一株抑制椰子茎泻血病、杀鳞翅目害虫的苏云金芽孢杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一株抑制椰子茎泻血病、杀鳞翅目害虫的苏云金芽孢杆菌及其应用，保藏编号为CGMCC NO.7967。本发明从海南滨海土壤样品中直接分离筛选的苏云金芽孢杆菌菌株WENCHANG-BT20，携带有crylAa、crylBe、crylia、cry2Aa四种杀虫蛋白编码基因，杀虫毒力强、杀虫效果好，同时具有一定的抑制真菌病害的效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型微生物菌株，具体涉及一种抑制椰子茎泻血病、杀鳞翅目害 虫小菜蛾的苏云金芽孢杆菌菌株筛选方法及活性菌株制备方法，属于生物农药领域。

背景技术

小菜蛾属鳞翅目菜蛾科，是十字花科蔬菜的一种重要害虫，也是当今世界上最难 防治的害虫之一，据估算，全球每年用于防治小菜蛾的费用超过10亿美元。由于长期 使用化学农药防治小菜蛾危害，导致其对不同类型的杀虫剂都容易产生抗药性。目前， 控制其危害较为困难，该虫在我国南方常年危害严重。

目前，茎泻血病已成为椰子(Cocos nucifera L.)的主要病害之一，分布范围广，几乎 所有椰子种植区都有报道。Ohler(1906)最早报道了发生于斯里兰卡的椰子茎泻血病。随 后印度(1922)、菲律宾(1922)、马来西亚(1923)、特立尼达岛(1940)和佛罗里达州(1959) 等椰子种植区相继报道了该病的发生。Kartika等(1984)以及Nambiar等(1988)均报道椰 子茎泻血病会严重影响到椰子果产量；R.N.Dulce等(2009)报道巴西塞尔希培州的椰 子树爆发椰子茎泻血病，约有50个椰子园的椰子树表现茎泻血病症状，茎泻血病成为 巴西椰子树的主要病害之一。该病一般从伤口侵入，如果不采取防治措施，发病植株在 症状出现后3～4个月内即死亡。阴雨潮湿天气适合该病发生流行。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是革兰氏阳性芽孢杆菌属的一个 种。它形成芽孢的过程中会形成具有杀虫活性的晶体蛋白质(ICPs)。该杀虫晶体蛋白 由cry基因编码，现在已经发现苏云金芽孢杆菌大多数菌株都能产生多种类型的晶体蛋 白，对鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目 (Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga) 等多种昆虫(Faust G M etal，1983；Tailor R et al，1992；Hoffmann A et al，1998；Pinto L M  et al，2003；Rowell B et al，2005)，以及线虫、螨类和原生动物等具有特异的杀虫活性， Bt的杀虫范围已经扩大到包括大量农林及卫生害虫在内的无脊椎的4个门和节肢动物 门中9个目的生物。Bt杀虫活性对非靶标生物无害，因此被制成生物杀虫剂广泛的应用 于农业、林业和卫生害虫的防治(束长龙等，2007)。目前，有许多国家如美国、日本、 法国、比利时都对Bt进行了生产，其中美国生产量最大。我国Bt生产开始于20世纪 60年代，至今达到近60家生产厂家，年产量达到6万余吨，已经在20多个省用于粮、 棉、果、蔬、林的20多种害虫(杨怀文，2005)。苏云金芽孢杆菌的杀虫毒蛋白在基 因工程领域也取得了很大的成就，1987年Vaeck首次报道将crylAb基因导入烟草，使 转基因烟草避免了烟草天蛾的侵害，显示出Bt基因在转基因植物应用中的巨大潜力。 随后经过修饰的crylAb和crylAc相继在棉花、烟草、番茄、玉米、马铃薯、大豆、白 云杉等植物得到高水平表达。到2004年，全球已经种植了80万公顷的转Bt基因植物。 (Vaeck，et al，1987；Takeshi Ito et al，2005)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对小菜蛾具有杀虫效果好、同时抑制椰子真菌病害椰 子泻血病的苏云金芽孢杆菌菌株。

本发明菌株是通过采集海南文昌高隆湾滨海土壤样品分离筛选出的一株生产性状 好、对鳞翅目害虫小菜蛾具有高毒力的苏云金芽孢杆菌，菌株WENCHANG-BT20，已 于2013年07月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保 藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号： CGMCC NO.7967，分类命名苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis；菌株细胞及晶体形 态见图1。

本发明Bt菌株接种在1/2LB平板上，30℃培养观察菌落形态特征。

本发明苏云金芽孢杆菌菌株WENCHANG-BT20具有如下有益效果：

本发明从海南滨海土壤样品中直接分离筛选的苏云金芽孢杆菌菌株 WENCHANG-BT20，携带有crylAa、crylBe、crylia、cry2Aa四种杀虫蛋白编码基因， 杀虫毒力强、杀虫效果好，同时具有一定的抑制真菌病害的效果。

附图说明

图1：WENCHANG-BT20菌株细胞及晶体形态；

图2：WENCHANG-BT20对椰子茎泻血病的抑菌性实验结果；

图3：WENCHANG-BT20对小菜蛾室内杀虫活性测定结果；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1菌株的分离

