一株同步代谢硫化物和硝酸盐的兼性化能异养细菌

摘要

一株同步代谢硫化物和硝酸盐的兼性化能异养细菌，涉及一株化能异养细菌。本发明提供了一株同步代谢硫化物和硝酸盐的兼性化能异养细菌，具有可同时代谢有机物、硫化物和硝酸盐的能力。一株同步代谢硫化物和硝酸盐的兼性化能异养细菌属于假单胞菌X2（Pseudomonas sp.X2），保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏日期为2013年8月5日，保藏号为CCTCC NO：M 2013362。本发明的假单胞菌X2能够同时代谢有机物、硫化物和硝酸盐的作用，应用在污水处理系统中可替代多种细菌联合代谢作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一株化能异养细菌。

背景技术

许多工业行业在生产过程中大量使用含有硫、氮的有机原料，导致产生了大量含有硫 氮的有机废水，同时加上人们日常生活中排放的生活污水也产生了大量的含氮污染物，这 些污水如果未经处理，直接排放到自然环境中，会对其产生诸多方面的危害，而生物处理 技术具有运行成本低，无二次污染等优点，在世界上受到广泛应用。

国内外处理含硫、含氮废水的方法过程中，通常利用多种细菌的联合代谢作用。即利 用异养反硝化细菌，以有机物作为电子供体，硝酸根作为电子受体进行氧化还原反应。在 此过程中同时去除有机物和硝酸盐。利用自养脱硫反硝化细菌，以硫化物作为电子供体， 硝酸根作为电子受体进行氧化还原反应。在此过程中同时去除硫化物和硝酸盐。但是此处 理方法依靠多种微生物协同作用，代谢过程复杂，微生物群落稳定性差，耐冲击性差，污 水处理装置稳定运行非常困难。

发明内容

本发明提供了一株化能异养细菌，具有可同时代谢有机物、硫化物和硝酸盐的能力。

本发明是一株同步代谢硫化物和硝酸盐的兼性化能异养细菌，它为Pseudomonas  sp.X2，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是湖北省武汉市武昌珞珈山， 保藏日期为2013年8月5日，保藏号为CCTCC NO：M2013362。

本发明的Pseudomonas sp.X2（假单胞菌X2）为革兰氏阴性菌，呈杆状，长为1.0～1.5 μm，宽为0.5～1.0μm，无芽孢，单级鞭毛，生长温度范围为10℃～40℃，生长pH值范围 为7～10；在LB固体培养基上菌落呈圆形突起，边缘规则，四周透明无色，中心呈黄色， 菌落直径为1mm～2mm。

本发明的Pseudomonas sp.X2（假单胞菌X2）可利用酵母粉、淀粉或乙酸等作为碳源 及利用硝酸根、铵离子作为氮源生长。

本发明的Pseudomonas sp.X2（假单胞菌X2）接触酶阳性，氧化酶阳性，反硝化反应 阳性，硫化氢产生反应阴性。

本发明的Pseudomonas sp.X2通过16S rDNA基因序列比对分析，与假单胞菌属 （Pseudomonas）的16SrDNA序列的同源性最高，相似性为95%，通过结合菌体形态特 征、生长条件、生理生化鉴定结果确定假单胞菌X2属于假单胞菌属（Pseudomonas），为 Pseudomonas sp.X2（假单胞菌X2）菌株。

本发明Pseudomonas sp.X2（假单胞菌X2）能够快速代谢有机物、硫化物和硝酸盐， Pseudomonas sp.X2（假单胞菌X2）能够在有氧条件下以有机物作为底物进行呼吸获得能 量并生长；在无氧条件下以有机物和硫化物作为底物，以硝酸根作为电子受体进行呼吸获 得能量并生长。生长环境和条件广泛，有利于保持生物量。

本发明的Pseudomonas sp.X2（假单胞菌X2）应用在污水处理系统中能够同时代谢有 机物、硫化物和硝酸盐，能够在6h内代谢61.8%的有机碳，32.1%的硫化物和57.1%的硝 酸盐，在12h内代谢73%的有机碳，83%的硫化物和99%的硝酸盐，与现有污水处理系统 中多种细菌联合代谢作用相比，简化了代谢过程的复杂性，本发明的Pseudomonas sp.X2 （假单胞菌X2）对于含硫含氮废水具有实际应用价值；在微生物群落稳定性和耐冲击性 方面，本发明的Pseudomonas sp.X2（假单胞菌X2）成为优势菌群后使微生物群落稳定性 和耐冲击性较现有污水处理系统中多种细菌的高20%。

