海洋芽孢杆菌S-1及其产的抗肿瘤活性多肽

摘要

本发明涉及一种海洋芽孢杆菌S-1及其产的抗肿瘤活性多肽。该海洋芽孢杆菌S-1是从南海海域的海泥中培养分离、筛选得到一株产抗肿瘤活性多肽的海洋芽孢杆菌属（Bacillus sp.）的海洋微生物细菌菌株,该菌株S-1为好氧菌,有较好的耐盐性，在7w/v%NaCl培养液中生长良好；生长pH范围为5.0-9.0；生长温度范围较宽，在15-37℃环境下也可良好生长;菌株S-1的16S rDNA的基因序列如图所示。该海洋芽孢杆菌S-1产的多肽具有抗肿瘤活性,有望成为治疗肝癌的抗肿瘤药物。

说明书

技术领域

本发明涉及海洋微生物及药物领域，特别是涉及一海洋芽孢杆菌S-1（芽孢杆菌S-1）及其产的抗肿瘤活性多肽。 

背景技术

当今社会，恶性肿瘤严重威胁着人类的生命和健康，是人类社会的第一杀手。临床上恶性肿瘤治疗手段多采用综合疗法，以手术切除、放疗、化疗和免疫治疗相结合。目前市场上的治疗癌症相关的药物尽管对大部分癌症有一定疗效，但仍存在着特异性差、疗效不显著和毒副作用明显等问题。因此，寻找高效、低毒、特异性强的抗肿瘤药物仍是生物医学科研领域的重大课题与长期任务。 

微生物界蕴含着极多的天然产物资源，而海洋微生物占到了全部总量的70%，这也成为新药开发的巨大资源。自上世纪60年代起，从海洋寻找天然活性物质成为一大热点。海洋环境有着特殊的生态条件，比如低温、高压、高盐、无光等特殊条件，形成了海洋微生物的复杂性和多样性以及独特的特殊特性等特点，这也使得海洋活性物质的研究充满着活力和潜力,也是当今世界各国从海洋微生物开发新药的中心之一。 

目前，已经从多种海洋微生物的代谢产物中分离出许多具有开发价值的抗肿瘤化合物。尽管如此，海洋微生物抗肿瘤药物的数量仍然是无法与陆生来源的抗肿瘤药物相比。因此，新的抗肿瘤药物的研发仍然需要寻找更多海洋微生物来源的具有生物活性的代谢产物。 

发明内容

本发明的目的在于经发明人长期开发研究海洋微生物和海洋微生物抗肿瘤药物及其生产实践,开发提供一株（种）海洋芽孢杆菌S-1及其产的抗肿瘤活性多肽。 

本发明提供产抗肿瘤活性多肽的海洋芽孢杆菌S-1（芽孢杆菌S-1）是从南海海域的海泥中培养、分离、筛选得到一株（种）产具有抗肿瘤活性多肽（或称海洋芽孢杆菌S-1多肽）的海洋芽孢杆菌属（Bacillus sp.）的海洋微生物细菌菌株,将其命名为海洋芽孢杆菌S-1（芽孢杆菌菌株S-1（或简称菌株S-1)。对菌株S-1的16S rDNA的基因序列同源性系统发育树分析,PCR产物测序结果显示菌株S-1的16S rDNA的基因序列如图1以及16S rDNA的序列基因长度为1466bp。应用Blast程序进行分析,通过MEGA4.1软件Neighbor-joining绘制发育树如图2，确定菌株S-1为芽孢杆菌属 （Bacillus sp.）的细菌菌株。该海洋芽孢杆菌S-1于2011年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏号为CCTCC NO：M2011067。 

本发明提供的海洋芽孢杆菌S-1形态特征与生理生化特征为： 

该菌株S-1为好氧菌,有较好的耐盐性，在7w/v%NaCl培养液中生长良好；生长pH范围为5.0-9.0；生长温度范围较宽，在15℃-37℃环境下也可良好生长;其它形态特征与生理生化特征如表1。 

表1 

注：“+”为反应阳性，“-”为反应阴性。 

本发明提供产具有抗肿瘤活性多肽的海洋芽孢杆菌S-1菌株的鉴定： 

1、菌株的筛选分离 

1）菌株的分离 

从南海海域的海泥中培养、筛选、分离得到的单个细菌菌株（或简称菌株），-80℃冰箱甘油保种。随机吸取出100μL甘油保种的菌株，接种于30ml的种子（活化）培养基，于30℃、200r/min的摇床里恒温培养24h，所述种子培养基:10g/L蛋白胨,3g/L葡萄糖,5g/L NaCl，pH=7.0，121℃灭菌30min。 

2)菌株的发酵培养 

将种子发酵液按照4v/v%接种量接种于300mL发酵培养基中，相同条件下继续培养36h，得菌株（种）发酵液。所述发酵培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，3g/L葡萄糖,氯化钠5g/L，1mol/L NaOH调pH值为7.0，121℃灭菌30min。 

3）代谢产物的制备 

取菌株发酵液，在10000r/min离心20min，去除发酵液中的菌体和杂质。上清液加入与发酵液等体积的水饱和正丁醇萃取发酵液，每次萃取6h，收集上层有机相。 然后用旋转蒸发仪在80℃减压蒸干。减压蒸干的样品经重溶、离心、冻干后，得到具有抗肿瘤活性的粗提物。 

