨。将吸涨的种子在灭菌的培养皿中25℃催芽。将胚根长至3-4 cm时转移到灭菌的培养基质中，待花生长出4片子叶时，每盆加2 mL菌液，置于光照培养箱内培养，以不加菌液作为空白对照。对照和接种处理各设置3个重复。

接菌的花生培养至2个月左右时，将花生连根拔起，注意不要破坏根部，将分离出的根瘤菌回接到花生上，能结瘤的则为根瘤菌。结果如图1所示，即本发明的根瘤固氮菌株MSB1103可在花生上产生大量根瘤。 

  

实施例3、本发明根瘤固氮菌MSB1103的菌落形态及生理生化鉴定

将本发明的根瘤固氮菌MSB1103在YMA培养基上进行划线，所得单菌落形态如图2所示：生长初期菌落为半透明点状物，后期菌落为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐。革兰氏检测如图3所示，该菌为革兰氏阴性菌，无芽孢存在。显微观察菌体为杆状，运动，有鞭毛。

对获得的菌株进行生理生化鉴定，包括明胶水解、接触酶试验、固氮能力及5%NaCl、淀粉水解、吲哚产生、柠檬酸盐利用、V-P测定、卵磷脂降解及硝酸盐还原实验。 

表1 菌株的生理生化指标测定 

测定指标菌株特征测定指标菌株特征淀粉水解-吲哚产生-明胶水解+V-P测定-柠檬酸盐利用-硝酸盐还原-5%NaCl+卵磷脂降解-接触酶实验+固氮能力+

实施例4、本发明根瘤固氮菌MSB1103的16S rDNA的序列分子鉴定

为确定本发明根瘤固氮菌MSB1103的系统发育地位，提取菌株总DNA，然后利用16S rDNA引物（27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’； 1495R：5’-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）进行PCR特异性扩增。

PCR反应体系（总体系25 μL）：DNA 1.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL） 0.3 μL，10×Taq buffer（Mg²⁺ plus） 2.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L） 2.0 μL，引物各1 μL，ddH₂O 17.2 μL。PCR反应条件为：95℃，5 min；94℃，30 s，56℃，30 s，72℃，1 min，共35个循环；72℃，10 min。PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上1.5~2 V/cm电泳检测结果见附图所示MSB1103琼脂糖凝胶电泳图，送往上海生工公司进行测序，将所得到的序列结果在NCBI进行比对，发现根瘤菌MSB1103与Rhizobium leguminosarum相似性达97%，如表2所示，结合表1结果确定该菌为Rhizobium leguminosarum。 

表 2 MSB1103的16S rDNA的序列比对结果 

菌种NCBI登录号相似度Rhizobium> bv. viciae  strain 3841AM236080.197%Rhizobium> bv. trifolii WSM1325CP001622.197%Rhizobium> bv. trifolii WSM2304CP001191.197%Rhizobium> CIAT 652CP001074.197%Rhizobium> CFN 42CP000133.197%Agrobacterium> K84CP000628.195%Rhizobium> CIAT 899CP004015.196%Sinorhizobium> NGR234CP001389.196%Sinorhizobium> HH103HE616890.196%Agrobacterium> S4 CP000633.196%

以固氮基因nifH的引物（nifH上游引物：CTCAGCGATGGATGGAACGA；nifH下游引物：GTAGATCTCCTGGGCCTTGT）进行PCR扩增，PCR反应体系（总体系25 μL）：DNA 1.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL） 0.3 μL，10×Taq buffer（Mg²⁺ plus） 2.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L） 2.0 μL，引物各1 μL，ddH₂O 17.2 μL。PCR反应条件为：95℃，5 min；94℃，30 s，56℃，30 s，72℃，1 min，共35个循环；72℃，10 min。结果如图4所示该菌含有固氮基因。

  

