中药吐根及其制剂高效液相色谱指纹图谱的建立方法及指纹图谱

摘要

本发明首次建立了中药吐根及其制剂高效液相色谱指纹图谱的建立及指纹图谱，属于医药技术领域，包括如下步骤：(1)对照品溶液的制备；(2)供试品溶液的制备；(3)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相以乙腈-0.4％的1-庚烷磺酸钠溶液(醋酸调pH至4.0)梯度洗脱，柱温为45℃，流速为1.0ml/min，紫外检测波长为205nm；(4)测定本发明的有益效果在于：以吐根的有效特征成分盐酸吐根碱为对照，采用高效液相色谱法建立了吐根的标准指纹图谱，能有效、准确的监控吐根及其制剂的质量，方法具有简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及中药吐根及其制剂高效液相色谱指纹图谱的建立方 法及指纹图谱。

背景技术

吐根为茜草科植物Cephaelis ipecacuanha(Brot.)A.Rich.或Cephaelis acuminate Karsten 的干燥根茎，原产于巴西，在其他热带气候地区也有栽培；具有止咳化痰、催吐、抗阿米巴 病等功效；有研究表明其主要药理活性成分为生物碱类化学成分。目前吐根药材、吐根粉和 吐根糖浆的质量标准在美国药典、日本药典和欧洲药典均有收载。各国药典中多以吐根碱和 吐根酚碱的含量做为吐根药材及其制剂的主要质量评价指标，其中在美国药典及欧洲药典中 主要是采用示差折光光度法检测吐根碱和吐根酚碱的含量、采用酸碱滴定的方法测定总生物 碱的含量；日本药典(JP16)则采用了高效液相色谱法检测吐根碱和吐根酚碱的含量。但是， 吐根作为一种中草药，其药效并不是来自任何单一的活性成分，其药效作用应是多种活性成 分共同协作的结果。因此，对于吐根及其制剂目前多采用吐根碱和吐根酚碱成分进行质量控 制的方法并不能准确全面反映产品的内在质量。

发明内容

为简便、快捷、科学、准确、多指标控制吐根药材及其制剂的质量，本发明提供了中药 吐根及其制剂高效液相色谱指纹图谱的建立方法及指纹图谱，通过获取中药吐根及其制剂的 高效液相色谱(HPLC)指纹图谱，以有效的控制中药吐根及其制剂的质量，保证临床疗效及 安全用药。

本发明中药吐根及其制剂高效液相色谱指纹图谱的建立方法及指纹图谱，所采用的步骤 包括如下：

(1)对照品溶液的制备

精密称取盐酸吐根碱对照品，用甲醇制成每1ml含盐酸吐根碱10-30μg的溶液，作为对 照品溶液。

(2)供试品溶液的制备

取吐根粉末，置于容量瓶中，加体积比为1∶200的盐酸-60％甲醇水溶液，密塞，静置 浸润，超声处理，放冷后，加甲醇定容至刻度，摇匀，离心，取上清即得供试品溶液；或取 吐根制剂置容量瓶中，加甲醇水溶液溶解并定容，摇匀，离心，取上清即得供试品溶液。

进一步优化为：取吐根粉末0.1-0.5g，置于50-100ml容量瓶中，加体积比为1∶200的盐 酸-60％甲醇水溶液，密塞，静置浸润，超声处理，放冷后，加甲醇定容至刻度摇匀，离心， 取上清即得供试品溶液；或取吐根制剂0.2-1ml，加30-70％甲醇水溶液溶解并定容至50-100ml， 摇匀，离心，取上清即得供试品溶液。

更优化为：取吐根粉末0.25g，置于100ml容量瓶中，加体积比为1∶200的盐酸-60％甲 醇水溶液，密塞，静置浸润30分钟后，以功率250w，频率40kHz超声处理，放冷后，加甲 醇定容至刻度摇匀，离心，取上清即得供试品溶液；或取吐根制剂0.5ml，加60％甲醇水溶液 溶解并定容至100ml；摇匀，离心，取上清即得供试品溶液。