4）MTT法检测代谢产物抗肿瘤活性 

（1)取对数生长期的癌细胞，用吸管吸出残余的培养液，再用2mL RPMI1640（特级胎牛血清）洗三遍，去掉贴壁状态不好的细胞和死细胞。加入1.0mL胰酶（含EDTA）消化3分钟，显微镜下观察，发现80%细胞变圆皱缩就停止反应，吸出胰酶。消化后的细胞加入RPMI1640培养液用吸管吹打成单细胞悬液。 

（2)细胞计数，将细胞悬液调成5×104/mL左右。 

（3)将细胞悬液加入到96孔板中，每孔加180μL，空白对照组只加RPMI1640培养液，在37℃恒温CO2培养箱培养18-24h。 

（4)样品组每孔加入样品20μL，样品在加入前用0.22um的滤膜过滤，每组设置四个平行孔。 

（5)加好样的平板继续在CO2培养箱培养48h后，取出平板，每个样品孔加20μLMTT（微孔滤膜）(5mg/ml)，再在CO2培养箱培养，继续培养4h（若药物与MTT反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS（磷酸缓冲液）冲2-3遍后，再加MTT）。 

（6)终止培养反应，用移液枪吸去孔内培养液，用RPMI1640培养基清洗2遍，再在每孔加入150μL DMSO（胰蛋白酶），摇床上低速震荡10min，使结晶物甲瓒（formazan）充分溶解。 

（7)最后用酶标仪在OD570nm下测量吸光值。实验重复3次，数据以均值±SD表示，并用统计学上方差分析的方法对标准差进行计算。 

5）菌株代谢产物抗瘤谱的测定 

选择不同的几株肿瘤细胞系（人肝癌细胞BEL-7402、结肠腺癌细胞RKO、非小细胞肺癌细胞A549、胶质瘤细胞U251、乳腺癌细胞MCF-7），用MTT比色法检测提取组分的抗肿瘤活性（方法同上4）），最后用酶标仪测量吸光值，观察对每种肿瘤细胞的抑制活性。细胞抑制率=［(A对照－A样品)/A对照］×100%。采用Excel分析软件计算半数抑制浓度IC50。其中，菌株S-1的代谢产物对以上肿瘤细胞系均有增殖抑制作用。菌株S-1代谢产物对5种肿瘤细胞的抑制作用如下表2,为菌株S-1代谢产物对不同肿瘤抑制率(%)的测定(n=3,χ=S)。 

表2 

2、生理生化特性的测定: 

1）革兰氏染色 

取菌株S-1的菌液制成涂片，干燥后固定，要求每个菌种各制一片。再用草酸铵结晶紫染色1min，用蒸馏水清洗染料。加碘液覆盖1min，用水冲洗，吸水纸吸去多余水分。用95wt%乙醇脱色20s，立即用水洗净并用滤纸吸干。蕃红染色液复燃1min，水洗、吸干后镜检。 

2）氧化酶 

直接滴加1wt％盐酸四甲基对苯二胺于菌落上，若在10s内观察到试剂显紫色，为阳性，反之为阴性。 

3）V-P实验 

将各菌株接种到V.P培养基中，分别做好标记。在30℃的条件下培养24小时。然后往试管中加入约3ml的10M氢氧化钠，振荡试管，再加入1ml6wt%的α-萘酚试剂，振荡30min后观察颜色的变化。若培养基呈红色，则为阳性；不呈红色，则为阴性。 

4）硝酸盐还原 

被检菌接种于硝酸盐培养基中，于35℃培养2天。然后将革里斯试剂A液和B液等量混合后（约0.1m1）加入培养基内，立即观察结果。如果溶液变红则为阳性；如果不变色再加入少许锌片，如果变蓝，说明为阴性;如果不变色，则为假阴性。 

5）柠檬酸盐利用 

可以直接观察斜面，变蓝色为阳性，不变色为阴性。 

6）硫化氢实验 

直接观察培养基，变黑色为阳性，不变色为阴性。 

7）吲哚实验 

将乙醚加入试管中，振荡后加入几滴吲哚试剂，液面出现红色为阳性，不变色为阴性。 

8）水解明胶 

将菌种通过穿刺法接种到明胶培养基中，30℃培养2天，观察结果前放入冰箱30min左右。明胶呈现液态为阳性，否则为阴性。 

9）碳源利用 

将菌株接种于基础培养基上，再分别点上葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇等碳源，如果菌株在加碳源处可以生长，表明菌株能利用此碳源，为阳性；不能利用为阴性。上述菌株S-1表型特征于表1。 

菌株S-1为好氧菌,有较好的耐盐性，在7w/v%NaCl培养液中生长良好；生长pH范围为5.0-9.0；生长温度范围较宽，在15℃-37℃环境下也可良好生长,其它生理生化特征见表1。 

根据菌株的生理生化特征指标，参考《伯杰细菌鉴定手册（第九版）》手册，结合16S rDNA序列分析结果，确定菌株S-1为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。 

