细胞培养物得到的α1 蛋白酶抑制剂的纯化

摘要

本文描述了用于纯化重组的，细胞培养物得到的α1蛋白酶抑制剂以及除去与recA1PI蛋白一起共同纯化的带颜色的物质的方法。还描述了用于还原细胞培养物得到的α1-蛋白酶抑制剂中的铁的方法。

说明书

技术领域

本文描述了用于纯化人类重组细胞培养物得到的α1蛋白酶抑制剂（recA1PI）并且除去与recA1PI蛋白一起共同纯化的带颜色的物质的方法。 

背景技术

α1-蛋白酶抑制剂（本文中缩写为A1P1；也称为α-1蛋白酶抑制剂，α-1PI，A₁PI，α-1PI，α₁PI，α-1胰蛋白酶抑制剂，α1抗胰蛋白酶，α-1抗胰蛋白酶，α1AT，A1A，和A1AT，AAT等等），是人体中主要的丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpin）。A1PI表达为418个氨基酸蛋白，其中残基1-24是信号肽。该成熟蛋白质，由残基25-418组成，是具有约51kD分子量的单链糖蛋白。参见图1。尽管A1PI并不包含任何二硫键，但该蛋白是高度结构化的，其中80%的氨基酸存在于八个明确定义的α-螺旋和三个大β-折叠中。在Asn70，Asn107，和Asn271（按照在全长蛋白中编号）中发现三个天冬酰胺连接的糖类。这导致多种A1PI同种型，具有在4.0至5.0范围内的等电点。该聚糖单糖包括N-乙酰基葡糖胺，甘露糖，半乳糖，岩藻糖，和唾液酸。 

A1PI的正常血浆浓度在1.3至3.5mg/mL范围内。A1PI的功能是保护细胞避免引起凝血和炎症的蛋白酶作用。A1PI抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、各种形式的弹性蛋白酶、皮肤胶原酶、血管紧张肽原酶、尿激酶、和多形核的淋巴细胞的蛋白酶等。A1PI用作这些蛋白酶的假底物，通过切割残基Met358-Ser359之间的键以形成A1PI-蛋白酶复合物，这些蛋白 酶攻击A1PI分子的反应中心环（残基Gly368-Lys392）。由血液循环快速地除去该复合物。A1PI的一种内源性作用是调节中性白细胞弹性蛋白酶的活性，该酶分解外源蛋白并且伤害肺中存在的天然组织。在缺乏足够量的A1P1的情况下，弹性蛋白酶分解肺组织，随着时间的推移这将导致慢性肺组织损害和肺气肿。 

通常从血浆中纯化A1PI。参见，例如U.S.专利号6,284,874；6,462,180；6,093,804；7,879,800；以及WO1998/000154；WO2002/048176；WO2010/009388。另外，可以从各种来源表达和纯化重组A1PI(recA1PI）。参见，例如，US专利号4,931,373和5,134,119；U.S.专利申请公开号US2004/0124143和US2007/0218535；PCT公开号WO2005/047323和WO2010/127939；以及Archibald et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:5178-5182(1990)；Wright et al.,Nat.Biotechnology9:830(1991)。 

在本文中描述了用于表达和纯化人类重组的细胞培养物得到的用于治疗用途的A1PI的方法。纯化后，该A1PI溶液具有黄色或者琥珀色颜色，这可能引起临床医生和/或患者的反对。本文中还描述了减弱该颜色的方法。 

发明内容

本文中所描述的一种实施方式是减弱在包含细胞培养物得到的α1蛋白酶抑制剂（recA1PI）的溶液中大量着色剂的方法，包括使包含recA1PI的溶液与还原剂温育并且将recA1PI与着色剂分离。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂是半胱氨酸或者DTT。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂是半胱氨酸。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂浓度是从约1mM至约100mM。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂浓度约是10mM。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂浓度约是1mM。 

在本文中所描述的一些方面中，进行该还原温育步骤持续从约1至约24小时的时间。 

在本文中所描述的一些方面中，在从约2°C至约60°C的温度下进行该还原温育步骤。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂是10mM的半胱氨酸并且在约室温下进行温育过夜。 

在本文中所描述的一些方面中，将recA1PI与着色剂分离包括色谱法。 

在本文中所描述的一些方面中，该色谱法包括离子交换、疏水作用、凝胶过滤、亲合性、免疫亲和性、或者它们的组合。 

在本文中所描述的一些方面中，该方法包括减少铁浓度。 

在本文中所描述的一些方面中，该铁浓度减少（即，降低）2至100倍。 

在本文中所描述的一些方面中，该铁浓度减少（即，降低）5至50倍。 

在本文中所描述的一些方面中，该铁浓度是10μM或以下。 

在本文中所描述的一些方面中，该铁浓度是1μM或以下。 

本文中所描述的另一种实施方式是从包含recA1PI的水溶液中纯化细胞培养物得到的人类A1PI的方法，包括：（a）在包含recA1PI的溶液上进行病毒失活步骤；（b）将病毒失活的溶液通过阴离子交换剂使得recA1PI结合至该阴离子交换剂；（c）从阴离子交换树脂中洗脱recA1PI以获得包含recA1PI的阴离子交换洗脱液；（d）向包含recA1PI的阴离子交换洗脱液中加入还原剂以获得还原溶液；(e)温育该还原溶液；（f）使还原溶液通过疏水作用层析（HIC）树脂使得recA1PI结合至该HIC树脂；以及（g）从HIC树脂中洗脱recA1PI以获得包括recA1PI的HIC洗脱液。 