(3)色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相以乙腈-0.4％的1-庚烷磺酸钠溶液(醋 酸调pH至4.0)梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1，柱温为45℃，流速为1.0ml/min，紫外检测 波长为205nm，；理论板数按盐酸吐根碱峰计算应不低于3000；

表1：乙腈-0.4％的1-庚烷磺酸钠溶液(醋酸调pH至4.0)梯度洗脱

(4)测定

精密吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按上述(3)中色谱条件测定，即得指纹图 谱。

优选为：精密吸取各供试品溶液5-25μl，注入高效液相色谱仪，按上述(3)中色谱条件 测定，即得吐根指纹图谱。

更优选为：精密吸取各供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，按上述(3)中色谱条件 测定，即得吐根指纹图谱。

(5)标准指纹图谱的制定

采用中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件对各吐根药材供试品的指纹图谱进行分析， 生成吐根药材标准对照指纹图谱。

(6)相似度计算

取吐根样品，按步骤(2)至(4)同法操作，得到吐根样品指纹图谱，采用中药色谱指 纹图谱相似性评价系统软件对所述样品指纹图谱与吐根标准指纹图谱进行比对分析，计算相 似度。

中药吐根及其制剂高效液相色谱指纹图谱的建立方法，所述的其制剂指含吐根的液体、 或固体制剂，例如吐根流浸膏、吐根浸膏、吐根酊剂等。

中药吐根及其制剂高效液相色谱指纹图谱的建立方法，所述的吐根流浸膏每lml相当1g 生药材。

所述步骤(2)中离心条件为12000r/min离心10～15min。

所述步骤(5)中相对保留时间计算公式为：相对保留时间＝其他各组分峰的保留时间/ 参照峰的保留时间。

所述步骤(5)中相对峰面积计算公式为：相对峰面积＝其他各组分峰的峰面积/参照峰 的峰面积。

所述步骤(5)中相对保留时间：1号峰(0.116～0.124)，2号峰(0.135～0.142)，3号峰 (0.195～0.201)，4号峰(0.221～0.229)，5号峰(0.285～0.291)，6号峰(0.348～0.356)，7号 峰(0.496～0.504)，8号峰(0.790～0.798)，9号峰(0.811～0.819)，10(0.882～0.891)，11号 峰(1.000)；

所述步骤(5)中相对峰面积：1号峰(0.017～0.078)，2号峰(0.008～0.030)，3号峰 (0.011～0.045)，4号峰(0.013～0.020)，5号峰(0.710～1.421)，6号峰(0.066～0.082)，7号 峰(0.019～0.071)，8号峰(0.008～0.035)，9号峰(0.004～0.049)，10号峰(0.201～2.522)， 11号峰(1.000)；

步骤(6)中所述计算相似度是指将中药吐根或其制剂的供试品溶液指纹图谱与标准图谱 比对，其相似度应在0.90～1.00之间。

本发明所述指纹图谱的建立方法，采用国家药典委员会制定的《中药指纹图谱相似度计 算软件》(2004)，经过多点校正，色谱峰的匹配，计算供试品溶液指纹图谱与制定的标准指 纹图谱的相似度；指纹图谱相似度计算参数设置为：时间宽度为0.5；校正方式采用多点校正， 校正色谱峰的匹配点为共有峰，5号峰(0.285～0.291)，10号峰(0.882～0.891)，11号峰(1.000)。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(1)本发明首次建立了中药吐根及其制剂高效液相色谱指纹图谱的建立方法及指纹图 谱，有利于对吐根药材及及其制剂进行全面监控产品的质量，为吐根药材及及其制剂的质量 控制提供可靠的依据，从而快速、准确地鉴别吐根药材及及其制剂的优劣。

(2)采用本发明的高效液相色谱指纹图谱的建立方法，保证吐根及其制剂的质量的均一、 稳定、可控，方法而且具有简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。