3、菌株基因组DNA的提取 

菌株基因组DNA提取采用Invitrogen Genomic DNA mini Kit，其方法如下： 

1）将水浴锅的温度分别设定为55℃和37℃。 

2）取200μL溶菌酶缓冲液，加入新鲜的溶菌酶，使最终溶菌酶浓度为20mg/ml。 

3）通过离心收集2×109革兰氏阳性细胞，用180μl包含溶菌酶的缓冲液重悬细胞，涡旋振荡，37℃培养30min。 

4）加入20μL蛋白酶，涡旋振荡。再加入200μL PureLink?基因组裂解/结合缓冲液，涡旋混合均匀，55℃培养30min。 

5）加入200μL96-100wt%乙醇溶液于溶菌液中，涡旋混合均匀。 

6）将吸附柱放入收集管中，向其中加入640μL的溶菌液，室温下10000×g离心1min。 

7）弃掉收集管，将吸附柱放入新的收集管中，加入500μL洗脱缓冲液1，室温下10000×g离心1min。 

8）弃掉收集管，将吸附柱放入新的收集管中，加入500μL洗脱缓冲液2，室温下最大转速离心3min。 

9）将吸附柱放入1.5μL的离心管中，加入25-200μL基因组洗脱缓冲液，室温下等待1min后，再以最大速度离心1min。 

10）收集管中纯化后的DNA，-20℃下储存。 

4、16S rDNA引物设计 

采用16S rDNA通用引物(由上海生工合成)。 

正向引物27F：5＇-AGAGTTTGAT CCTGGCTCA-3＇； 

反向引物1492R：5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇； 

5、菌株16S rDNA的扩增 

16S rDNA序列的PCR扩增体系：以菌株提取的基因组DNA为模版，加入2μL引物；0.25μL Taq DNA聚合酶（5U·mL-1）；5μL10xPCR反应缓冲液；4μL dNTPMasterMix；ddH20（二次蒸馏的纯化水）补足至50μL。 

PCR反应条件：95℃预变性4min；30个循环（94℃30s，55℃40s，72℃90s）；72℃终延伸10min。 

6、琼脂糖电泳检测PCR产物 

用1.5wt%的琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，以D2000Marker为标准分子量对照试剂。若发现在Marker1.5kb左右有一条单带，证明16S rDNA序列成功扩增。PCR产物送北京华大基因测序,得到结果如图1。 

7、16S rDNA序列的测定和系统发育树分析 

用BioEdit软件进行多序列比对，采用MEGA4.1软件的邻接法（Neighbor-joining Method）绘制系统发育树如图2。 

对菌株S-1的16S rDNA的基因序列同源性系统发育树分析,PCR产物测序结果显示菌株S-1的16S rDNA的基因序列如图1以及16S rDNA的序列基因长度为1466bp。应用Blast程序进行分析,通过MEGA4.1软件Neighbor-joining绘制发育树如图2，确定菌株S-1为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）的细菌。 

通过《常见细菌系统鉴定手册》，可以确定菌株S-1为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）的细菌。 

对菌株S-1的16S rDNA基因序列PCR产物经电泳检测菌株S-1大小约为1.5kb的一条单带（如图3）。 

本发明提供的海洋芽孢杆菌S-1菌株的发酵培养及其代谢产物抗肿瘤活性多肽SBP： 

1、种子培养 

将从-80℃冰箱中吸取出100μL甘油保种的菌株（从南海海域的海泥中培养、筛选、分离得到的细菌菌株-海洋芽孢杆菌S-1或简称菌株S-1），接种于30ml的种子（活化）培养基，于30℃、200r/min的摇床里恒温培养24h。所述种子培养基:10g/L蛋白胨,3g/L葡萄糖,5g/L NaCl，pH=7.0，121℃灭菌30min。 

2、发酵培养 

接种18-25h种龄的种子4-8(V/V)%，20-30℃、150-300r/min的条件下在旋转摇床中培养30-40h。所述发酵培养基：蛋白胨8-12g/L，酵母提取物3-6g/L，3-5g/L 葡萄糖,氯化钠3-7g/L，1mol/L NaOH调pH值为6.5-7.5，121℃灭菌30min。 

3、抗肿瘤多肽粗提物的制备 

1）取一定量的芽孢杆菌S-1菌株的发酵液，用适量的缓冲液溶解于0-25,优选为4℃、8000-12000,优选为10000rpm离心15-30优选为20min，去除泥沙杂质及不溶性物质，收集上清液。 

2）在通风橱内，上清液加入与发酵液等体积的水饱和正丁醇,并将整个萃取体系保持在摇床上，用70-100,优选为80rmp/min反复萃取发酵液，每次萃取4-8h，收集上层有机相。然后用旋转蒸发仪在55-85℃,优选80℃减压蒸干。 

3）取下蒸发瓶，用缓冲液将旋转蒸发仪瓶子中的样品全部溶解，于0-25,优选为4℃、7000-12000,优选为10000rpm离心15-30,优选为20min，去除不溶解的物质，保留上清液, 

