一种从冷杉针叶中提取分离三萜酸和聚戊烯醇的方法

摘要

本发明公开了一种从冷杉针叶中提取分离三萜酸和聚戊烯醇的方法。该方法以冷杉针叶为原料，用非极性溶剂提取得到针叶脂溶性提取物，用氢氧化钠溶液皂化，得到针叶有机酸盐和不皂化物；针叶有机酸盐加入盐酸酸化后，再加入乙酸乙酯萃取，萃取液水洗至中性，减压浓缩得到针叶三萜酸；针叶不皂化物加入丙酮溶解，静置分层，吸取上清液浓缩，加入乙醇溶解，静置分层，得到针叶乙醇不溶物，转入硅胶柱层析，用非极性溶剂和乙酸乙酯混合液淋洗，收集聚戊烯醇洗脱液，减压浓缩得到针叶聚戊烯醇。本发明采用溶剂提取法和柱层析法，提取的选择性和提取率大大提高，所得产品纯度也较高，而且溶剂可回收重复利用，生产成本较低，环境较为友好。

说明书

技术领域

本发明属于天然产物提取技术领域，尤其是利用冷杉针叶提取有 价值的生物活性物质——三萜酸和聚戊烯醇的方法，可用于医药、保 健食品和农业生产。

背景技术

松科植物是裸子植物中最大的一科，包括松属、云杉属、冷杉属、 黄杉属、落叶松属、金钱松属、雪松属、铁杉属、油杉属和银杉属， 共有10属230种，是构成地球木材蓄积量最多的树种之一。在复杂 多样的自然条件下和特定的地史演变过程中，松科植物以其独自的生 物学特性对不同的环境产生生态适应，并在长期的自然选择过程中， 形成了一套完善的防御体系，除了维护自然生态平衡和产生对人类有 用的木材之外，还蕴藏着结构新颖和生物活性显著的化合物，尤其是 松针（也名针叶、松针、松毛等）脂溶性物质，它们的经济价值和药 用潜力越来越受到人们重视。如：针叶聚戊烯醇是从松科植物针叶不 皂化物中提取的长链多萜类化合物，与人体脏器中所含的多萜醇具有 相似的结构特征，在保护细胞膜、稳定细胞蛋白质和支持人体的免疫 系统中发挥重大的作用，还在多糖合成和蛋白质-碳水化合物新陈代 谢中充当辅酶的作用，可用作预防和治疗各种慢性肝病和阿尔茨海默 病的药物。针叶三萜酸是从冷杉属植物针叶酸性物质中提取的羊毛甾 烷型四环三萜类化合物，具有与植物生长素相似的生物学效应，能够 提高农作物产量，降低细菌和真菌对植物的发病率，增加植物耐寒力 和抗旱性，以及加快果实成熟等。

中国专利ZL201010298504.8公开了一种松针脂溶性提取物制备 方法及其在制备治疗胃溃疡药物中的应用。该方法以松针为原料，经 切碎、干燥、粉碎、非极性溶剂提取、减压浓缩、氢氧化钠溶液皂化、 加水制成干物质含量≥55%的松针脂溶性提取物。中国专利ZL 200910034931.2公开了一种从植物针叶原料中提取高纯度聚戊烯醇 的方法。该方法以松属、云杉属、冷杉属、杉木属等植物的针叶为原 料，通过石油醚溶剂提取，提取液浓缩后加氧氧化钠溶液皂化，皂化 液用石油醚溶剂萃取，萃取液浓缩后加入丙酮溶解，冷却，过滤除杂， 滤液浓缩后加入乙醇溶液萃取，乙醇不溶物加入丙酮溶解，冷冻，过 滤除杂，滤饼经真空干燥后，得到高纯度的针叶聚戊烯醇。从上述实 施例可以看出，松针脂溶性提取物的产品得率≥5%，但针叶聚戊烯醇 的产品得率仅为0.5%左右。因此，在提取分离针叶聚戊烯醇过程中， 还应重视利用松针脂溶性物质的其他生物活性成分，充分开发这些生 物活性物质的药用价值，使针叶脂溶性物质得到更好利用。中国专利 ZL200910049924.X公开了一种新冷杉三萜内酯类化合物及其制备方 法和应用。该方法用乙醇提取冷杉枝叶，提取液减压浓缩后，得到浸 膏加水稀释，再以氯仿萃取，氯仿萃取部位经硅胶柱层析，收集石油 醚/乙酸乙酯洗脱液，再经葡聚糖凝胶柱层析，收集氯仿/甲醇洗脱液， 最后经C18反相柱层析，收集甲醇/水洗脱液，得到冷杉三萜内酯类 化合物。然而，从松针中同时提取分离具有生物活性的三萜酸和聚戊 烯醇的方法，目前尚未见有文献报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种从冷杉针叶 中提取分离三萜酸和聚戊烯醇的方法，以冷杉针叶为原料，同时提取 分离冷杉针叶中的三萜酸和聚戊烯醇。该方法提高了产品的总得率， 降低了生产成本，所得产品纯度也较高，易于实现工业化生产。