附图说明

图l为本发明吐根指纹图谱精密度考察结果。

图2为本发明吐根指纹图谱稳定性考察结果。

图3为本发明吐根指纹图谱重现性考察结果。

图4为盐酸吐根碱对照品色谱图。

图5为本发明所述吐根药材的10批样品指纹图谱。

图6为本发明所述吐根的标准指纹图谱。

图7为本发明所述吐根流浸膏的指纹图谱。

具体实施方式

实施例1：中药吐根标准指纹图谱建立

1.1仪器、试剂与材料

1.1.1仪器：Agilent1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；Agilent1260二级管阵列 检测器(美国安捷伦公司)；Agilem化学色谱工作站(美国安捷伦公司)；超声仪；离心机； 十万分之一天平；万分之一天平；中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版。

1.1.2试剂：乙腈为色谱纯，盐酸，甲醇，1-庚烷磺酸钠等为分析纯，超纯水。

1.1.3材料：盐酸吐根碱对照品；10批吐根药材

1.2对照品溶液的制备

取盐酸吐根碱适量，精密称定，置棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，制成每1ml 含盐酸吐根碱10-30μg的溶液，即得。

1.3供试品溶液的制备

取吐根粉末0.25g，置于100ml容量瓶中，加体积比为1∶200的盐酸-60％甲醇水溶液， 密塞，静置浸润30分钟后，以功率250w，频率40kHz超声处理，放冷后，加甲醇定容至刻 度摇匀，离心，取上清即得供试品溶液

1.4色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相以乙腈-0.4％的1-庚烷磺酸钠溶液(醋 酸调PH至4.0)梯度洗脱，梯度洗脱见下表2；柱温为45℃；流速为1.0ml/min；紫外检测 波长为205nm；

表2.乙腈-0.4％的1-庚烷磺酸钠溶液(醋酸调pH至4.0)梯度洗脱程序

1.5方法学考察

1.5.1精密度试验

取批号为1的吐根药材，按上述方法制备供试品溶液，在上述液相色谱条件下，重复进 样6次，以盐酸吐根碱为参照峰，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值的一致 性。本试验色谱指纹图谱的相似度不小于0.950，单峰面积大于或等于5％的主要色谱峰，其 相对保留时间和相对峰面积的RSD小于3％，表明试验仪器精密度良好(图1)。

1.5.2稳定性试验

取批号为1的吐根药材，按上述方法制备供试品溶液，在上述液相色谱条件下，分别在 0、2、4、8、12、24小时检测指纹图谱，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值 的一致性。本试验色谱指纹图谱的相似度不小于0.950，单峰面积大于或等于5％的主要色谱 峰，其相对保留时间和相对峰面积的RSD小于3％，表明供试品溶液在24小时内稳定(图2)。

1.5.3重现性试验

取批号为1的吐根药材6份，按上述方法制备供试品溶液，在上述液相色谱条件下，进 样分析，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值的一致性。本试验6份供试品溶 液色谱指纹图谱的相似度不小于0.950，单峰面积大于或等于5％的主要色谱峰，其相对保留 时间和相对峰面积的RSD小于3％，表明方法重现性好(图3)。

1.6样品测定

精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，按照上述色谱 条件进行测定，记录色谱图(对照品溶液色谱图见图4、供试品溶液色谱图见图5)。

1.7标准指纹图谱的建立

采用相对保留时间标定共有指纹峰，比对对照品的色谱图和计算相对保留时间，其中有 11个峰确定为共有峰，其中11号峰为盐酸吐根碱峰。利用“中药色谱指纹图谱相似度评价 软件”，生成吐根药材共有模式对照指纹图谱(图6)。并依据“中药注射剂指纹图谱研究的 技术要求”，制定了吐根的标准指纹图谱技术参数。以盐酸吐根碱为内参照峰，计算各共有 峰的相对保留时间和相对峰面积。

相对保留时间：1号峰(0.116～0.124)，2号峰(0.135～0.142)，3号峰(0.195～0.201)，4 号峰(0.221～0.229)，5号峰(0.285～0.291)，6号峰(0.348～0.356)，7号峰(0.496～0.504)， 8号峰(0.790～0.798)，9号峰(0.811～0.819)，10(0.882～0.891)，11号峰(1.000)；