上清液采用BCA法测定蛋白浓度后，MTT试验检测组份活性，再将活性置于-20℃保存减压蒸干的样品经重溶、离心、冻干后，得到具有抗肿瘤活性组份I的粗提物。 

4、菌株S-1代谢产物抗瘤谱 

将上述制备得到具有抗肿瘤活性的粗提物1后的组分分别稀释成终浓度(μg/mL)为200、100、50、25的样品，作用于肿瘤细胞系（肝癌细胞BEL-7402、结肠癌细胞RKO、神经胶质瘤细胞U251、肺癌细胞A549、乳腺癌细胞MCF-7）48h，并通过MTT法检测细胞活性。其中，菌株S-1的代谢产物对以上肿瘤细胞系均有增殖抑制作用。菌株S-1代谢产物对5种肿瘤细胞的抑制作用如下表2,为菌株S-1代谢产物对不同肿瘤抑制率(%)的测定(n=3,χ=S)。 

5、具有抗肿瘤活性组份I的粗提物的进一步分离纯化 

1）CM Fast Flow阳离子交换色谱分离 

取一定量的活性粗提物溶于起始缓冲液(25-50mmol/L甘氨酸-氢氧化钠，pH8.5-9.5)，将样品上样于预先用起始缓冲液平衡的CM-Sepharose FF阳离子交换柱(2.6cm×10cm)，流速为1.5-3mL/min。上样后先用起始缓冲液冲洗未结合上的物质，之后用0-25%洗脱缓冲液（50mmol/L甘氨酸-氢氧化钠+1mol/L氯化钠，pH=9.0）线性洗脱20-30min，整个色谱过程采用254nm检测洗脱情况，分别收集各洗脱峰，采用MTT法和显微镜观察法对各组成分的抗肿瘤活性进行活性跟踪，将活性组份命名为活性峰II，置于-20℃保存,结果如图4所示。 

分别收集如图4所示的1-5号洗脱峰，除盐后冻干，进行MTT体外抗肿瘤活性检测，细胞株为人肝癌细胞BEL-7402。通过细胞实验发现，3号峰为活性峰，具有 较强的抑制BEL-7402增殖活性，其IC50值为55μg/mL。其它峰无明显活性。因此，选取3号峰为活性峰II,置于-20℃保存。 

2）HPLC高效液相色谱分离纯化 

将上述的活性峰II用5v/V%的含0.1v/V%三氟乙酸（TFA）的乙腈溶解，用有机滤膜过滤样品，上HPLC高效液相色谱进行分离纯化。色谱条件：色谱柱：WATERSXBridge制备型C18柱；流速：3mL/min；温度：20℃；检测波长：254nm；流动相A：0.1v/V%三氟乙酸的水溶液，流动相B：0.1v/V%三氟乙酸的乙腈溶液。 

利用WATERS2545制备型色谱和WATERS XBridge制备型C18柱对经CM-Sepharose FF层析后收集的脱盐活性样品分离，色谱条件为：流动相A：0.1v/V%三氟乙酸水溶液，流动相B：0.1v/V%三氟乙酸的乙腈溶液；紫外检测：254nm；用5%流动相B平衡后上样，每次上样1ml，流速：1ml/min；梯度洗脱；分别收集各洗脱峰，采用MTT法对各收集峰的抗肿瘤活性进行测定，将活性峰命名为活性峰III,置于-20℃冻干保存。 

将活性峰III在冻干后重溶于含0.1v/V%TFA的5v/V%乙腈中，再采用WATERS的XBridge-C18反相色谱柱进行高效液相层析，方法同上，HPLC色谱二次上样的梯度洗脱程序如表3。 

表3 

HPLC高效液相色谱层析图谱如下图5所示。从图5可以看出，活性峰III经XBridge-C18反相层析柱分离纯化后主要得到1个主峰，MTT体外抗肿瘤活性检测显示此活性峰有很高的抗肿瘤活性。选取此峰为活性峰IV，并将其命名为海洋抗肿瘤活性多肽SBP（来自芽孢杆菌S-1多肽）。 

6、海洋抗肿瘤活性多肽分子量测定及氨基酸分析 

对于经HPLC分离纯化出的活性组分，用5800串联飞行时间质谱仪进行质谱分析，采用正离子模式和自动获取数据模式采集数据。仪器先用肌红蛋白（myoglobin） 酶解肽段进行外标校正。基质和样品的PMF质量扫描范围为700-3600Da。进行完MS后,直接选择目标肽段离子进行MS/MS分析。得到的MS/MS谱图6后采用仪器软件4000Explorer自带的分析工具：De Novo Explorer进行从头测序。得到序列后，再采用软件Data Explorer将MS/MS图标上b,y等由母离子碎裂后得到的分子离子。对分子离子峰[M+H]+1为1570.0358进行MS/MS分析，得到MS/MS谱图6，从图6可以看出，经过MALDI-TOF-TOF的MS分析后得到其分子离子峰值[M⁺H]⁺¹为1570.0358。采用仪器软件4000Explorer自带的分析工具：De Novo Explorer进行从头测序，通过软件匹配和手工验证得到了比较可靠的序列，由海洋短芽孢杆菌S-1产的海洋抗肿瘤活性多肽是由14个氨基酸组成的环肽，氨基酸序列为Ala-Pro-Gln/Lys-Asn-Ile/Leu-Val-Pro-Gln/lys-Thr-Ile/Leu-Gln/Lys-Tyr-Ile/Leu-Cys。N端氨基酸序列检测结果显示该多肽的N端封闭，进一步证明该多肽为一种环肽。 