本发明的Pseudomonas sp.X2（假单胞菌X2）在污水处理系统中经过活性污泥定向驯 化，Pseudomonas sp.X2（假单胞菌X2）成为优势菌群，它具有同时代谢有机物、硫化物 和硝酸盐的能力，所以使污水处理系统运行参数简单，系统更加稳定，经高负荷污水冲击 后系统更容易恢复，具有更好的应用前景。

本发明的Pseudomonas sp.X2属于假单胞菌属（Pseudomonas），保藏于中国典型培养 物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏日期为2013年8月5 日，保藏号为CCTCC NO：M2013362。

附图说明

图1是本发明假单胞菌X2的扫描电子显微镜图像，放大倍数为25000倍；

图2为通过假单胞菌X2和相近菌株的16S rDNA基因序列进行同源性比对构建的系 统发育树图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意 组合。

具体实施方式一：本实施方式一株同步代谢硫化物和硝酸盐的兼性化能异养细菌，它 为Pseudomonas sp.X2，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是湖北省武 汉市武昌珞珈山，保藏日期为2013年8月5日，保藏号为CCTCC NO：M2013362。

本实施方式的Pseudomonas sp.X2（假单胞菌X2）为革兰氏阴性菌，呈杆状，长为 1.0～1.5μm，宽为0.5～1.0μm，无芽孢，单级鞭毛，生长温度范围为10℃～40℃，生长pH 值范围为7～10；在LB固体培养基上菌落呈圆形突起，边缘规则，四周透明无色，中心 呈黄色，菌落直径为1mm～2mm。

参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对Pseudomonas sp.X2 （假单胞菌X2）进行生理生化鉴定：接触酶阳性，氧化酶阳性，反硝化反应阳性，硫化 氢产生反应阴性。

本实施方式的Pseudomonas sp.X2（假单胞菌X2）能够快速代谢有机物、硫化物和硝 酸盐，假单胞菌X2能够在有氧条件下以有机物作为底物进行呼吸获得能量并生长；在无 氧条件下以有机物和硫化物作为底物，以硝酸根作为电子受体进行呼吸获得能量并生长。 生长环境和条件广泛，有利于保持生物量。

本实施方式的Pseudomonas sp.X2（假单胞菌X2）应用在污水处理系统中能够同时代 谢有机物、硫化物和硝酸盐，与现有污水处理系统中多种细菌联合代谢作用相比，简化了 代谢过程的复杂性；在微生物群落稳定性和耐冲击性方面，本发明的假单胞菌X2成为优 势菌群后使微生物群落稳定性和耐冲击性较现有污水处理系统中多种细菌的高20%。

本实施方式的Pseudomonas sp.X2（假单胞菌X2）在污水处理系统中经过活性污泥定 向驯化，假单胞菌X2成为优势菌群，具有同时代谢有机物、硫化物和硝酸盐的能力，所 以是污水处理系统运行参数简单，系统更加稳定，经高负荷污水冲击后，系统更容易恢复， 具有更好的应用前景。

本实施方式的Pseudomonas sp.X2（假单胞菌X2）的最适生长温度：30℃，最适生长 pH：7～8

具体实施方式二：本实施方式的假单胞菌X2由活性污泥中筛选得到。筛选按以下步 骤进行：

（1）菌悬液的制备：将从污水处理厂二次沉淀池中取出去的100mL活性污泥放入厌 氧瓶中，再向厌氧瓶中加入液体培养基，在30℃的条件下，以120r/min预培养48h，得 到菌悬液；

其中所述的液体培养基是按每1L液体培养基中含有0.75g Na₂S，1g KNO₃，1g  CH₃COONa，1g NH₄Cl，1.5g KH₂PO₄，3g Na₂HPO₄，0.1g MgSO₄；

（2）菌悬液梯度稀释：在无菌操作条件下，取步骤（1）得到的菌悬液1mL加入到 含有9mL无菌水的厌氧管中制成菌悬液的浓度为10^-1，再以同样的方法进行10倍的梯度 稀释，直至稀释液的浓度为10^-8为止；