相对峰面积：1号峰(0.017～0.078)，2号峰(0.008～0.030)，3号峰(0.011～0.045)，4 号峰(0.013～0.020)，5号峰(0.710～1.421)，6号峰(0.066～0.082)，7号峰(0.019～0.071)， 8号峰(0.008～0.035)，9号峰(0.004～0.049)，10号峰(0.201～2.522)，11号峰(1.000)；

1.8相似度评价

采用国家药典委员会制定的用于生成共有模式的“中药指纹图谱相似度计算软件2004A 版”，设置时间宽度为0.5，进行多点校正，校正色谱峰的匹配点为共有峰，5号峰 (0.285～0.291)，10号峰(0.882～0.891)，11号峰(1.000)，再经过色谱峰的匹配，计算10 批吐根药材的相似度，结果见表3。

表310批吐根药材的相似度结果

  S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 对照 S1 1 0.978 0.817 0.942 0.94 0.977 0.964 0.836 0.992 0.974 0.985 S2 0.978 1 0.791 0.986 0.979 0.956 0.996 0.812 0.996 0.999 0.993 S3 0.917 0.991 1 0.990 0.960 0.969 0.949 0.983 0.906 0.976 0.952 S4 0.942 0.986 0.690 1 0.996 0.908 0.995 0.720 0.973 0.990 0.962 S5 0.94 0.979 0.660 0.996 1 0.904 0.989 0.693 0.967 0.982 0.953 S6 0.977 0.956 0.869 0.908 0.904 1 0.942 0.887 0.968 0.948 0.978 S7 0.964 0.996 0.749 0.995 0.989 0.942 1 0.777 0.988 0.998 0.983 S8 0.936 0.912 0.983 0.920 0.993 0.987 0.977 1 0.927 0.999 0.972 S9 0.992 0.996 0.806 0.973 0.967 0.968 0.988 0.827 1 0.994 0.995 S10 0.974 0.999 0.776 0.99 0.982 0.948 0.998 0.799 0.994 1 0.989 对照 0.985 0.993 0.852 0.962 0.953 0.978 0.983 0.872 0.995 0.989 1

实施例2：吐根流浸膏指纹图谱的测定

2.1仪器、试剂与材料

2.1.1仪器：Agilent1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；Agilent1260二级阵列检 测器(美国安捷伦公司)；Agilent化学色谱工作站(美国安捷伦公司)；超声仪；离心机；十 万分之一天平；万分之一天平；中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版。

2.1.2试剂：乙腈为色谱纯，盐酸，甲醇，1-庚烷磺酸钠等为分析纯，超纯水。

2.1.3材料：盐酸吐根碱对照品；吐根流浸膏

2.2对照品溶液的制备

取盐酸吐根碱适量，精密称定，置棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成每1ml含盐 酸吐根碱10-30μg的溶液，即得。

2.3供试品溶液的制备

取两批吐根流浸膏各0.5ml，分别置棕色容量瓶中，分别加60％甲醇水溶液溶解并定容至 100ml，将定容后溶液离心后取上清即得供试品溶液。

2.4色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相以乙腈-0.4％的1-庚烷磺酸钠溶液(醋 酸调pH至4.0)梯度洗脱，梯度洗脱程序见表2；柱温为45℃；流速为1.0ml/min；紫外检测 波长为205nm；

2.5样品测定

精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，按照上述色谱 条件进行测定，记录色谱图(图7)。

2.6结果与分析

运用“中药指纹图谱相似度计算软件2004B版”，导入实施例1中建立的吐根标准指纹 图谱，然后导入两批吐根流浸膏的指纹图谱，进行多点校正，校正色谱峰的匹配点为共有峰， 5号峰(0.289～0.366)，10号峰(0.887～1.129)，11号峰(1.000)；设置匹配时间漂移为0.5， 然后经过色谱峰的匹配，计算两批吐根流浸膏与吐根标准指纹图谱的相似度，结果见表4。 由表4可知，得到的两批吐根流浸膏的指纹图谱与吐根标准指纹图谱的相似度均大于0.9，表 明该方法能准确地表征吐根制剂的质量，且与传统方法比较，该方法更有利于全面监控产品 的质量，为药品的质量检测提供更可靠的依据。

表4吐根流浸膏的相似度结果