通过高分辨核磁共振波谱仪系统Bruker AVANCE III600重新检测了海洋抗肿瘤活性多肽的NMR谱；进一步明确了质谱解析过程中不能区分的氨基酸K/Q和I/L；确定该海洋抗肿瘤活性多肽的氨基酸序列为Ala-Pro-Gln-Asn-Ile-Val-Pro-lys-Thr-Leu-Lys-Tyr-Leu-Cys。在NCBI网站进行protein to protein BLAST比对，没有检测到与其相匹配的活性肽；由此说明，海洋抗肿瘤活性芽孢杆菌S-1多肽为一种新的抗肿瘤活性多肽。 

本发明提供的海洋芽孢杆菌S-1菌株产的抗肿瘤活性多肽SBP（海洋芽孢杆菌S-1多肽SBP）的性质如下： 

（1）抗肿瘤活性多肽SBP分子量为1570Da； 

（2）抗肿瘤活性多肽SBP的分子由14个氨基酸组成； 

（3）抗肿瘤活性多肽SBP的氨基酸序列为Ala-Pro-Gln-Asn-Ile-Val-Pro-lys-Thr-Leu-Lys-Tyr-Leu-Cys； 

（4）抗肿瘤活性多肽SBP为一种环肽； 

（5）抗肿瘤活性多肽SBP对人肝癌细胞BEL-7402增殖的抑制作用； 

整个分离纯化的过程，采用MTT法，以BEL-7402为靶细胞追踪细胞增殖抑制作用最强的活性组分，最终获得的抗肿瘤活性多肽SBP对BEL-7402的IC50值约为7.39μmol/L。 

本发明提供的海洋芽孢杆菌S-1菌株产的抗肿瘤活性多肽SBP对肝癌细胞BEL-7402的抗肿瘤活性的影响。 

1）肝癌细胞BEL-7402的培养方法，使用已知方法 

2）多肽浓度的测定方法 

多肽浓度测定方法为采BCA法（二甲喹啉酸），使用BCA Protein Assay Kit试剂盒。通过说明书，首先进行标准曲线的绘制；然后将样品多肽做梯度稀释，分别将每个样品取25μL加入96孔板的微孔中，再在各孔中加入200μL BCA工作液，充分混匀，于37℃孵育30分钟，冷却至室温，用酶标仪测定562nm处的吸光值，再根据标准曲线来计算蛋白或者多肽的浓度。 

3）MTT法测定SBP对肝癌细胞BEL-7402增殖的影响 

MTT检测结果发现肝癌细胞BEL-7402用特定浓度的SBP作用48h，并通过MTT法检测细胞活性，结果如图7及表4所示： 

表4SBP对肝癌细胞BEL-7402抑制率 

通过表4和图7，可以看出抗肿瘤多肽SBP对BEL-7402肿瘤细胞有很好的抑制作用，其IC50值为7.15μM。（细胞增殖抑制为3次独立实验的均值±SD，实验重复3次，并用统计学上方差分析的方法进行标准差计算）。 

由上所述，本发明从海洋微生物中筛选到1株代谢产物具有抗肿瘤活性的菌株S-1,分离纯化出一种分子量为1570Da的抗肿瘤活性多肽SBP，并能有效发挥抑制肝癌细胞BEL-7402生长的作用。 

本发明提供的新型海洋芽孢杆菌S-1菌株产的抗肿瘤活性多肽SBP有望成为治疗肝癌药物。 

附图说明

图1菌株S-1的16S rDNA基因序列 

图2菌株S-1的系统发育树 

图3电泳检测图 

图4粗提物的CM Sepharose Fast Flow离子交换层析图 

图5HPLC C-活性峰III的二次上样的C-18层析图谱 

图6MALDI-TOF MS对SBP分子量检测图 

图7SBP对肝癌细胞BEL-7402的抑制率(IC50值)的测定图 

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列 

实施例： 

实施例1--菌株S-1的鉴定 

1、菌株的筛选分离 

1）菌株的培养 

从南海海域的海泥中培养、筛选、分离得到的单个细菌菌株，-80℃冰箱甘油保种。随机吸取出100μL甘油保种的菌株，接种于30ml的种子（活化）培养基，于30℃、200r/min的摇床里恒温培养24h，所述种子培养基:10g/L蛋白胨,3g/L葡萄糖,5g/L NaCl，pH=7.0，121℃灭菌30min。 

2)菌的发酵培养 

将种子发酵液按照4%(v/v)的接种量接种于300mL的发酵培养基中，相同条件下继续培养36h，得菌株发酵液。所述发酵培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，3g/L葡萄糖,氯化钠5g/L，1mol/L NaOH调pH值为7.0，121℃灭菌30min。 

3）代谢产物的制备 

取菌株发酵液，在10000r/min离心20min，去除发酵液中的菌体和杂质。上清液加入与发酵液等体积的水饱和正丁醇萃取发酵液，每次萃取6h，收集上层有机相。然后用旋转蒸发仪在80℃减压蒸干。减压蒸干的样品经重溶、离心、冻干后，得到具有抗肿瘤活性的粗提物。 

