一种太空蜡状芽孢杆菌株LCT-BC25

摘要

一种空间菌株蜡状芽孢杆菌LCT-BC25，更具体的说是一种太空微生物，运用空间技术获得。其特征：蜡状芽孢杆菌LCT-BC25是一种革兰氏阳性杆菌，具有芽孢，对阿米卡星的耐药性出现了增强。在基因组、转录组和蛋白组学层面对其进行详尽阐明，证实LCT-BC25的全基因组序列总长度为5,154,512bp，具有5,263个编码基因；有310个上调基因和996个下调基因，并证实这些基因的生物学功能主要与细胞生长和修复的生理学过程有关；有57个上调表达的蛋白和77个下调表达的蛋白，并证实差异表达蛋白的功能主要是与糖类代谢脂类代谢和氨基酸代谢相关。

说明书

技术领域

本发明属于微生物及生物技术领域，涉及一种新的微生物菌株蜡状芽孢杆菌LCT-BC25以及其生物学特性、基因组DNA序列，利用生物信息学技术进行了转录组和差异蛋白组学分析，获得其在基因组、转录组及蛋白组的特性。 

背景技术

随着人类空间探索活动的日益频繁，宇宙空间成为了人类活动的一个重要领域。微生物是自然环境中的一部分，其存在于空气、水、土壤等生物圈的各个部分。人类的空间活动不可避免的将微生物带上了宇宙空间。尽管外层空间具有极端和复杂的环境，这些微生物都能够适应这些诸如微重力、宇宙射线、温度、压力等的改变并表现出相应的形态和生理学的变化。尤其是有研究证实在模拟微重力条件下培养的鼠伤寒沙门氏菌对小鼠感染的毒力会增强；肺炎链球菌等机会致病菌在模拟微重力条件下毒力增强。目前，在空间站中已检测出包括肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、沙雷氏菌、蜡状芽孢杆菌和肠球菌等多种细菌。对这些细菌进行深入研究有助于了解空间环境对这些细菌的影响极其致病力和耐药性的改变机制，为载人航天提供医学保障基础。 

蜡样芽胞杆菌是革兰氏阳性杆菌，好氧或兼性厌氧并能够形成孢子。蜡状芽孢杆菌是一种条件致病菌，其能够产生相关导致呕吐的毒素和三种不同的肠毒素，引起呕吐综合征和腹泻病造成食物中毒，是一种潜在的会导致宇航员急性胃肠道疾病的重要致病菌。尤其是空间飞行时，航天员所携带的食物大多是由从地球出发前制作的罐头食品，极容易受蜡状芽孢杆菌污染。 

既往针对蜡样芽胞杆菌生物学特性及用途等研究均局限于地面，对空间环境下蜡样芽胞杆菌的研究尚未见报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种太空蜡状芽孢杆菌菌株LCT-BC25。对空间菌株进行表型检测，然后对其进行全基因组测序，并结合转录组学和蛋白组学阐明该细菌的特性及用途。 

本发明提供的菌株蜡状芽孢杆菌LCT-BC25，其保藏号为CGMCCNo.6515。 

所述的蜡状芽孢杆菌LCT-BC25，革兰氏阳性杆菌，具有芽孢，菌体单个或者成双排列蜡状芽孢杆菌LCT-BC25对阿米卡星的耐药性出现了明显的增强。 

所述的蜡状芽孢杆菌LCT-BC25，全基因组序列包含43个contigs，7个scaffolds，长度为5,154,512bp，平均GC含量为35.31％，预测出5,263个编码基因。 

所述的蜡状芽孢杆菌LCT-BC25，转录组与对照组比较有310个上调基因和996个下调基因，并证实这些基因的生物学功能主要与细胞生长和修复的生理学过程有关。 

所述的蜡状芽孢杆菌LCT-BC25，转录组与对照组比较57个上调表达的蛋白和77个下调表达的蛋白，并证实差异表达蛋白的功能主要是与糖类代谢脂类代谢和氨基酸代谢相关。 