在本文中所描述的一些方面中，该病毒失活包括溶剂/清洁剂温育。 

在本文中所描述的一些方面中，加入的溶剂在0.01%至约0.5%范围内。 

在本文中所描述的一些方面中，加入从约0.5%至约2.0%重量/得到的混合物的体积的清洁剂。 

在本文中所描述的一些方面中，该溶剂/清洁剂温育包括在pH约8以及温度约30°C下加入约0.5%聚山梨酸酯20和约0.03%磷酸三（正丁基）酯。 

在本文中所描述的一些方面中，该阴离子交换剂是季铵树脂。 

在本文中所描述的一些方面中，该季铵树脂是Capto^TMQ。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂是半胱氨酸(Cys)；半胱胺；二硫苏糖醇(DTT)；二硫赤藓糖醇(DTE）；谷胱甘肽(GSH)；2-巯基乙醇(2-ME）；2-巯基乙胺（2-MEA）；三(2-羧乙基)膦(TCEP)；草酸；蚁酸；抗坏血酸；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）；或它们的组合。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂是半胱氨酸或者DTT。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂是半胱氨酸。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂浓度是从约1mM至约100mM。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂浓度约是10mM。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂浓度约是1mM。 

在本文中所描述的一些方面中，进行该还原温育步骤持续约1至24小时。 

在本文中所描述的一些方面中，在从约2°C至约60°C下进行该还原温育步骤。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂是10mM的半胱氨酸并且在约室温下进行温育过夜。 

在本文中所描述的一些方面中，该HIC树脂是Octyl Sepharose^TM或者Capto^TM Octyl。 

在本文中所描述的一些方面中，该方法包括减少铁浓度。 

在本文中所描述的一些方面中，该铁浓度减少（即，降低）2至100倍。 

在本文中所描述的一些方面中，该铁浓度减少（即，降低）5至50倍。 

在本文中所描述的一些方面中，该铁浓度是10μM或以下。 

在本文中所描述的一些方面中，该铁浓度是1μM或以下。 

在本文中所描述的另一种实施方式是纯化细胞培养物得到的α1蛋白酶抑制剂(recA1PI）的方法，包括使含有recA1PI的溶液与还原剂温育并且将recA1PI与还原剂及还原的物质分离。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂是半胱氨酸或者DTT。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂是半胱氨酸。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂浓度是从约1mM至约100mM。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂浓度约是10mM。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂浓度约是1mM。 

在本文中所描述的一些方面中，进行该温育步骤持续从约1至约24小时的时间。 

在本文中所描述的一些方面中，在从约2°C至约60°C的温度下进行该温育步骤。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂是约10mM的半胱氨酸并且在约室温下进行温育过夜。 

在本文中所描述的一些方面中，将该recA1PI与还原剂及还原的物质分离包括色谱法。 

在本文中所描述的一些方面中，该色谱法包括离子交换、疏水作用、凝胶过滤、亲合性、免疫亲和性、或者它们的组合。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原的物质包括铁。 

在本文中所描述的一些方面中，该铁浓度减少（即，降低）2至100倍。 

在本文中所描述的一些方面中，该铁浓度减少（即，降低）5至50倍。 

在本文中所描述的一些方面中，该铁浓度是10μM或以下。 

在本文中所描述的一些方面中，该铁浓度是1μM或以下。 

附图说明

图1示出人类A1PI的一级序列和重要的修饰位点。 

图2示出用于纯化recA1PI的纯化过程的流程图，其导致纯化的recA1PI溶液具有黄色颜色。 

图3示出通过免疫亲和层析纯化的recA1PI样品的色谱图（即，ATT Select树脂，GE Healthcare Life Sciences）。 

图4示出通过免疫亲和层析纯化的recA1PI样品的UV-Vis光谱图（即，ATT Select树脂，GE Healthcare Life Sciences）。 

图5示出使用Superdex^TM200制备级树脂（GE Healthcare Life Sciences）通过凝胶过滤(即，尺寸排除）色谱纯化的recA1PI样品的色谱图。图6示出使用Superdex^TM200制备级树脂（GE Healthcare Life Sciences）通过凝胶过滤(即，尺寸排除）色谱纯化的recA1PI样品的UV-Vis光谱图。 