实施例5、本发明根瘤固氮菌MSB1103的耐碱性

按照实施例1所述，本发明共筛选得到11株固氮菌，将11株固氮菌和市场上获得的花生根瘤菌（秦皇岛领先科技发展有限公司，富思德花生根瘤菌剂）分别接种于不同pH（3， 5， 7， 9，11）值的等量YMA液体培养基中，28℃摇瓶220 rpm培养6-8 h。菌体生长量以OD₆₀₀值表示。每批次每个pH值进行3-5次重复。至少进行3个批次试验。结果如图5所示，本发明所述MSB1103菌株在pH为9的培养基中可正常生长，说明该菌株具较好的耐盐碱性。

  

实施例6、本发明根瘤固氮菌MSB1103的耐高温性

按照实施例1所述，本发明共筛选得到11株固氮菌，将11株固氮菌和市场上获得的花生根瘤菌（秦皇岛领先科技发展有限公司，富思德花生根瘤菌剂）分别接种于等量YMA液体培养基中，分别在不同温度（20℃，25℃，28℃，30℃，37℃，42℃，45℃）条件下摇瓶培养6-8 h。菌体生长量以OD₆₀₀值表示。每批次每个温度进行3-5次重复。至少进行3个批次试验。结果如图6所示，本发明所述MSB1103菌株在45℃时可正常生长，说明该菌株具较好的耐高温特性。

  

实施例7、本发明根瘤固氮菌MSB1103对部分真菌的拮抗鉴定

将本发明根瘤固氮菌MSB1103与真菌（灰霉病菌和瓜果腐霉病菌）进行对峙培养，25℃培养箱静置培养5天。每个菌株设置3-5次重复，至少进行3个批次试验。结果如图7所示，菌株MSB1103可明显抑制灰霉病菌和瓜果腐霉病菌的生长，抑菌率均大于60%。

采用李爱荣等平板对峙法筛选拮抗活性菌株，并测定菌株的抑菌率。 

抑制率=（对照组病原菌的菌落直径 - 实验组病原菌的菌落直径）/ 对照组病原菌的菌落直径×100%。 

  

实施例8、固氮菌菌剂的制备

1、固氮菌菌剂的制备，

将本发明的根瘤固氮菌MSB1103在YMA培养基中培养，所述YMA培养基为甘露醇 10 g，K₂HPO₄ 0.25 g，MgSO₄ 0.2 g，KH₂PO₄ 0.25 g，NaCl 0.1 g，CaCO₃ 3 g，酵母粉 3 g，蒸馏水 1000 mL；培养温度为25-30℃，以200 rpm发酵3 d，待菌液浓度达到1×10⁹个/mL发酵结束，即制得液态的固氮菌菌剂。

2、固氮菌菌剂＋微量元素肥料的复合微生物菌肥 

将上述固氮菌菌剂与微量元素肥料以重量比为1:3进行混合，所述微量元素肥料为碳酸锰锌；

3、固氮菌菌剂＋微量元素肥料＋拮抗微生物的复合微生物菌肥

将上述固氮菌菌剂与微量元素肥料和拮抗微生物混合制得，三者的重量比为3：4：3，所述微量元素肥料选自碳酸锰锌；所述拮抗微生物为武大绿洲生物生产的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilus）。

4、固氮菌菌剂＋微量元素肥料＋有机肥 

将上述固氮菌菌剂与微量元素肥料和有机肥混合制得，三者的重量比为1:3:6；所述微量元素肥料选自碳酸锰锌；所述有机肥为堆肥。

上述复合微生物菌肥的制备是将原料按比例充分搅拌，混合均匀，随后用传送带经粉碎后送入滚筒造粒机，在滚筒内喷射蒸汽使物料加热至20-40℃，通过滚筒不停转动使物料成球状颗粒。将成球颗粒送入烘干滚筒，输入热风烘干。将烘干的成球经冷却、筛分、罐装或袋装成成品。 

本发明一种高效花生根瘤固氮菌株及其应用已经通过具体的实例进行了描述。本领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。 

  

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