附图说明

图1蜡状芽孢杆菌LCT-BC25的biolog生化特征 

图2蜡状芽孢杆菌LCT-BC25与地面对照株的生长曲线 

图3蜡状芽孢杆菌LCT-BC25的转录组基因覆盖度统计 

图4蜡状芽孢杆菌LCT-BC25的转录组差异表达基因 

图5蜡状芽孢杆菌LCT-BC25的蛋白组差异表达蛋白 

具体实施方式

下述实施实例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 

下述实施实例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。 

一、蜡状芽孢杆菌LCT-BC25的表型 

1.菌种选择：蜡状芽孢杆菌LCT-BC25来源于中国普通微生物菌种保 藏中心，保藏号为CGMCC NO.6515。 

2.形态学：原样品进行稀释涂布，进行革兰氏染色。蜡状芽孢杆菌LCT-BC25为革兰氏阳性杆菌，具有芽孢，菌体单个或者成双排列。 

3.蜡状芽孢杆菌LCT-BC25菌株16s rDNA鉴定 

16S rDNA是16S rRNA序列的基因，长约1.5kb。将已分纯的单菌直接经菌液PCR扩增16S rDNA，部分通过菌液PCR较难扩增的单菌经扩大培养后提取基因组后扩增，扩增所用引物序列如下： 

SgF：AGAGTTTGATCATGGCTCAG 

SgR：TAGGGTTACCTTGTTACGACTT 

16S rDNA PCR产物用96孔millpore纯化系统纯化后准确定量，经ABl3730xl全自动序列分析仪测序，测序结果使用Sequence scanner、Seqman等序列分析软件，将两向测序结果去掉首尾不可信序列后拼接，余下的约1350bp(双向测序)即用于同源性分析。所得16S rDNA序列在Eztaxonserver2.1数据库中进行比对，确定菌株大致的分类地位。所有单菌16S序列全部导入seqman，输出single file(fasta)后，经Mega5.0软件clusterW多重比对，输出meg文件重新导入构建Neighbor-Joining tree。其中，phylogeny test method为bootstrap参数设置为1000。16s rDNA鉴定结果显示LCT-BC25与Bacillus cereus ATCC14579(T)的相似性为99％。 

4.耐药性检测：配制菌悬液后稀释涂布，粘贴药敏片，选择的抗生素为青霉素G、氨苄青霉素、头孢唑林、复达欣(头孢他啶)(头孢噻甲羧肟)、菌必治(头孢三嗪)、阿奇霉素(泰力特)、环丙沙星(奔克)(悉复欢)(丙氟哌酸)、洁霉素(林可霉素)、万古霉素、复方新诺明、氯霉素、舒普深(先锋必/舒巴坦)、丁胺卡那(阿米卡星)、链霉素、美满霉素(二甲胺四环素)(米诺环素)、美罗培南、哌拉西林/他唑巴坦(特治星)。培养24h后观察抑菌圈大小。结果证实与地面对照株相比较，蜡状芽孢杆菌LCT-BC25对阿米卡星的耐药性出现了明显的增强，其抑菌图大小为1.3cm(地面为2.6cm)。 

5.溶血试验：采用点种法，将太空株和地面株点种于同一血琼脂培养基上，培养温度37℃，培养24小时后观察结果显示LCT-BC25无溶血圈出现。 

6.生化代谢(Biolog)实验：制备菌悬液，接种至Biolog96孔板，37℃培养24-48h观察结果(见图1)。该菌株生化代谢较地面株差别较大如表1。 

表1蜡状芽孢杆菌LCT-BC25的biolog生化特征 

注：+表示阳性；-表示阴性；W表示弱阳性； 

Y代表黄色；B表示蓝色；R表示棕色。 

7.生长曲线测定：菌株活化后接种至100孔蜂窝板中，在Bioscreen中进行生长曲线的测定，测定24h，读取数据。将所得到的OD值进行平均值的计算，然后绘制曲线。蜡状芽孢杆菌空间菌株LCT-BC25与地面对照菌株比较，其生长曲线出现明显的差异，见图2。 

二、蜡状芽孢杆菌空间菌株LCT-BC25全基因组测序 

采用高通量Solexa测序技术对该样品的DNA进行Paired-End测序。首先提取细菌的基因组DNA，离心方法收集蜡状芽孢杆菌LCT-BC25菌体，经过重悬、裂解、酚氯仿抽提、异丙醇沉淀、75％乙醇洗涤、RNase去除RNA和溶解基因组DNA等步骤获得LCT-BC25的基因组DNA，并检测其纯度使之符合建库指标。采用超声法Covaris将大片段基因组DNA随机打断并产生一系列DNA片段；然后用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4PNK将打断形成的粘性末端修复成平末端，再通过3′端加碱基“A”，使得DNA片段能与3′端带有“T”碱基的特殊接头连接，用电泳法选择需回收的目的片段连接产物，再使用PCR技术扩增两端带有接头的DNA片段；建立350bp的小片段文库和6000bp的大片段文库。对测序得到的原始数据进行过滤及统计；运用SOAP denovo V1.05软件和SOAPaligner/soap2软件对处理后的reads数据进行组装。并对基因组和基因区覆盖度进行评价；采用Glimmer3.0软件从组装结果中获得基因序列并将基因的序列与各数据库进行比对，得到对应的功能注释信息。LCT-BC25的全基因组鸟枪法测得序列总长度为5,154,512bp，平均GC含量为35.31％。其序列包含43个contigs，能够组装成为7个scaffolds。用Glimmer version3.02软件预测出5,263个编码基因。 