取适量土样加入分离培养基中，30℃，200rpm摇床培养10h后，80℃水浴15min， 按四个浓度(原液，原液稀释10倍，100倍，1000倍)各吸100μL涂固体1/2LB平板 (每个浓度涂两个平板)，倒入小玻璃珠左右摇晃，使菌液均匀涂布，室温放置10min 后将平板置于30℃培养箱，48h后观察菌落形态，挑选类似Bt的菌落涂片，用复红染 色后于油镜下检测是否存在芽孢和伴孢晶体。同一分离物检出的苏云金芽孢杆菌菌株依 其菌落形态和颜色、营养体及孢晶形态等进行取舍，每种形态取一株进行单菌落纯化后 保藏备用。

菌株WENCHANG-BT20，已于2013年07月26日在中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科 学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.7967，分类命名苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis；菌株细胞及晶体形态见图1。

实施例2菌株的鉴定

将Bt菌株WENCHANG-BT20在1/2LB培养基上培养48小时后形成单菌落，菌落 乳白色，圆形或近圆形，边缘整齐，菌落中间较厚，向四周逐渐变薄，一般30小时左 右可观察到晶体。扫描电镜下观察到Bt菌株菌体为长杆状，芽孢为长圆棒状，晶体为 菱形(图1)。

WENCHANG-BT20菌株的16S rDNA序列扩增、序列测定及分子分类：

提取菌株基因组DNA，用细菌通用引物F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) 与R(5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)进行聚合酶链式反应(PCR扩增)，反应条件 为94℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环，最后72℃延伸10 分钟，得到该菌株的16S rDNA的保守序列(见序列表)，通过NCBI Blast序列比对和 用DNAMAN5.2软件Multiple Sequence Alignment分析并构建系统进化树，鉴定为一株 苏云金芽孢杆菌菌株。

WENCHANG-BT20对椰子泻血病菌抑菌活性的测定：

采用平板对峙培养法，在平板中央接苏云金芽孢杆菌菌饼(直径为6mm)，周围35mm 处等距离接4株同样供试病原物菌饼(直径为6mm)。以中央只接病原菌，不接Bt菌做 对照，每处理重复3次，25℃培养，待各对照菌株长满平板后。观察苏云金芽孢杆菌对 椰子茎泻血病菌的抑菌效果，并进行测量统计。经过测量该菌株的抑菌圈直径为22mm。

WENCHANG-BT20伴孢晶体蛋白的提取与定量：

首先接种牛肉膏蛋白胨培养基至菌体脂裂解(30℃恒温，230rpm/min震荡培养39h)； 低温冷冻离心机10000rpm离心8min收集菌体；用1M NaCl悬浮菌体后10000rpm离心 8min，去上清；灭菌蒸馏水洗沉淀；50mM Na₂CO₃、50mM EDTA体积比为5％的巯基乙醇 pH9.5-10.5悬浮沉淀冰浴100rpm，4小时以上；10000rpm离心10min，取上清；上清 加入1/10体积的3MNaAc调PH至4.5-5.0，混匀，冰浴沉淀2小时以上；10000rpm离 心10min，取沉淀；用灭菌蒸馏水洗蛋白至无巯基乙醇为止；沉淀用适量的50mM Na₂CO₃溶解pH10.2，冰上溶解1小时。溶解后SDS-PAGE与BSA比对定量，测定蛋白溶解液 浓度为1.6μg/mL。

实施实例3WENCHANG-BT20对小菜蛾的室内杀虫活性测定

采用浸叶法，把WENCHANG-BT20的蛋白溶液设置8个实验浓度梯度，分别为 1.6μg/mL、0.8μg/mL、0.4μg/mL、0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.025μg/mL、 0.0125μg/mL。将甘蓝叶片用清水洗净晾干，选取鲜嫩一致的甘蓝叶片切成大小相近的 块状，在各个浓度的蛋白溶液中浸泡10min，晾干，放入生测瓶中，每瓶接2-3龄幼虫 20头，每个处理重复三次，25℃生化培养箱中保温，培养72h后调查死、活虫数，并 观察幼虫取食情况。

生物测定结果显示WENCHANG-BT20蛋白对小菜蛾具有高杀虫活性，中毒的小菜 蛾明显的变黑死亡，整个虫体呈黑色，腐烂，而对照供试虫表现食量较大，虫活跃，发 育正常(图3)。其蛋白液LC₅₀为0.088μg/mL，置信度为95％，置信区间为 0.046-0.127μg/mL(表1)

表1.WENCHANG-BT20对小菜蛾杀虫活性(72hr)

实施例4WENCHANG-BT20菌株产孢特性

将浓度为1×10⁸cfu/mL的WENCHANG-BT20菌体悬浮液在1/2LB培养基上(100μL/ 皿)，在不同温度20℃、22℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、35℃的 培养条件下培养15天后测定单位面积上的产孢量，确定WENCHANG-BT20菌株在30℃ 下产孢子量为最佳。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。