一种菊苣叶绿体转化体系的建立方法

摘要

本发明公开了一种安全、环保的菊苣叶绿体转化体系的建立方法，包括如下步骤：（1）菊苣叶片外植体的高频再生体系建立；（2）一种安全、环保的菊苣叶绿体定点整合表达载体的构建；（3）基因枪轰击法转化菊苣外植体，经三轮抗性筛选获得叶绿体转基因株系。本发明采用一种新型的安全选择标记基因

说明书

技术领域

本发明涉及一种安全、环保的菊苣叶绿体遗传转化体系的建立方法，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

1996年，首例转基因农作物产业化应用，之后全球转基因技术研究与产业应用快速发展，与此同时，转基因的沉默现象及标记基因的生物安全性成为人们普遍关心的问题。具体来说，主要包括“基因逃逸”和抗生素标记基因的使用给环境和生物带来的潜在安全性问题两个方面。因此，建立一种全新的植物转基因方式很有必要，不仅外源基因的表达效率高，又不存在潜在的生物安全性问题。

植物叶绿体拥有自身的遗传物质，对植物进行叶绿体转化是以叶绿体基因组为平台进行遗传操作。与核基因组转化相比，叶绿体转化的独特优势（Bock and Warzechr, 2010; Cui C J et al., 2011; Maliga and Bock, 2011）在于：(1)叶绿体基因组的多拷贝性使外源基因可以高效表达；(2)表达载体上的同源片段与受体植物叶绿体基因组相应序列的同源双交换实现外源基因的定点整合，有效避免“顺式失活”、“位置效应”等基因沉默问题；(3)叶绿体基因组的原核特性使外源基因以原核方式表达，可以操纵子形式向叶绿体基因组中同时引入多个外源基因；(4) 叶绿体基因组的母性遗传特性使外源基因不会随花粉飘逸。

叶绿体基因组的高拷贝性是外源基因高效表达的基础，也为转化子的筛选带来很大困难，即易出现已转化的与未被转化的叶绿体组成的“异质体”，难以保证外源基因的稳定遗传，向叶绿体基因组中转入筛选标记基因，通过多轮次抗性筛选，可以淘汰掉野生型的叶绿体，实现外源基因的稳定遗传。叶绿体转化中经常使用的选择标记基因主要是抗生素标记，如壮观霉素基因aadA。抗生素筛选基因转化进入转基因植物基因组，其表达有可能干扰动物及人类肠道的正常菌落，进而产生转基因的食用安全问题；另一方面，虽然绝大多数高等植物的叶绿体基因组呈单亲母性遗传，筛选标记基因不会随花粉飘逸被转移到近缘野生种或者微生物，然而亦有研究表明这种可能性并未完全排除。因此，如能在叶绿体转化中使用安全的非抗生素筛选标记基因，有望使叶绿体转基因植物成为真正安全、环保的转基因植物。

高等植物叶绿体转化于1990年首次在烟草上获得成功，之后有多种外源基因在烟草叶绿体中表达。除模式植物烟草外，还在拟南芥、油菜、棉花、胡萝卜、矮牵牛、大豆、马铃薯、水稻、杨树、甘蓝、莴苣、番茄和小麦中成功进行叶绿体转化。然而，到目前为止，叶绿体转化技术未能像核基因组转化那样自如地用于各类农作物的遗传改良，主要原因有两点：一是大多数植物不能像烟草那样满足叶绿体转化对高频再生的需求，二是大部分农作物的叶绿体基因组序列还不清楚，给外源基因整合位点的选择带来困难。

菊苣（Cichorium intybus L.）是一种多年生草本植物，可作饲用、药用、食用等。当前通过转基因手段对其进行遗传改良的研究均采用传统的核基因组转化方法，转基因的表达效率较低，且均使用抗生素筛选标记。建立安全、环保的菊苣叶绿体转化体系，不仅对于提高菊苣的育种进程及农牧业生产具有重要的意义，也为高等植物的叶绿体转化技术拓宽了受体范围，提高转基因植物的生物安全性。