图7示出具有黄颜色的人类重组细胞培养物得到的A1PI的三个样品的UV-Vis光谱图。样品1包括4M盐酸胍（Gdn·HCl）；样品2包括50mM二硫苏糖醇（DTT）；样品3包括4M Gdn·HCl和50mM DTT两者。 

图8示出用50mM DTT处理然后通过凝胶过滤色谱法纯化的recA1PI的色谱图。 

图9示出不使用DTT处理然后通过凝胶过滤色谱法纯化的recA1PI的色谱图。 

图10示出recA1PI、用50mM DTT处理的recA1PI、以及高度纯化的血浆得到的A1PI的样品的UV-Vis光谱图。 

图11示出recA1PI、用50mM DTT处理的recA1PI、以及用10mM DTT处理的recA1PI的样品的UV-Vis光谱图。 

图12示出来自运行处于PBS中的50mM DTT的凝胶过滤色谱法的色谱图。 

图13示出来自运行用处于PBS中的50mM DTT处理的recA1PI的凝胶过滤色谱法的色谱图。 

图14示出来自运行用10mM DTT处理的纯化血浆得到的recA1PI的凝胶过滤色谱法的色谱图。 

图15示出来自用10mM半胱氨酸处理的recA1PI的凝胶过滤色谱柱的色谱图。 

图16示出包括半胱氨酸温育步骤的改进的recA1PI纯化过程的流程图。应当指出的是可以在该过程的其他步骤处进行半胱氨酸温育，如在疏水作用层析之后或者在通过阳离子交换膜（黑体箭头）之后。 

图17示出使用未用半胱氨酸处理的recA1PI在Octyl Sepharose^TM上的疏水作用层析的色谱图。 

图18示出在用10mM半胱氨酸处理的之后使用recA1PI在Octyl Sepharose^TM上的疏水作用层析的色谱图。 

图19示出recA1PI、使用10mM半胱氨酸处理的recA1PI、或者高度纯化的血浆得到的A1PI的UV-Vis光谱图。 

具体实施方式

本文描述了用于纯化重组的细胞培养物得到的α1蛋白酶抑制剂以及除去与recA1PI蛋白一起共同纯化的带颜色的物质的方法。 

在本文中所描述的一方面是从包含recA1PI的水溶液中纯化重组的细胞培养物得到的人类A1PI的方法。 

在本文中所描述的另一种方法是减少重组的细胞培养物得到的A1PI溶液的颜色的方法，包括使含有recA1PI溶液与还原剂温育并且将recA1PI与还原剂以及带颜色物质分离。 

在本文中所描述的另一种方法是纯化重组的细胞培养物得到的A1PI的方法，包括使recA1PI溶液与还原剂温育并且将recA1PI与还原剂以及还原的物质分离。 

实施例 

实施例1 

人类重组A1PI的细胞生长和表达 

概述 

通过培养包含用于表达糖基化人类recA1PI的pAATopST3质粒构建体的人类PER.细胞(Crucell，Leiden，Netherlands）开始表达重组人类A1PI。这些细胞能够产生高产率的糖基化recA1PI，即，达到22皮克recA1PI/细胞/天（pcd）。通过10L wave生物反应器（wave bioreactor）和具有150L目标工作体积的200L生物反应器通过一系列规模放大步骤得到PER./recA1PI培养物。在13-14天后在Celeros Centrifuge（Celeros，Separations，Foxboro，MA）中通过在6,000rpm下离心来收获包含recA1PI的培养物上清，随后是在纯化之前进行过滤。 

小瓶溶解和摇瓶接种培养 

通过融化包含用于表达糖基化人类recA1PI的pAATopST3质粒构建体的PER.(Crucell）人类细胞的冷冻小瓶开始细胞培养过程。在WO2010/127939和U.S.专利申请号13/138,912中描述了表达重组A1PI的人类重组α1蛋白酶抑制剂克隆、表达、与分析的说明，通过引用将其结合在本文中用于这类教导。在将该瓶细胞融化之后，将细胞转移至125mL平底摇瓶并使最终容积达到15-25mL的CDM4PERMAb^TM基础培养基（Hyclone），使目标活细胞浓度为0.5×10⁶±0.1×10⁶细胞/mL。在90rpm，36.5°C，5.0%CO₂下温育该125mL摇瓶（传代#1)持续96±4小时。然后将细胞转移至具有100mL目标体积以及0.5×10⁶±0.1×10⁶细胞/mL的活细胞密度的250mL平底摇瓶中。在125rpm，36.5°C，5.0%CO₂下温育250mL平底摇瓶(传代#2）持续72至96小时（±4小时）。然后将细胞转移至具有250mL目标体积和0.5×10⁶±0.1×10⁶细胞/mL的活细胞密度的500mL平底摇瓶中。在125rpm，36.5°C，5.0%CO₂下温育500mL平底摇瓶(传代#3）持续72至96小时（±4小时）。然后将细胞转移至具有600mL目标体积和0.5×10⁶±0.1×10⁶细胞/mL的活细胞密度的1L平底摇瓶中。在125rpm，36.5°C，5.0%CO₂下温育1L平底摇瓶(传代#4）持续72至96小时（±4小时）。 