对该菌株的序列进行SNP分析证实，蜡状芽孢杆菌LCT-BC25有三个SNP。分别是UWlGL004655，UWlGL005074，UWlGL005263。然而，其中两个为基因间区SNP，一个为同义SNP。此同义SN P的的功能与糖代谢和氨基酸代谢相关，见表2。 

表2蜡状芽孢杆菌空间菌株LCT-BC25的SNP分析 

三、蜡状芽孢杆菌空间菌株LCT-BC25的转录组 

提取样品总RNA后，用试剂盒去除rRNA后用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。加入fragmentation buffer将mRN A打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase l合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina HiSeq2000进行测序。结果显示基因覆盖度在60％的基因有3,919个占全部基因的81％(如图3)。使用RPKM法(Reads Per Kb per Million reads)对基因进行表达量的计算，其公式为： 

$\mathrm{RPKM}=\frac{{10}^{6}C}{\mathrm{NL}/{10}^3}$

依据各个基因的表达量，根据大于2倍为具有差异表达的基因。结果有310个上调基因和996个下调基因(如图4)。对这些基因进行GO功能富集分析显示，具有明显差异表达的基因的生物学功能主要与细胞生长和修复的生理学过程有关(P＝0.04876)。对这些基因进行通路富集分析证实其差异表达基因与氧化磷酸化作用有很重要的联系。 

四、蜡状芽孢杆菌空间菌株LCT-BC25的蛋白质组学 

我们利用iTRAQ相对定量技术对空间蜡状芽孢杆菌和地面对照株进行蛋白质组学研究。首先，从样品中提取蛋白，对提取后的蛋白样品进行还原烷基化处理，打开二硫键以便后续充分酶解蛋白。用GE公司的2D quantkit法进行蛋白质的浓度测定。等体积进行SDS(十二烷基磺酸钠)电泳。使用胰蛋白酶酶解蛋白成为肽段。使用iTRAQ试剂标记肽段。将标记后的肽段进行等量混合对混合后的肽段使用强阳离子交换色谱(Strong CationExchange Choematography，SCX)进行预分离进行液相串联质谱 (LC-MS/MS)分析。对于质谱下机的原始文件，进行峰识别，得到峰列表。其次建立参考数据库，进行肽段及蛋白质的鉴定。共鉴定到1269个蛋白，对这些蛋白进行功能分析证实代谢过程(40.75％)、细胞的生长和修复(33.04％)、对刺激的反应(5.02％)、定位(4.8％)的功能有关。最后比较各蛋白在各样品之间的相对含量的关系，当满足蛋白丰度差异倍数1.2倍以上且统计检验值P-value小于0.05时，从而获得差异表达的蛋白。结果得到57个上调表达的蛋白和77个下调表达的蛋白(图5)。对这些差异表达的基因进行GO功能富集分析证实这些差异蛋白主要是与糖类代谢脂类代谢和氨基酸代谢相关(表3)。对这些差异表达的基因进行pathway富集分析证实经空间飞行后蜡状芽孢杆菌最重要的变化是糖酵解/糖异生通路的变化最为显著。 

表3蜡状芽孢杆菌空间菌株LCT-BC25差异表达蛋白的富集功能分析 

本发明的特点和应用价值：本研究是我国第一次利用自己研发的空间技术获得空间蜡状芽孢杆菌LCT-BC25。为了探索发生这些变化的机制，我们对这一突变株进行了基因组测序、转录组测序和蛋白质组测序。这有助于深入探讨空间效应对微生物的影响。同时，这一菌株的序列已经测通，为揭示这些潜在的生物学变化提供了可能。我们将基因组、转录组和蛋白组贯穿起来研究能够更好地揭示相关细菌致病力和耐药性的变化机制，为我国载人航天事业奠定基础。 

关于保藏的LCT-BC25菌株的说明 

A.菌种的保藏单位名称和地址 

名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所 

B.交机构保藏的日期 

2012年9月5日 

C.保藏机构给予的保藏号 

CGMCC No.6515 

D.分类命名 

蜡状芽孢杆菌Bacillus Cereus。