发明内容

本发明的目的是提供一种安全、环保的菊苣叶绿体转化体系的建立方法，通过该方法获得了表达绿色荧光蛋白的叶绿体转基因菊苣。

本发明实现过程如下：

一种菊苣叶绿体转化体系的建立方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）菊苣叶片外植体的再生体系建立；

菊苣种子经灭菌消毒后接种在MS培养中萌发，以幼苗真叶为外植体，外植体在分化培养基上经器官发生途径直接分化不定芽，不定芽转接到生根培养基中生根；

所述的分化培养基组成为：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖；

所述的生根培养基组成为：1/2 MS+0.2 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖；

（2）菊苣叶绿体定点整合表达载体pJBCM的构建；

菊苣叶绿体定点整合表达载体pJBCM包括菊苣叶绿体基因组的同源重组片段rps12及trnV-16srDNA、PMI筛选标记基因表达盒以及gfp报告基因表达盒，其中两个表达盒同向串联后置于同源重组片段rps12（SEQ ID NO:1）及trnV-16srDNA（SEQ ID NO:2）之间；

（3）基因枪轰击法转化菊苣外植体，经三轮磷酸甘露糖抗性筛选获得叶绿体转基因株系。

上述步骤（2）中，所述的PMI筛选标记基因表达盒由烟草叶绿体启动子prrn（SEQ ID NO:3）、磷酸甘露糖异构酶基因PMI（SEQ ID NO:4）和烟草叶绿体终止子TpsbA-ter（SEQ ID NO:5）组成；所述的gfp报告基因表达盒由水稻叶绿体启动子RpsbA-pro（SEQ ID NO:6）、绿色荧光蛋白基因gfp（SEQ ID NO:7）及水稻叶绿体终止子RpsbA-ter（SEQ ID NO:8）组成。

上述步骤（2）菊苣叶绿体定点整合表达载体pJBCM的构建包括以下步骤：

A、利用PCR方法扩增磷酸甘露糖异构酶基因PMI，并使之置于烟草叶绿体启动子prrn和烟草叶绿体终止子TpsbA-ter调控之下，得到PMI筛选标记基因表达盒；

B、 将绿色荧光蛋白基因gfp置于水稻叶绿体启动子RpsbA-pro及水稻叶绿体终止子RpsbA-ter调控下，得到gfp报告基因表达盒；

C、将上述两个表达盒片段同向串联进菊苣叶绿体同源重组片段rps12及trnV-16srDNA之间。

上述步骤（3）通过以下步骤实现：

A、受体材料预处理

剪取无菌苗叶片，放在渗透培养基上预处理，渗透培养基组成为MS+0.2 mol/L甘露醇+0.2 mo1/L山梨醇；

B、子弹制备

用纯化的pJBCM质粒DNA包裹金粉；

C、基因枪轰击

D、恢复培养

轰击后的叶片转入基本培养基MS中黑暗恢复培养2-3天；

F、筛选培养

第一轮筛选：把恢复培养后的叶片切成小块，分散平铺在筛选培养基1上筛选，每30天更换一次培养基，待有抗性小芽长出，将其剪下转移到筛选培养基2中生根；

第二轮筛选：与第一轮筛选相同，将第一轮筛选获得的抗性植株的叶片剪成小块进行抗性筛选，

第三轮筛选：与第一轮筛选相同，将第二轮筛选获得的抗性植株的叶片剪成小块进行抗性筛选得到抗性植株，

所述的筛选培养基1组成为：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+28 g/L D-甘露糖+2 g/L 蔗糖，所述的筛选培养基2组成为：1/2 MS+28 g/L D-甘露糖+2 g/L 蔗糖。