wave生物反应器接种培养 

将来自1L摇瓶的内含物转移至20/50EH Wave^TM生物反应器（GE Healthcare Life Sciences）上的10L以便获得3.0-4.0L的工作体积以及0.5×10⁶±0.1×10⁶细胞/mL的活细胞密度。在25rpm，7°-摆角，0.2升/分种（lpm）空气流速，36.5°C，及3.0%CO₂下运行该10L持续72至96小时(±4小时）。将来自10L Cellbag的内含物转移至20/50EH Wave生物反应器上的50L以便获得22-25L的工作体积以及0.5×10⁶±0.1×10⁶细胞/mL的活细胞密度。在22rpm，7°摆角，0.3lpm空气流速，36.5°C，以及3.0%CO₂下运行该50L持续72至96小时(±4小时）。 

200L生物反应器 

通过无菌的Kleenpak^TM连接机构(Xcellerex，Marlborough，MA)将50L 的内含物转移至Xcellerex200L生物反应器。该200L生物反应器可以包含最少量(100L)的CDM4PERMAb^TM基础培养基（Hyclone）并且在加入接种物之前在36.5°C，120rpm下，在7.2±0.4范围内的pH下操作。在0.6×10⁶细胞/mL±0.1×10⁶细胞/mL的活细胞密度下目标工作体积是150L。pH死区(不发生作用的信号范围区域）是7.2±0.4并且溶解氧定值是50%。通过加入1N碳酸钠或CO₂气体来保持pH。在96小时(±4小时)，将PerMAB^TM进料培养基（Hyclone）以等于生物反应器中最初工作体积的0.3%的每日丸剂量加入；进料培养基以100-300mL/min的流速加入。在运行期间在室温下保持进料培养基并且将其覆盖以防止任何的光降解。在开始运行时以12ppm加入防沫剂并且以小增量加入以便维持生物反应器中的泡沫水平为2英寸或以下。在308–340小时（12.8-14.2天）收获该200L生物反应器。 

离心和过滤 

使用6,000rpm(Celeros Separations，Foxboro，MA)的离心速度以0.5lpm的流速将来自200L生物反应器的材料转移至Celeros APD-751L转筒。 在转移之前计算百分比固体值以便测定需要的转筒排放（1L转筒可以装有1Kg的固体）的数量。将离心滤液（在离心后的澄清液）转移至Millipore Pilot POD容器，该容器包括两个1.1m²A1HC滤器（在1lpm下）（EMD Millipore，Billerica MA）。在深度过滤后，通过0.5/0.2μm Millipore SHC滤器过滤该物质。 

实施例2 

从细胞培养物上清中纯化人类重组A1PI。 

概述 

使用三个小时的溶剂/清洁剂处理以使病毒失活来开始recA1PI的纯化。然后捕获该recA1PI并从Capto^TM Q柱（GE Healthcare Life Science，Piscataway，NJ）中洗脱。第二天，在Octyl Sepharose^TM柱上继续纯化。超滤并渗滤该HIC洗脱液以便能够进行S-膜纯化，随后进行纳米过滤以便进行额外的病毒清除。将该物质的缓冲液调换成最终制剂缓冲液并且调节该蛋白浓度以制成配制的原液（Formulated bulk）。 

细胞培养上清的病毒失活 

将深度过滤的细胞培养上清称重、A280读取和取出等分部分用于取样。用于病毒失活步骤的温度及pH设定值是28°C±2°C和7.8±0.2的pH。使用TNBP/聚山梨酸酯20的100-×储液用于处理（通过混合0.5Kg的聚山梨酸酯20、0.06Kg的磷酸三(正丁基)酯（TNBP)和注射用水(WFI)以形成1L的混合物来进行制备）。以100倍稀释度将该储液加入细胞培养物上清并且在搅拌下进行处理持续2.5小时。对于聚山梨酸酯20而言，最后浓度是0.5%并且对于TNBP而言，是0.03%。在TNBP/聚山梨酸酯20处理之后，过滤该细胞培养物上清。 

过滤 

在不超过1L/min下使用注射用热水（HWFI）来洗涤Cuno120ZA Filter Disc（3M,St.St.Paul,MN)持续至少10分钟。随后使用不低于2L的注射用冷水（CWFI）进行洗涤并且最后在20psi下进行空气干燥。使用不低于20psi的气压以及不大于1L/分钟的流量使TNBP/聚山梨酸酯20处理的细胞培养物上清通过该过滤器。取出等分部分用于取样并保留。 

阴离子交换色谱法 

该步骤用于捕获recA1PI并且除去在流过物（flow-through）中的宿主细胞蛋白（HCP）。使用了30cm内径×14cm床高（bed height）的柱子（10L柱床体积）。将TNBP/聚山梨酸酯20处理的细胞培养物上清的pH调回7.0±0.1。在柱加载之前测定溶剂/清洁剂处理的上清的电导率。在用在线稀释加载柱期间，测定周围WFI稀释液的量以确保电导率不高于4mS/cm。 