4）MTT法检测代谢产物抗肿瘤活性。 

（1)取对数生长期的癌细胞，用吸管吸出残余的培养液，再用2mL RPMI1640洗三遍，去掉贴壁状态不好的细胞和死细胞。加入1.0mL胰酶（含EDTA）消化3分钟，显微镜下观察，发现80%细胞变圆皱缩就停止反应，吸出胰酶。消化后的细胞加入RPMI1640培养液用吸管吹打成单细胞悬液。 

（2)细胞计数，将细胞悬液调成5×104/mL左右。 

（3)将细胞悬液加入到96孔板中，每孔加180μL，空白对照组只加RPMI1640培养液，在37℃恒温CO2培养箱培养18-24h。 

（4)样品组每孔加入样品20μL，样品在加入前用0.22um的滤膜过滤，每组设置四个平行孔。 

（5)加好样的平板继续在CO2培养箱培养48h后，取出平板，每个样品孔加20μLMTT(5mg/ml)，再在CO2培养箱培养继续培养4h。 

（6)终止培养反应，用移液枪吸去孔内培养液，用RPMI1640培养基清洗2遍，再在每孔加入150μL DMSO，摇床上低速震荡10min，使结晶物甲瓒充分溶解。 

（7)最后用酶标仪在OD570nm下测量吸光值。实验重复3次，数据以均值±SD表示，并用统计学上方差分析的方法对标准差进行计算。 

5）菌株代谢产物抗瘤谱的测定 

选择不同的几株肿瘤细胞系（人肝癌细胞BEL-7402、结肠腺癌细胞RKO、非小细胞肺癌细胞A549、胶质瘤细胞U251、乳腺癌细胞MCF-7），用MTT比色法检测提取组分的抗肿瘤活性（方法同上4）），最后用酶标仪测量吸光值，观察对每种肿瘤细胞的抑制活性。细胞抑制率=［(A对照－A样品)/A对照］×100%。采用Excel分析软件计算半数抑制浓度IC50。其中，菌株S-1的代谢产物对以上肿瘤细胞系均有增殖抑制作用。菌株S-1代谢产物对5种肿瘤细胞的抑制作用如下表2,为菌株S-1代谢产物对不同肿瘤抑制率(%)的测定(n=3,χ=S)。 

2、生理生化特性的测定: 

1）革兰氏染色 

取菌株S-1的菌液制成涂片，干燥后固定，要求每个菌种各制一片。再用草酸铵结晶紫染色1min，用蒸馏水清洗染料。加碘液覆盖1min，用水冲洗，吸水纸吸去多余水分。用95wt%乙醇脱色20s，立即用水洗净并用滤纸吸干。蕃红染色液复燃1min，水洗、吸干后镜检。 

2）氧化酶 

直接滴加1wt％盐酸四甲基对苯二胺于菌落上，若在10s内观察到试剂显紫色，为阳性，反之为阴性。 

3）V-P实验 

将各菌株接种到V.P培养基中，分别做好标记。在30℃的条件下培养24小时。然后往试管中加入约3ml的10M氢氧化钠，振荡试管，再加入1ml6wt%的α-萘酚试剂，振荡30min后观察颜色的变化。若培养基呈红色，则为阳性；不呈红色，则为阴性。 

4）硝酸盐还原 

被检菌接种于硝酸盐培养基中，于35℃培养2天。然后将革里斯试剂A液和B液等量混合后（约0.1m1）加入培养基内，立即观察结果。如过溶液变红则为阳性；如果不变色再加入少许锌片，如果变蓝，说明为阴性，如果不变色，则为假阴性。 

5）柠檬酸盐利用 

可以直接观察斜面，变蓝色为阳性，不变色为阴性。 

6）硫化氢实验 

直接观察培养基，变黑色为阳性，不变色为阴性。 

7）吲哚实验 

将乙醚加入试管中，振荡后加入几滴吲哚试剂，液面出现红色为阳性，不变色 为阴性。 

8）水解明胶 

将菌种通过穿刺法接种到明胶培养基中，30℃培养2天，观察结果前放入冰箱30min左右。明胶呈现液态为阳性，否则为阴性。 

9）碳源利用 

将菌株接种于基础培养基上，再分别点上葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇等碳源，如果菌株在加碳源处可以生长，表明菌株能利用此碳源，为阳性；不能利用为阴性。上述菌株S-1表型特征于表1。 

菌株为好氧菌,有较好的耐盐性，在7%NaCl（w/v）培养液中生长良好；生长pH范围为5.0-9.0；生长温度范围较宽，在15℃-37℃环境下也可良好生长,其它生理生化特征见表1。 

根据每株菌株的生理生化特征指标，参考《伯杰细菌鉴定手册（第九版）》手册，结合16S rDNA序列分析结果，确定菌株S-1为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。 