本发明的技术方案为：一种从冷杉针叶中同时提取分离三萜酸和 聚戊烯醇的方法，包括以冷杉针叶为原料，用非极性溶剂提取，提取 液浓缩后皂化，皂化液再用非极性溶剂萃取，上层为不皂化物溶液， 下层为有机酸盐溶液；有机酸盐溶液加入稀盐酸至pH值为2，在50～ 70℃条件下，酸化反应10～30min，再加入等体积乙酸乙酯萃取3～ 4次，合并乙酸乙酯萃取液，水洗至pH值为7止，减压浓缩回收溶 剂后，得到纯度≥70%墨绿色的膏状针叶三萜酸；不皂化物溶液水洗、 减压浓缩后加入丙酮溶解、冷却、静置分层，取上清液减压浓缩后， 再以乙醇溶液萃取，乙醇不溶物转入硅胶柱层析，用非极性溶剂和乙 酸乙酯混合液淋洗，收集聚戊烯醇洗脱液，减压浓缩回收溶剂后，得 到纯度≥90%wt淡黄色的油状针叶聚戊烯醇。

所述的稀盐酸浓度为体积百分数10%～15%。

所述的非极性溶剂和乙酸乙酯混合液是按照体积比19：1～9：1 比例混合的混合液。

所述的非极性溶剂为石油醚、正已烷、6号溶剂油中的任意一种 溶剂。

按照所述的从冷杉针叶中同时提取分离三萜酸和聚戊烯醇的方 法得到的针叶三萜酸在制备作为农作物生长促进剂中的应用。

按照所述的从冷杉针叶中同时提取分离三萜酸和聚戊烯醇的方 法得到的针叶三萜酸在制备作为番茄生长促进剂中的应用。

按照所述的从冷杉针叶中同时提取分离三萜酸和聚戊烯醇的方 法得到的针叶三萜酸在制备作为小麦生长促进剂中的应用。

按照所述的从冷杉针叶中同时提取分离三萜酸和聚戊烯醇的方 法得到的针叶三萜酸与甲柳三唑酮联合使用在制备小麦生长促进剂 中的应用。

有益效果：

1）本发明以冷杉针叶为原料，同时提取分离冷杉针叶中的三萜 酸和聚戊烯醇，开发这些生物活性物质的药用价值，使针叶脂溶性物 质得到更为合理利用。

2）本发明采用溶剂萃取法和柱层析法，提取的选择性和提取率 大大提高，所得产品纯度也较高，而且溶剂可回收重复利用，环境较 为友好。

3）本发明充分利用针叶脂溶性物质中的三萜酸和聚戊烯醇，提 高了产品的总得率，降低了生产成本，是一种具有推广应用前景的提 取分离方法。

4）本发明从冷杉提取分离的针叶三萜酸，使用非常小的剂量， 即可影响植物生长和发育的生理过程，主要表现在提高农作物的产 量。

5）本发明获得的针叶三萜酸对于番茄和小麦等具有明显的促进 增产作用，特别是对于小麦与现有其他农药联合使用时，增产效果非 常明显。

附图说明

图1为本发明的工艺流程示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但它们并不是对 本发明的限制。

一种从冷杉针叶中同时提取分离三萜酸和聚戊烯醇的方法，包括 步骤如下：

1、以冷杉针叶为原料，经切碎、干燥和粉碎后，按原料质量与 溶剂体积的比例为1g：4～10ml加入非极性溶剂，在50～70℃条件 下回流提取2次，每次2～6h，过滤，合并2次提取液，减压浓缩回 收溶剂后，得到针叶脂溶性提取物。