使用Unicorn程序（GE Healthcare Life Sciences）来运行Capto^TM Q柱子（GE Healthcare Life Sciences）并且将色谱系统的入口管线放置在适当的缓冲液罐中。每次色谱运行，更换Durapore0.3μm在线过滤器（Millipore）。使用1柱体积（CV）的0.5M冰醋酸预平衡Capto^TMQ柱，随后使用5CV的20mM Na₂HPO₄（pH6.0）平衡。通过用注射用水（WFI）进行在线稀释将细胞培养物上清加载到Capto^TM Q柱子上。对程序化的色谱滑动（chromatography skid）以进行编程便在电导率不超过4mS/cm下在300cm/h的线性流速下进行加载。加载随后短暂地追加WFI。在2CV重新平衡之前（使用20mM Na₂HPO₄，pH6.0）使用8CV的洗涤缓冲液（20mM Na₂HPO₄,20mM NaCl,pH6.0）洗涤该柱子。使用8CV的梯度（以25mM Na₂HPO₄,200mM NaCl,pH7.0结束）或通过逐步增加NaCl浓度来完成洗脱。在4CV进入梯度时开始收集recA1PI的单一洗脱峰并且在UV-警戒选通值（UV-watch gate）达到0.10AU时结束收集。对洗脱馏分取样用于检测和保留。以10mM浓度将L-半胱氨酸加入洗脱液集合中并允许在室温下混合过夜。 

使用Octyl Sepharose^TM FF的疏水作用层析 

使用8CV的HIC平衡缓冲液（25mM Na₂HPO₄,0.1M NaCl,1.75M硫酸铵,pH7.0）来平衡45cm内径×9cm床高的柱子（15L柱床体积）Octyl Sepharose^TM4FF疏水作用层析(HIC）柱（GE Healthcare Life Sciences）。在150cm/h的流速下使用辛烷基稀释缓冲液（25mM Na₂HPO₄,0.1M NaCl,3M(NH₄)₂SO₄,pH7.0）通过在线稀释来加载包含A1PI和半胱氨酸的Capto Q洗脱液，从而实现在加载物质中1.75M的(NH₄)₂SO₄的最终浓度。在加载之后，使用5CV的HIC平衡缓冲液洗涤柱子。在10CV内使用从处于洗涤缓冲液中1.75M硫酸铵至洗脱缓冲液（20mM Na₂HPO₄,pH6.0）的逆向盐梯度来完成洗脱。使用在前部为0.05AU并且在后部为0.10AU的UV吸光度警戒命令来收集洗脱液集合。 

HIC洗脱液的超滤和渗滤 

在40-50°C下使用WFI冲洗三个30kDa分子量截止(MWCO）0.1m²薄膜直到渗透物和保留物的pH在5至7之间。进料压力设置为25(例如，24至28范围）psig的目标值，而出口压力设置为5psig(例如，4至8psig的范围）。使用1-2L的HIC洗脱缓冲液来平衡该系统持续不少于10分钟。混合该HIC洗脱液并且将温度保持在15-25°C。当浓度达到30的A₂₈₀目标值时监测渗透液体积并且停止UF。在减少进料体积之后，使用6渗透体积（DV）的阳离子平衡缓冲液(10mM柠檬酸钠,pH5.4)进行渗滤。检查保留物的A₂₈₀以确保其≤30并且将该保留物排入干净的容器中。使用10–15psig的进料压力将两个1-L体积的阳离子平衡缓冲液各自再循环不少于5分钟。将该冲洗液与保留物结合。 

使用S薄膜的阳离子交换色谱法 

使用阳离子平衡缓冲液(10mM二水柠檬酸钠，pH5.4)来平衡具有2500cm²的薄膜表面积的S-薄膜一次性胶囊（Sartorius,Gottingen, Germany），以保证流出物的电导率不高于4mS/cm。使用蠕动泵在25L/h下将UF/DF处理的HIC洗脱液加载到S-薄膜上并且随后使用阳离子平衡缓冲液洗涤直到A₂₈₀不高于0.1AU。收集该流过液（flow-through）并且调节至pH7.0±0.1。 

纳米过滤 

使用具有PreFilter（0.11m²）的NFP（0.085m²；Millipore）进行纳米过滤。使用不超过50psi的压力罐通过恒压进行过滤。使用四个500mL体积的阳离子平衡缓冲液来冲洗纳米滤器。 