（3）静止恒温培养：在无菌操作条件下，将步骤（2）中得到每一个稀释倍数的菌悬 液各取出1ml，分别放入含有固体培养基的厌氧管中，使菌悬液挂壁到厌氧管内壁的固体 培养基上，去除厌氧管中剩余的菌悬液后，得到含有菌悬液挂壁的厌氧管，将含有菌悬液 挂壁的厌氧瓶放入培养箱，在30℃的条件下静止恒温培养72-96h，得到单菌落，观察单 菌落的大小和其特征形态；

其中所述的含有固体培养基的厌氧管，是按如下制备的：排出厌氧管中的空气，在每 支厌氧管中加入7ml凝固前的琼脂固体培养基，盖紧橡胶胶塞，在温度为121℃的条件下 灭菌15min，采用亨盖特厌氧滚管方法制备含有固体培养基的厌氧管；

其中所述的琼脂固体培养基是由步骤（1）所述的液体培养基和琼脂配制而成，其中 琼脂与液体培养基的质量体积比为15g：1L;

（4）摇动恒温培养：在无菌操作条件下，将步骤（3）中得到的单菌落用接种针接入 到已灭菌的液体培养基中，在恒温空气浴摇床中，在温度为30℃、摇床转速为120r/min 的条件下进行培养；

（5）重复培养：在无菌操作条件下，取步骤（4）得到的OD600值为1～1.5菌悬液 1mL加入到含有9mL无菌水的厌氧管中制成菌悬液的浓度为10^-1，再以同样的方法进行 10倍的梯度稀释，直至稀释液的浓度为10^-8为止，再重复步骤（3）和步骤（4），直至琼 脂固体培养基上生长的所有单菌落的形态特征为：呈圆形突起，边缘规则，四周透明无色， 中心呈黄色，即得假单胞菌X2。

对筛选得到的假单胞菌X2进行分子鉴定，按以下步骤进行：

（1）利用细菌基因组提取试剂盒提取假单胞菌X2纯培养的总DNA，采用细菌16S rDNA通用引物F27、R1492，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后利用胶回收试 剂盒（购买自天根生化科技有限公司）回收纯化PCR产物，之后进行克隆、转化，筛选 阳性克隆子菌落，经扩大培养后委托华大基因公司测序。

假单胞菌X2的16S rRNA基因序列长度为1411bp，其序列提交至GenBank，以确定 菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与假单胞菌属（Pseudomonas）的16S rDNA 序列的同源性最高，相似性为95%，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定 结果确定假单胞菌X2属于假单胞菌属（Pseudomonas），为Pseudomonas sp.X2（假单胞 菌X2）菌株。

PCR引物购买自华大基因公司，其他试剂购自宝生物工程有限公司。

对本实施方式的Pseudomonas sp.X2（假单胞菌X2）进行功能验证：

Pseudomonas sp.X2（假单胞菌X2）代谢有机物、硫化物和硝酸盐的功效检测，具体 方法如下：

①用蒸馏水配制功效检测培养基，所述的功效检测培养基是按每1L功效检测培养基 中含有0.75g Na₂S，1g KNO₃，1g CH₃COONa，1g NH₄Cl，1.5g KH₂PO₄，3g Na₂HPO₄， 0.1g MgSO₄；

②取步骤①配置的功效检测培养基200mL放入厌氧瓶中，将厌氧瓶中的氧气排空后， 在121℃，15min条件下将含功效检测培养基的厌氧瓶进行灭菌，得到灭菌后的含功效检 测培养基的厌氧瓶；

③将培养到OD600值为1～1.5的菌悬液5mL加入到步骤②得到的含功效检测培养基 的厌氧瓶中，再将其在30℃，120r/min条件下培养，在培养0h、6h和12h后，用Dionex  ICS-3000型离子色谱仪测定Pseudomonas sp.X2（假单胞菌X2）所生长的培养基中有机 物、硫化物和硝酸盐的变化，其中Dionex ICS-3000型离子色谱仪的工作参数为：采用 IonPac AG4A AS4A-SC4mm分析柱，淋洗液成分为1.8mmol/L Na₂CO₃、1.7 mmol/LNaHCO₃，流速为1cm³/min；得到表1：

表1为培养0h、6h和12h后Pseudomonas sp.X2（假单胞菌X2）菌所生长的培养基 中有机物、硫化物和硝酸盐的变化

注：单位（mg/L）

由表1可以看出：假单胞菌X2（Pseudomonas sp.X2）能够在12h内代谢73%的有机 碳，83%的硫化物和99%的硝酸盐，对于含硫含氮废水具有实际应用价值。