2、按提取物质量与溶剂体积的比例为1g：1～2ml加入20～40% 氢氧化钠（w/v），在50～70℃条件下，皂化反应1～2h，按质量体 积比为1g：1～2ml加入非极性溶剂，重复萃取4～5次，上层为不 皂化物溶液，下层为有机酸盐溶液，合并不皂化物溶液，水洗至pH 值为7止，减压浓缩回收溶剂，得到针叶不皂化物。

3、针叶有机酸盐溶液加入10～15%盐酸（v/v），调节pH值至 2，在50～70℃条件下，酸化反应10～30min，再加入等体积乙酸乙 酯萃取3～4次，合并乙酸乙酯萃取液，水洗至pH值为7止，减压 浓缩回收溶剂后，得到纯度≥70%墨绿色的膏状针叶三萜酸。

4、针叶不皂化物按质量体积比为1g：4～8ml加入丙酮，加热 至40～50℃搅拌溶解后，冷却至0～5℃，静置分层，吸取上清液， 减压浓缩回收溶剂后，再按质量体积比为1g：3～6ml加入85～90% 乙醇（v/v），加热至50～60℃搅拌溶解后，冷却至20～25℃，静置 分层，吸去上清液后，沉淀物再加入85～90%乙醇（v/v），重复操作 4～5次，得到针叶乙醇不溶物（可以参考ZL200910034931.2中记载 的方法）。

5、乙醇不溶物转入硅胶柱层析，用非极性溶剂和乙酸乙酯体积 比为19：1～9：1混合液淋洗，收集聚戊烯醇洗脱液，减压浓缩回收 溶剂后，得到纯度≥90%淡黄色的油状针叶聚戊烯醇。

所述的非极性溶剂为石油醚、正已烷、6号溶剂油中的任意一种 溶剂。

实施例1

以冷杉针叶为原料，经切碎、干燥和粉碎后，得到冷杉针叶粉。 取200g针叶粉置于2000ml的圆底烧瓶中，加入1000ml石油醚， 加热至60℃回流提取2h，过滤，滤渣再加入600ml石油醚，重复 提取1次，合并2次提取液，减压浓缩回收石油醚后，得到针叶脂溶 性提取物。针叶脂溶性提取物加入15ml30%NaOH溶液，在60℃ 温度下皂化反应1h，用150ml石油醚萃取5次，上层为石油醚溶液 （不皂化物溶液），下层为碱水溶液（有机酸盐溶液），合并石油醚萃 取液，水洗至pH值为7止，减压浓缩回收石油醚后，得到针叶不皂 化物。有机酸盐溶液加入体积百分比浓度为15%的盐酸，调节pH值 至2.0，在60℃温度下，酸化反应10min，再加入100ml乙酸乙酯 萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，水洗至pH值为7止，减压浓缩回 收乙酸乙酯后，得到5.5g三萜酸含量为78.2%墨绿色的膏状物。针 叶不皂化物加入50ml丙酮，加热至40℃搅拌溶解，再冷却至2℃， 静置分层，取上层丙酮溶液，减压浓缩回收丙酮后，再加入40ml87% 乙醇，加热至50℃搅拌溶解，再冷却至20℃，静置分层，吸去上层 乙醇溶液，沉淀物再加入87%乙醇，重复操作4次，得到针叶乙醇 不溶物。针叶乙醇不溶物转入硅胶柱层析，用正已烷和乙酸乙酯（9： 1）混合液淋洗，收集聚戊烯醇洗脱液，减压浓缩回收洗脱剂后，得 到0.7g聚戊烯醇含量为95.7%淡黄色的油状物。