最终的超滤/渗滤 

在此步骤中使用具有0.3m²膜面积的10kDa MWCO薄膜。在40-50°C下使用WFI冲洗支架（holder）和薄膜直到渗透物和保留物的pH在5与7之间。进料进口压力设置为25psig（24至28psi的范围）的目标值，而出口压力设置为5psig（4至8psi的范围）。使用1-2L的20mM Na₂HPO₄，pH7.0来平衡该系统持续不小于10分钟。纳米过滤液被良好地混合并且将温度保持在15-25°C。针对recA1PI的损失，通过测量其在280nm（即，A280，其应当<0.04）下的吸光度定期的检查渗透物。如果该值过大，UF/DF停止。当浓度达到～30的A₂₈₀目标值时监测渗透液体积并且停止UF。随着进料体积的减少，使用5DV的渗滤缓冲液(20mM Na₂HPO₄,120mM NaCl,pH7.0)进行渗滤。检查保留物的A₂₈₀以确保其≤30并且将该保留物排入干净的容器中。计算渗滤缓冲液冲洗的量，当加入保留物时，该量将导致50-56mg/mL的最终浓度。该冲洗体积分成两半并且每个体积用不少于20psig的进料压力再循环3-5分钟。将该冲洗液与保留物结合。 

存储 

在最后的填充之前，将浓缩的大量的重组A1PI无菌过滤到袋子（Sartorius）中并在-70°C下保存。 

发现通过上述方法生产的recA1PI具有标志的黄颜色。黄色物质的身份是未知的。尽管该recA1PI是高度纯净并且具有活性，出于美学的原因期望去除该黄色着色剂。 

实施例3 

用α-1抗胰蛋白酶选择树脂进行免疫亲和层析 

完成A1PI-特异性免疫亲和柱以便确定该黄色物质是否与纯化的recA1PI分开。填装对于血浆得到的H1PI具有特异性的，α-1抗胰蛋白酶选择树脂（AAT-Select；GE Healthcare）的1.6cm内径×10cm床高的柱子（20mL柱体积）。使用20mM Tris·HCl，pH7.4来平衡该柱子。以5mL/分钟在该柱子上加载约200mg的recA1PI（10mg/mL）。使用20mM Tris·HCl，pH7.4，100mM NaCl洗涤该柱子并且使用的20mM Tris·HCl，pH7.4，2M NaCl（参见图3）进行洗脱。基于峰的分馏来收集馏分。使用Amicon UltraCel^TM30kDa MWCO浓缩器（EMD Millipore,Billerica,MA）来收集并且浓缩在洗脱峰下的馏分。从浓缩样品中获得UV-Vis光谱。 

在浓度之后该洗脱液是明显的黄颜色。当通过UV-Vis光谱分析时（参见图4），该光谱与在运行免疫亲和柱之前对于recA1PI所看到的非常相似。来自该结果的结论是免疫亲和色谱不能够从recA1PI中分离黄颜色。 

实施例4 

用Superdex^TM200树脂进行凝胶过滤色谱法 

也尝试用凝胶过滤实验（又名尺寸排阻色谱法；SEC）来除去recA1PI中的黄色物质。填装Superdex^TM200制备级树脂（GE Healthcare Life  Sciences）的1.6cm内径x90cm柱子（181mL的柱床体积）。使用磷酸盐缓冲盐水（PBS;12mM磷酸盐,pH7.4,137mM NaCl,2.7mM KCl）来平衡该柱子。以5%的柱体积（9mL）加载recA1PI并且在2mL/分钟（60cm/h）下运行。收集12mL体积的馏分用于分析。 

在图5中示出针对该柱子的色谱图。尽管，加载的是99%recA1PI，观察到分离峰，可能是由于UV检测器的饱和。通过UV-Vis分光光谱测量法分析在该峰下的馏分（图6）。recA1P馏分是明显的黄色并且这些馏分的UV-Vis光谱与填料相似。相应地，该凝胶过滤柱并不能除去recA1PI中的黄颜色。 

实施例5 

变性剂和还原剂分析 

由于免疫亲和和凝胶过滤色谱法并不能成功地除去recA1PI的黄颜色，因此寻找使用变性剂和/或还原剂作为除去或者减少黄颜色的潜在方法。 

约1mL的recA1PI与8M盐酸胍或者500mM DTT混合以便分别获得4M盐酸胍或者50mM DTT的最终浓度。第三个样品与两个试剂混合。样品在50°C下温育约2h并且单独地通过PD-10脱盐柱（GE Healthcare Life Sciences）。通过在1,000×g下离心5分钟来收集来自这些柱子的流过液（flow-through）。 

盐酸胍并不有助于减少并且这在样品的UV-Vis光谱中发映出来(图7)。与盐酸胍处理的样品相比，50mM DTT处理的样品有较浅的黄色。该样品在405nm下不具有光谱特征，这是针对recA1PI特征性观察（图7）。使用盐酸胍与DTT的组合处理的样品是接近无颜色的并且在300-400nm 范围内失去这些光谱特征。需要盐酸胍和DTT两者来减少黄颜色的事实可以表明该黄颜色物质共价结合至recA1PI。 

实施例6 

还原与凝胶过滤色谱法 

在DTT还原以及使用PD-10柱完成凝胶过滤色谱之后进行额外的实验。在此的目的是使用较长的柱子来获得DTT处理的样品的更好的分辨率并且处理更大量的还原recA1PI用于分析。 