本发明的优点与积极效果：本发明公开了一种安全、环保的菊苣叶绿体转化体系的建立方法，利用构建的质粒载体进行基因枪轰击菊苣，获得菊苣叶绿体转基因植株，其叶绿体基因组上整合了绿色荧光蛋白基因gfp和磷酸甘露糖异构酶基因PMI表达框，转基因植株具有D-甘露糖抗性和绿色荧光蛋白表达。本发明获得的转基因菊苣与核基因组转化菊苣相比，外源基因定点整合到菊苣叶绿体基因组中，单亲母性遗传，无性状分离，易于检测；外源基因在叶绿体中高效表达；使用安全标记基因取代抗生素标记基因，转基因植株的生物安全性极高，外源基因发生漂移的可能性极低。本发明可以很大程度上增强转基因植株的生物安全性、提高外源基因的表达效率，为菊苣的进一步遗传改良或以菊苣为受体生产动物口服疫苗等建立技术平台。

附图说明

图1为菊苣叶片外植体的高频再生体系；

图2为菊苣叶绿体定点整合表达载体pJBCM的结构图；

图3为菊苣叶绿体定点整合表达载体pJBCM中绿色荧光蛋白基因的原核表达；

图4为菊苣的叶绿体转化流程；

图5为PCR检测外源基因在叶绿体基因组中的整合结果；1：未转基因植株对照；2-12：转基因株系；

图6为Southern杂交检测外源基因在叶绿体基因组中的整合结果；

图7为菊苣叶绿体转基因植株叶片绿色荧光蛋白的激光共聚焦检测结果。

具体实施方式

以下通过实施例进一步描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或者改造都将落入本发明的权利要求范围内。

本发明所用菊苣品种为“普纳”。

（1）菊苣叶片外植体再生体系建立

菊苣种子经常规消毒后在MS培养基上萌发产生无菌苗，取完全伸展的成熟真叶（25-30叶龄）为外植体，将其切成0.5 cm²大小的小块，接种在含有1.5 mg/L 6-BA和0.4 mg/L NAA的最适MS分化培养基中，培养条件：温度为25℃±2℃，光照强度为30-50 μ mol·m^-2·s^-1，光照时间16 h，培养30天，外植体经器官发生途径直接分化不定芽（图1），待不定芽长到2厘米左右，将其转接到含有0.2 mg/L NAA的1/2 MS培养基中生根。

（2）菊苣叶绿体定点整合表达载体pJBCM的构建  

依据叶绿体进化的保守性，根据烟草、拟南芥的叶绿体基因组全序列资料，设计引物P1：5’-GCTCTATTTGCCTCTGCCATTCT-3’；P2：5’-GTATGGCTGACCGGCGATTACTA-3’，以菊苣叶绿体基因组DNA为模板，用高保真的DNA聚合酶进行PCR扩增，获得4751bp的rps7-rps12-trnV-16S r DNA片段。通过序列分析，选取rps12与trnV基因间隔区作为外源基因的整合位点，以上述测序片段为模版，以引物P3（5’-ATCGAATTCTTGAACACTTTCCGTTT-3’，引入EcoRⅠ）和P4（5’ -CGTAAGCTTGACACTATTCTTGAACAACT-3’，引入HindⅢ位点）扩增1588 bp的rps12与trnV基因间隔区作为左侧同源片段（SEQ ID NO:1），以引物P5（5’- CGCAAGCTTTTGCCTTAGGATTAGTCA-3’，引入HindⅢ）和P6（5’ - TATCTGCAGTGAGGACGGGTTTTTGG-3’，引入PstⅠ位点）扩增1590 bp的trnV-16S r DNA基因片段作为右侧同源片段（SEQ ID NO:2），扩增产物分别用EcoRⅠ/HindⅢ及HindⅢ/PstⅠ双酶切，然后用PstⅠ/EcoRⅠ双酶切去除HindⅢ切点的载体pUC119，之后与两叶绿体同源片段连接，得到菊苣叶绿体同源片段载体pJLR(约6.3 kb)。