实施例2

取冷杉针叶粉700g置于5000ml的圆底烧瓶中，加入3000ml6 号溶剂油，加热至70℃回流提取3h，过滤，滤渣再加入2000ml6 号溶剂油，重复提取1次，合并2次提取液，减压浓缩回收6号溶剂 油后，得到针叶脂溶性提取物。针叶脂溶性提取物加入20%NaOH 溶液，调节pH值至10.0，在65℃温度下皂化反应1h，用500ml6 号溶剂油萃取5次，上层为6号溶剂油溶液（不皂化物溶液），下层 为碱水溶液（有机酸盐溶液），合并6号溶剂油萃取液，水洗至pH 值为7止，减压浓缩回收6号溶剂油后，得到针叶不皂化物。针叶有 机酸盐溶液加入10%盐酸，调节pH值至2.0，在65℃温度下，酸化 反应20min，再加入300ml乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取 液，水洗至pH值为7止，减压浓缩回收乙酸乙酯后，得到19.5g三 萜酸含量为72.2%墨绿色的膏状物。针叶不皂化物加入200ml丙酮， 加热至45℃搅拌溶解，再冷却至1℃，静置分层，取上层丙酮溶液， 减压浓缩回收丙酮后，再加入120ml86%乙醇，加热至55℃搅拌溶 解，再冷却至22℃，静置分层，吸去上层乙醇溶液，沉淀物再加入 86%乙醇，重复操作4次，得到针叶乙醇不溶物。针叶乙醇不溶物转 入硅胶柱层析，用石油醚和乙酸乙酯（体积比12：1）混合液淋洗， 收集聚戊烯醇洗脱液，减压浓缩回收洗脱剂后，得到2.8g聚戊烯醇 含量为93.7%淡黄色的油状物。

药效实验：

1、冷杉针叶三萜酸在番茄上的应用效果

取上述冷杉针叶三萜酸，制成三萜酸含量为10%（w/v）针叶三 萜酸水乳液。番茄试验品种：迪芬尼。试验设置实验1组、实验2组 和对照组共3个处理组，每个处理组设3个重复小区，每个小区15m²， 随机区组排列。各处理组的针叶三萜酸施用方法见表1。

表1 针叶三萜酸生物制剂施用方法

番茄收获期的试验数据见表2。使用针叶三萜酸制剂的实验组的 第一台果总重量、总果数、最大果重和最大直径以及最小果重和最小 直径较对照组均有明显的提高，实验1组和实验2组与对照组比较， 番茄产量分别提高了9.5%和10.8%。由此可见，冷杉针叶三萜酸对 番茄有增产效果。

表2 番茄第一台果产量试验数据

2、冷杉针叶三萜酸在小麦上的应用效果

取上述冷杉针叶三萜酸，制成三萜酸含量为10%（w/v）的针叶 三萜酸生物制剂。小麦试验品种：扬辐麦3号。试验设置实验1组、 实验2组、实验3组和对照组共4个处理组，每个处理组设3个重复 小区，每个小区30m²，随机区组排列。各处理组的针叶三萜酸生物 制剂施用方法见表3。

表3 针叶三萜酸生物制剂施用方法

小麦收获期的试验数据见表4。使用针叶三萜酸制剂的实验组较 对照组种子重量提高1.5%～2.3%；平均穗粒数提高0.1～1粒；有 效穗数每亩约提高4.78%～11.94%；小麦产量提高了6.7%～16.5%。 实验2组在种子重量、有效穗数、小麦产量上都优于其他处理组，说 明针叶三萜酸在种子处理时联合其他农药（如甲柳三唑酮）有增效作 用。

表4 小麦收获期的试验数据

因此，本发明专利提取分离的冷杉针叶三萜酸，使用非常小的剂 量，即可影响植物生长和发育的生理过程，主要表现在提高农作物的 产量。