制备了Superdex^TM200制备级树脂（GE Healthcare Life Sciences）的1.6cm内径x90cm床高（181mL的柱体积）的柱子。使用含有5mM DTT的PBS预平衡该柱子。在室温下以50mM浓度的DTT处理9mL体积的recA1PI样品过夜。将该样品加载到柱子上；该加载构成5%的柱体积并且在2mL/分钟（60cm/h）下运行该柱子。收集14.5mL的恒定体积馏分用于分析。使用Amicon UltraCel^TM30kDa MWCO旋转浓缩器（Millipore）收集适当的馏分并浓缩回到约50mg/mL。没有用DTT处理的对照样品也在相同的条件下进行。 

在图8中示出针对50mM DTT处理的样品的色谱图并且在图9中示出对照样品。在与DTT处理的样品一起在运行的SEC中发现明显较小的第二峰。使用30kDa MWCO旋转浓缩器收集包含recA1PI的馏分B1-B3并浓缩至约50mg/mL。通过UV-Vis分光光度法分析浓缩的样品。在图10中示出UV-Vis光谱，显示黄色初始物质、recA1PI的特征信号在来自还原的凝胶过滤的洗脱液的浓缩液中显著地减少。使用高度纯化的血浆得到的人类A1PI作为对照。 

实施例7 

DTT浓度分析 

通过与DTT一起温育recA1PI来分析DTT的较低浓度的效果（使用凝胶过滤色谱法纯化样品，然后获得浓缩的纯化样品的UV-Vis光谱）。使用Superdex^TM200制备级树脂（GE Healthcare Life Sciences）的1.6cm内径x90cm床高（181mL的柱体积）的柱子。使用含有5mM DTT的PBS预平衡该柱子。在室温下以合适浓度的DTT处理9mL体积的recA1PI过夜。该加载构成5%的柱体积并且在2mL/分钟（60cm/h）下运行该柱子。收集14.5mL的恒定体积馏分。使用30kDa MWCO旋转浓缩器收集适当的馏分并浓缩回到约50mg/mL。 

用10mM DTT与50mM DTT处理的样品的UV-Vis光谱显示针对减少黄颜色recA1PI的特征光谱信号10mM DTT浓度与50mM DTT浓度一样有效（图11）。 

实施例8 

在DTT处理的、凝胶过滤纯化的recA1PI上的生物分析学分析。 

MALDI TOF分析 

在recA1PI上完成飞行质谱实验的基质协助激光解吸/电离时间。期望的是通过DTT处理产生的小峰（具有黄色颜色）包含通过质谱可以确定的物质。然而，在这些样品中没有鉴定出任何东西。基质作用可以干扰100–10000Da范围内分子的电离。 

铁浓度 

怀疑铁离子是黄颜色可能的来源。在细胞培养物中铁是必需的过渡金属并且以柠檬酸铁铵（Fe_x(NH₄)_yC₆H₅0₇）的形式加入至上游细胞培养基中。铁分析显示与初始物质相比（具有66μM的铁），来自凝胶过滤柱的DTT还原的recA1PI的收集的馏分的铁含量减少了～30倍。参见图13。通过色谱图上的箭头指示的黄色物质具有来自加载量的～50%的铁。 

活性分析 

除了主峰馏分外，任何较小的峰馏分都没有recA1PI活性。 

实施例9 

DTT凝胶过滤分析 

在缺乏recA1PI的情况下单独使用DTT来完成色谱运行从而看到在没有recA1PI的情况下DTT的层析图。使用201mL的洗脱体积观察到单一峰（图12），该单一峰相应于在使用recA1PI样品运行的测试中看到的，相同洗脱体积的最后的峰。具有稍微黄颜色的馏分（与通过图13中箭头指示的峰对应）对于DTT处理的recA1PI样品是独特的，并且在仅用DTT运行的对照中并不存在。 

实施例10 

使用10mM DTT处理纯化血浆得到的A1PI 

检测具有黄色外观的血浆得到的A1PI产物来确定使用还原剂处理是否也导致类似的黄颜色的降低。以终浓度10mM使用DTT处理约50mg/mL的10mL等分部分的血浆得到的A1PI。如本文中描述的在Superdex^TM200制备级树脂上进行凝胶过滤色谱（GE Healthcare Life Sciences）。在图14中示出来自用DTT-处理的血浆得到的A1PI运行的色谱图。 

在主峰下相应于recA1PI的馏分被收集并且浓缩至50mg/mL。样品的颜色与未处理的样品相同。这表明细胞培养物得到的recA1PI的黄颜色的来源与血浆得到的A1PI不同。 

实施例11 

半胱氨酸作为还原剂的分析 

半胱氨酸作为可替换的还原剂进行检测，因为半胱氨酸便宜且容易得到。另外，作为氨基酸，半胱氨酸是可接受的赋形剂。完成实验，其中使用10mM的半胱氨酸来处理等分部分的recA1PI并且在凝胶过滤柱上进行处理。在图15中示出针对该运行的色谱图。将对应于recA1PI的馏分收集并且浓缩至50mg/mL。作为还原剂半胱氨酸也是可接受的。 