提取大肠杆菌DH5α基因组DNA作模版，以引物P7（5’- TAGCTGCAG ATGCAAAAACTCATTAACTC-3’）和P8（5’- CAGGTCGACTTACAGCTTGTTGTAAACAC-3’）扩增磷酸甘露糖异构酶基因PMI（SEQ ID NO:4），以PMI基因替换载体pARpt（王玉华等，phaC和phaG基因在烟草叶绿体中的转化及其遗传分析. 作物学报, 2009, 35(11): 1949-1957）中的抗生素标记基因 aadA；同时将绿色荧光蛋白基因gfp插入载体的BamHⅠ和XbaⅠ位点之间，使其置于水稻叶绿体启动子RpsbA-pro及终止子RpsbA-ter调控下，得到PMI和gfp基因的同向串联表达盒。

将上述两基因表达盒片段以HindⅢ粘性末端克隆进载体pJLR的HindⅢ位点，得到最终的菊苣叶绿体转化的表达载体pJBCM（图2）。pJBCM转化大肠杆菌DH5α，细菌培养物在长波紫外线的照射下，发出明亮的绿色荧光（图3）。

（3）安全、环保的菊苣叶绿体转化植株的获得

 基因枪轰击

取25-30天叶龄的菊苣无菌苗叶片，将其切成0.5 cm²大小的小块，集中平铺在含有渗透培养基（MS+0.2 mol/L甘露醇+0.2 mo1/L山梨醇）的培养皿的中央，密集铺成直径3厘米的圆，渗透处理4 h。然后，用纯化后的浓度为1μg/μL的pJBCM质粒DNA包裹直径1.0 μm的金粉颗粒，制成微粒弹并均匀的铺在载体膜的中央。打开基因枪电源，将1100 psi的可裂膜、沾有微粒弹的载体膜安装到基因枪内，并固定好，之后把承载有受体材料菊苣叶片的培养皿放入基因枪中，使叶片与微粒弹的距离为9cm，关上基因枪闭气门，打开真空泵，在真空度为27厘米水银柱Hg条件下轰击。轰击后的叶片于25℃继续渗透处理3 h，之后转入基本培养基MS，黑暗恢复培养2-3天。

 筛选

在无菌条件下，把恢复培养后的叶片切成小块，分散平铺在筛选培养基1（MS+1.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+28 g/L D-甘露糖+2 g/L 蔗糖）上筛选，每30天左右更换一次培养基。待有抗性小芽长出，将其剪下转移到筛选培养基2（1/2 MS+NAA 0.2 mg/L +28 g/L D-甘露糖+2 g/L 蔗糖）中生根，15-20天后生根，之后进入第二轮抗性筛选培养。具体操作是将第一轮筛选获得的抗性植株的叶片剪成小块，在筛选培养基1上以第一轮筛选的方法进行筛选，直至得到抗性植株；第三轮筛选方法和第二轮相同（图4）。

 抗性植株的分子检测

PCR检测：为了验证外源基因是否整合进菊苣叶绿体基因组，以常规CTAB法提取抗性植株的基因组总DNA，对转基因植株进行PCR分析。PCR的上游引物P9（5’-TTGAGCGAAGGGTACGAAATA-3’）设在菊苣叶绿体同源片段rps12上，下游引物P10（5’-CAGTTCCGGAATATCAATGT-3’）设在PMI上，未转化植株和细胞核转化的抗性植株因没有上游引物的结合位点，均应该没有扩增产物，而一旦外源基因整合进入叶绿体基因组，应扩增出2.27 kb的DNA条带（图5）。

Southern杂交：以载体pJBCM质粒DNA为模板，用引物P7和P8扩增1.2kb的PMI序列作为杂交探针，用EcoRⅠ酶切菊苣抗性株系基因组DNA，1.0%的琼脂糖凝胶5V/cm电泳8个小时后转膜。参照Roch的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ试剂盒进行探针标记和杂交操作，杂交结果如图6所示。