3、菌株基因组DNA的提取 

菌株基因组DNA的提取采用Invitrogen Genomic DNA mini Kit，其方法如下： 

1）将水浴锅的温度分别设定为55℃和37℃。 

2）取200μL的溶菌酶缓冲液，加入新鲜的溶菌酶，使最终溶菌酶浓度为20mg/ml。 

3）通过离心收集2×109革兰氏阳性细胞，用180μl包含溶菌酶的缓冲液重悬细胞，涡旋振荡，37℃培养30min。 

4）加入20μL蛋白酶，涡旋振荡。再加入200μL PureLink?基因组裂解/结合缓冲液，涡旋混合均匀，55℃培养30min。 

5）加入200μL96-100wt%乙醇溶液于溶菌液中，涡旋混合均匀。 

6）将吸附柱放入收集管中，向其中加入640μL的溶菌液，室温下10000r离心1min。 

7）弃掉收集管，将吸附柱放入新的收集管中，加入500μL洗脱缓冲液1，室温下10000r离心1min。 

8）弃掉收集管，将吸附柱放入新的收集管中，加入500μL洗脱缓冲液2，室温下最大转速离心3min。 

9）将吸附柱放入1.5μL的离心管中，加入25-200μL基因组洗脱缓冲液，室温下等待1min后，再以最大速度离心1min。 

10）收集管中纯化后的DNA，-20℃下储存。 

4、16S rDNA引物设计 

采用16S rDNA通用引物(由上海生工合成)。 

正向引物27F：5＇-AGAGTTTGAT CCTGGCTCA-3＇； 

反向引物1492R：5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇； 

5、菌株16S rDNA的扩增 

16S rDNA序列的PCR扩增体系：以菌株提取的基因组DNA为模版，加入2μL引物；0.25μL Taq DNA聚合酶（5U·mL-1）；5μL10xPCR反应缓冲液；4μL dNTPMasterMix；ddH20补足至50μL。 

PCR反应条件：95℃预变性4min；30个循环（94℃30s，55℃40s，72℃90s）；72℃终延伸10min。 

6、琼脂糖电泳检测PCR产物 

用1.5%的琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，以D2000Marker为标准分子量对照试剂。若发现在Marker1.5kb左右有一条单带，证明16S rDNA序列成功扩增。PCR产物送北京华大基因测序,得到结果如图1。 

7、16S rDNA序列的测定和系统发育树分析 

用BioEdit软件进行多序列比对，采用MEGA4.1软件的邻接法（Neighbor-joining Method）绘制系统发育树如图2。 

对菌株S-1的16S rDNA的基因序列同源性系统发育树分析,PCR产物测序结果显示菌株S-1的16S rDNA的基因序列如图1以及16S rDNA的序列基因长度为1466bp。应用Blast程序进行分析,通过MEGA4.1软件Neighbor-joining绘制发育树如图2，确定菌株S-1为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）的细菌。 

通过《常见细菌系统鉴定手册》，可以确定菌株S-1是芽孢杆菌属（Bacillus sp.）的细菌。图2也证明了菌株S-1的系统学位置。 

实施例2---新型海洋芽孢杆菌S-1菌株的发酵培养及其代谢产物抗肿瘤活性多肽SBP： 

1、种子培养 

将从-80℃冰箱中吸取出100μL甘油保种的菌株（从南海海域的海泥中培养、筛选、分离得到的细菌菌株-新型海洋芽孢杆菌S-1或简称菌株S-1），接种于30ml的种子（活化）培养基，于30℃、200r/min的摇床里恒温培养24h。所述种子培养基:10g/L蛋白胨,3g/L葡萄糖,5g/L NaCl，pH=7.0，121℃灭菌30min。 

2、发酵培养 

接种20h种龄的种子4(V/V)%，30℃、200r/min的条件下在旋转摇床中培养 36h。所述发酵培养基：蛋白胨8-12g/L，酵母提取物3-6g/L，3g/L葡萄糖,氯化钠3-7g/L，1mol/L NaOH调pH值为6.5-7.5，121℃灭菌30min。3、抗肿瘤多肽3、粗提物的制备 

1）取一定量的芽孢杆菌S-1菌株的发酵液，用适量的缓冲液溶解于4℃、10000rpm离心20min，去除泥沙杂质及不溶性物质，收集上清液。 

2）在通风橱内，上清液加入与发酵液等体积的水饱和正丁醇,并将整个萃取体系保持在摇床上，用80rmp/min反复萃取发酵液，每次萃取6h，收集上层有机相。然后用旋转蒸发仪在80℃减压蒸干。 

3）取下蒸发瓶，用缓冲液将旋转蒸发仪瓶子中的样品全部溶解，于4℃、10000rpm离心20min，去除不溶解的物质，保留上清液, 

上清液采用BCA法测定蛋白浓度后，MTT试验检测组份活性，再将活性置于-20℃保存减压蒸干的样品经重溶、离心、冻干后，得到具有抗肿瘤活性组份I的粗提物。 

4、菌株S-1代谢产物抗瘤谱 

将上述制备得到具有抗肿瘤活性的粗提物后的组分分别稀释成终浓度(μg/mL)为200、100、50、25的样品，作用于肿瘤细胞系（肝癌细胞BEL-7402、结肠癌细胞RKO、神经胶质瘤细胞U251、肺癌细胞A549、乳腺癌细胞MCF-7）48h，并通过MTT法检测细胞活性。其中，菌株S-1的代谢产物对以上肿瘤细胞系均有增殖抑制作用。菌株S-1代谢产物对5种肿瘤细胞的抑制作用如表2,为菌株S-1代谢产物对不同肿瘤抑制率(%)的测定(n=3,χ=S)。 