实施例12 

颜色分析 

在可比较的蛋白浓度(～50mg/mL)下，用10mM浓度的DTT或半胱氨酸处理的样品的颜色比较显示黄颜色的显著减少。随后A₂₈₀/A₄₀₅比值作为样品黄色的指示，基本原理是在405nm处溶液的吸光度是黄颜色的定量测量。样品较高的A₂₈₀/A₄₀₅比值对应于较浅的黄颜色。通过使用DTT或者半胱氨酸进行处理，很大程度上除去未处理样品的明显的黄颜色。然而，黄颜色的去除并不完全并且在处理的样品中保留少量黄色。A₂₈₀/A₄₀₅比值良好地跟随这种趋势并且在使用还原剂处理之后通常看到3倍的减少。高度纯化的血浆得到的A1PI实际上清楚地具有428的A₂₈₀/A₄₀₅比值。 

重组细胞培养物得到的A1PI活性恢复 

来自使用尺寸排阻色谱法以及用从80–100%范围的还原剂处理的实验的recA1PI活性恢复(参见表1）。 

铁含量 

在使用还原剂处理和色谱纯化之后处理的样品的铁浓度显著地降低。使用感应耦合等离子体原子吸收光谱法(ICP-AA）分析还原和纯化的样品。当与未处理的样品相比较时，离子浓度减少程度范围从约14倍（针对半胱氨酸处理的样品）至27倍（针对10mM DTT处理的样品）（表2）。 

实施例13 

改进的recA1PI纯化过程：在阴离子交换色谱法之后进行还原剂添加以及温育 

图16示出了改进的recA1PI纯化过程的流程图，其中将半胱氨酸加入收集的阴离子交换洗脱液中。进行该改进的过程。在溶剂/清洁剂病毒失活步骤之后，在300cm/h下在5cm内径×25cm床高（500mL）Capto^TM Q柱（GE Healthcare Life Sciences）上纯化细胞培养物上清，具有11.2Kg的质量。该柱子在20mM Na₂HPO₄，pH6.0的中平衡；使用20mM Na₂HPO₄、20mM NaCl，pH6.0洗涤；并且在8CV内使用25mM Na₂HPO₄、200mM NaCl，pH7.0洗脱。Q-洗脱液的A₂₈₀是2.4，对应于约2g/L的效力（potency）。使用10mM半胱氨酸（Acros Chemicals;Thermo Fisher Scientific;New Jersey）处理按活性计包含约1g的recA1PI的500mL等份部分的该Q-洗脱液，并且在室温下温育过夜（～25°C大约16h）。使用HIC稀释缓冲液（25mM Na₂HPO₄、100mM NaCl、3M(NH₄)₂SO₄，pH7.0）以42：58稀释该处理的样品，并且用于加载Octyl Sepharose^TM柱子（尺寸为5cm内径×10.3cm床高(202mL柱床体积）。使用25mM Na₂HPO₄、100mM NaCl、1.75M(NH₄)₂SO₄，pH7.0平衡该柱子，并且在10CV内使用20mM Na₂HPO₄，pH6.0的梯度洗脱。使用LabScale^TMTFF系统和30kDa，3×50cm²滤器(Millipore)将620mL的洗脱液体积浓缩至50mL。在4°C下，通过在3,500rpm下离心，使用Amicon UltraCel^TM30kDa MWCO浓缩器（Millipore）将样品进一步浓缩至50mg/mL。然后将该浓缩样品通过在10mM柠檬酸钠缓冲液（pH5.4）中平衡的S-膜胶囊(Sartorius,Gottingen,Germany）。针对5-柱体积的PBS渗滤该样品。 

在没有半胱氨酸的情况下，还使用相同体积的Q-洗脱液进行对照运行并且以相同的方式在HIC柱上处理。对照与半胱氨酸处理的检测样品的HIC色谱曲线是可比较的（参照图17与图18）。这表明加入半胱氨酸并不 改变在疏水作用柱上recA1PI的纯化曲线。当将样品浓缩至约50mg/mL时，观察到黄颜色显著地减少，这对应于A₂₈₀/A₄₀₅比值以3.4倍的提高（即，73相对于245）。UV-Vis光谱也反映这种差别，其中半胱氨酸处理的样品的曲线可与高度纯化的血浆得到的A1PI相比较；参见图19。 

因此，在清除黄颜色方面，阴离子交换柱与疏水作用层析(参见图16）之间的半胱氨酸过夜温育在制备规模的运行方面产生与小型规模实验可比较的结果，并且相应地提高A₂₈₀/A₄₀₅比值。 

本文中所描述的条件、方法、过程、和装置的范围包括本文中所描述的实施方式、方面、实施例、步骤、和优选方案的所有组合。