 菊苣叶绿体转基因植株叶片绿色荧光蛋白的检测

取转基因菊苣叶片先在荧光显微镜下观察，之后选取较好的视野范围置激光扫描共聚焦显微镜下, 568 nm的激发光激发, TRITC滤光器收集叶绿素红色荧光, 488 nm的激发光激发, FITC滤光器收集GFP绿色荧光，之后进行图像叠加，可以看到很多黄绿色的叶绿体整齐排列在保卫细胞膜内侧（图7）。

<110> 西北大学

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<212> DNA

<213>菊苣（Cichorium intybus）

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<301>王玉华,韩晓玲,黄丛林,贾敬芬

<302>菊苣叶绿体同源片段的克隆及多顺反子定点整合表达载体的构建

<303>华北农学报

<304> 25

<305> ISSN 1000-7091

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cacggccgtt tagcgcgtgt ttacaacaag ctgtaa 1176

<210> 5

<211> 396

<212> DNA

<213> 烟草（Nicotianna tabacum）

<300>　

<301>Bally J, Nadai M, Vitel M, Rolland A, Dumain R, Dubald M

<302> Plant physiological adaptations to the massive foreign protein synthesis occurring in recombinant chloroplasts

<303> Plant Physiology

<304>150

<305>ISSN 0032-0889

<306>1474-1481

<307>2009-05-20

<400> 5

gatcctggcc tagtctatag gaggttttga aaagaaagga gcaataatca ttttcttgtt 60

ctatcaagag ggtgctattg ctcctttctt tttttctttt tatttattta ctagtatttt 120

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<210> 6

<211> 472

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<300>　

<301>Hiratsuka J, Shimada H, Whittier R, Ishibashi T, Sakamoto M, Mori M, Kondo C, Honji Y, Sun C R, Meng B Y, Li Y Q, Kanno A, Nishizawa Y, Hirai A, Shinozaki K and Sugiura M

<302>The complete sequence of the rice (Oryza sativa) chloroplast genome: intermolecular recombination between distinct tRNA genes accounts for a major plastid DNA inversion during the evolution of the cereals

<303>Molecular Genetics and Genomics

<304>217

<305>ISSN 0026-8925

<306>185-194

<307>1989-06-18

<400> 6

actttcacag tttccattct gaaatgttct ctgtactata ataaatagta agtgaatcaa 60

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<210> 7

<211> 717

<212> DNA

<213> 水母（Aequorea victoria）

<300>　

<301>Jeong S W, Jeong W J, Woo J W, Choi D W, Park Y I, Liu J R

<302>Dicistronic expression of the green fluorescent protein and antibiotic resistance genes in the plastid for selection and tracking of plastid transformed cells in tobacco

<303> Plant Cell Reports

<304> 22

<305> 0721-7714

<306>747-751

<307>2004-01-21

<400> 7

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cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaataa 717

<210> 8

<211> 375

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<300>　

<301>Hiratsuka J, Shimada H, Whittier R, Ishibashi T, Sakamoto M, Mori M, Kondo C, Honji Y, Sun C R, Meng B Y, Li Y Q, Kanno A, Nishizawa Y, Hirai A, Shinozaki K and Sugiura M

<302>The complete sequence of the rice (Oryza sativa) chloroplast genome: intermolecular recombination between distinct tRNA genes accounts for a major plastid DNA inversion during the evolution of the cereals

<303>Molecular Genetics and Genomics

<304>217

<305>ISSN 0026-8925

<306>185-194

<307>1989-06-18

<400> 8

ggcttttctg ctaacatata gcaatttttg aagaaaggaa agctagaaat acccaatatc 60

ttgctgaagc aagatattgg gtatttcttt ttttttttat tttgaatctt tctattctga 120

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agttggtacg aattccccca atttgcgacc taccatagga tttgttatgt aaataggtat 240

atgttccttt ccattatgaa tcgcgattgt atggccaacc attgcgggta gaatgctaga 300

tgcccgggac cacgttacta ttgtttcttt ctcctccttc atattgacct tttctatttt 360

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