5、具有抗肿瘤活性组份I的粗提物的进一步分离纯化。 

1）CM Fast Flow阳离子交换色谱分离 

取一定量的活性粗提物溶于起始缓冲液(50mmol/L甘氨酸-氢氧化钠，pH9.0)，将样品上样于预先用起始缓冲液平衡的CM-Sepharose FF阳离子交换柱(2.6cm×10cm)，流速为2mL/min。上样后先用起始缓冲液冲洗未结合上的物质，之后用0.05%洗脱缓冲液（50mmol/L甘氨酸-氢氧化钠+1mol/L氯化钠，pH=9.0）线性洗脱30min，整个色谱过程采用254nm检测洗脱情况，分别收集各洗脱峰，采用MTT法和显微镜观察法对各组成分的抗肿瘤活性进行活性跟踪，将活性组份命名为活性峰II，置于-20℃保存,结果如图4所示。 

分别收集如图4所示的1-5号洗脱峰，除盐后冻干，进行MTT体外抗肿瘤活性检测，细胞株为人肝癌细胞BEL-7402。通过细胞实验发现，3号峰为活性峰，具有较强的抑制BEL-7402增殖活性，其IC50值为55μg/mL。其它峰无明显活性。因此， 选取3号峰为活性峰II,置于-20℃保存。 

2）HPLC高效液相色谱分离纯化 

将上述的活性峰II用5%的含0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈溶解，用有机滤膜过滤样品，上HPLC高效液相色谱进行分离纯化。色谱条件：色谱柱：WATERS XBridge制备型C18柱；流速：3mL/min；温度：20℃；检测波长：254nm；流动相A：0.1v/V%三氟乙酸的水溶液，流动相B：0.1v/V%三氟乙酸的乙腈溶液。 

利用WATERS2545制备型色谱和WATERS XBridge制备型C18柱对经CM-Sepharose FF层析后收集的脱盐活性样品分离，色谱条件为：流动相A：0.1v/V%三氟乙酸乙腈水溶液，流动相B：0.1v/V%三氟乙酸的乙腈溶液；紫外检测：254nm；用5%流动相B平衡后上样，每次上样1ml，流速：1ml/min；梯度洗脱；分别收集各洗脱峰，采用MTT法对各收集峰的抗肿瘤活性进行测定，将活性峰命名为活性峰III,置于-20℃冻干保存。 

将活性峰III在冻干后重溶于含0.1v/V%TFA的5v/V%乙腈中，再采用WATERS的XBridge-C18反相色谱柱进行高效液相层析，方法同上，HPLC色谱二次上样的梯度洗脱程序如表3。 

HPLC高效液相色谱层析图谱如下图5所示。从图5可以看出，活性峰III经XBridge-C18反相层析柱分离纯化后主要得到1个主峰，MTT体外抗肿瘤活性检测显示此活性峰有很高的抗肿瘤活性。选取此峰为活性峰IV，并将其命名为海洋抗肿瘤活性多肽SBP（来自芽孢杆菌S-1多肽）。 

6、海洋抗肿瘤活性多肽分子量测定及氨基酸分析 

对于经HPLC分离纯化出的活性组分，用5800串联飞行时间质谱仪进行质谱分析，采用正离子模式和自动获取数据模式采集数据。仪器先用肌红蛋白（myoglobin）酶解肽段进行外标校正。基质和样品的PMF质量扫描范围为700-3600Da。进行完MS后,直接选择目标肽段离子进行MS/MS分析。得到的MS/MS谱图6后采用仪器软件4000Explorer自带的分析工具：De Novo Explorer进行从头测序。得到序列后，再采用软件Data Explorer将MS/MS图标上b,y等由母离子碎裂后得到的分子离子。对分子离子峰[M+H]+1为1570.0358进行MS/MS分析，得到MS/MS谱图6,从图6可以看出，经过MALDI-TOF-TOF的MS分析后得到其分子离子峰值[M+H]+1为1570.0358。采用仪器软件4000Explorer自带的分析工具：De Novo Explorer进行从头测序，通过软件匹配和手工验证得到了比较可靠的序列，由海洋短芽孢杆菌S-1产的海洋抗肿瘤活性多肽是由14个氨基酸组成的环肽，氨基酸序列为Ala-Pro-Gln/Lys-Asn-Ile/Leu-Val-Pro-Gln/lys-Thr-Ile/Leu-Gln/Lys-Tyr- Ile/Leu-Cys。N端氨基酸序列检测结果显示该多肽的N端封闭，进一步证明该多肽为一种环肽。 

通过高分辨核磁共振波谱仪系统Bruker AVANCE III600重新检测了海洋抗肿瘤活性多肽的NMR谱；进一步明确了质谱解析过程中不能区分的氨基酸K/Q和I/L；确定该海洋抗肿瘤活性多肽的氨基酸序列为Ala-Pro-Gln-Asn-Ile-Val-Pro-lys-Thr-Leu-Lys-Tyr-Leu-Cys。在NCBI网站进行protein to protein BLAST比对，没有检测到与其相匹配的活性肽；由此说明，海洋抗肿瘤活性芽孢杆菌多肽为一种新的抗肿瘤活性多肽,抗肿瘤活性多肽SBP对人肝癌细胞BEL-7402增殖的抑制作用；IC50值约为7.39μm。