一种多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法的建立方法及其应用

摘要

本发明涉及涉及一种多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法的建立方法及其在多杀性巴氏杆菌疫苗效力检验中的应用。该方法以多杀性巴氏杆菌荚膜抗原中的多糖含量为依据，通过筛选间接血凝试验中抗原最佳稀释度，建立敏感性、重复性好的稳定的多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法，采用该试验法检测疫苗免疫动物血清的间接血凝效价，探索血清间接血凝效价与免疫后强毒攻毒保护率之间的平行关系，并应用于多杀性巴氏杆菌疫苗的效力检验。

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品检验技术领域，涉及一种多杀性巴氏杆 菌间接血凝试验法的建立方法及其在多杀性巴氏杆菌疫苗效力检验 中的应用。

背景技术

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)是一类能引起多种 畜禽、宠物、野生动物及人类感染的人畜共患病原菌。研究报道，该 病原菌广泛流行于世界各地，无宿主特异性，可通过相互接触经呼吸 道进行水平和垂直传播；Davies等2004年报道该菌甚至可以在不同 的宿主间发生种间传播。在我国，引起畜禽巴氏杆菌病的主要病原是 荚膜血清A型Pm，其次为荚膜血清D型Pm，引起牛巴氏杆菌病的 主要病原是荚膜血清B型Pm，荚膜血清B型也能引起牛发生肺炎。

在抗生素耐药性日益严重的情况下，对巴氏杆菌病的控制更依赖 于多杀性巴氏杆菌疫苗。到目前为止，我国已有禽、兔、猪和牛的多 杀性巴氏杆菌灭活(或活)疫苗，均具有良好的临床效果，为畜禽巴 氏杆菌病的控制起到了积极的作用。

但是，现有技术中，疫苗的效力检验均为免疫后强毒攻毒的方法， 例如，《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)中关于猪 多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制造及检验规程之效力检验。其一种方式 是用体重1.5～2kg家兔4只，各皮下或肌肉注射疫苗2ml，21日后， 连同条件相同的对照家兔2只，各皮下注射致死量的C44-1强毒菌液 或C44-8强毒菌液(含活菌800～100个)，观察8日，对照兔全部死 亡，免疫兔至少保护2只为合格。另一种方法是用体重15～30kg的健 康易感猪5头，各皮下注射疫苗5ml，21日后，连同条件相同的对照 猪3头，各皮下注射致死量的C44-1强毒菌液，观察10日，对照猪 全部死亡，免疫猪至少保护4头；或对照猪死亡2头，免疫猪全部保 护为合格。上述两种方法均存在费时费力、增加疫苗生产成本、强毒 散毒的风险等问题。

间接血凝试验(IHA)于上世纪80年代开始应用于多杀性巴氏杆 菌抗体的检测，例如，毛春生等人采用间接血凝试验检测鸡血清中多 杀性巴氏杆菌抗体(毛春生，卢中华，崔保安等，中国兽医科技，1991， 21(7)：29～31)。该方法先采用洗下血液琼脂平板上的融合生长培 养物，置于56℃水浴中热浸30分钟，然后离心取上清来制取热浸荚 膜抗原；采用上述方法洗下培养物，并于细菌悬液超声波击打6分钟， 离心取上清来制取超声波粉碎抗原；然后，采用取自健康公绵羊的红 细胞，按文献《兽医免疫学实验指导》的方法进行甲醛化、戊二醛化 或甲醛一戊二醛双醛化，并分别以热浸荚膜抗原、超声粉碎抗原致敏 之，致敏后以1∶10000浓度的酸靴化，以0.01mol pH6.4，1％血清的 PBS洗3次，最后配成1％红细胞悬液，由此制得IHA抗原。该方法 中致敏用抗原仍无参考标准，反应条件不一致。

因此，目前存在的问题是需要研究建立一种可用于多杀性巴氏杆 菌疫苗效力检验的，操作简单，成本低廉，无强毒散毒的风险，敏感 性及重复性好的稳定的多杀性巴氏杆菌间接血凝试验方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种多 杀性巴氏杆菌间接血凝试验法的建立方法及其在多杀性巴氏杆菌疫 苗效力检验中的应用。该方法以多杀性巴氏杆菌荚膜抗原中的多糖含 量为依据，通过筛选间接血凝试验中抗原最佳稀释度，建立敏感性、 重复性好的稳定的多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法，采用该试验法检 测疫苗免疫动物血清的间接血凝效价，探索血清间接血凝效价与免疫 后强毒攻毒保护率之间的平行关系，并应用于多杀性巴氏杆菌疫苗的 效力检验。

为此，本发明提供了一种多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法的建立 方法，包括：

步骤A：测定多杀性巴氏杆菌荚膜抗原中荚膜多糖的含量；

步骤B：使用不同荚膜多糖含量的多杀性巴氏杆菌荚膜抗原致敏 绵羊红血球测定同一血清样品的IHA效价，并确定最高血清IHA效 价所对应的荚膜多糖含量；

步骤C：基于最高血清IHA效价所对应的荚膜多糖含量确定间接 血凝试验法中抗原稀释度，并建立多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法。

根据本发明，还包括在步骤A之前进行建立初级多杀性巴氏杆菌 间接血凝试验法的步骤。

在本发明的一个实施例中，在建立初级多杀性巴氏杆菌间接血凝 试验法的步骤中，其结果判定终点为100％凝集。间接血凝试验是在 室温条件下反应60min或在37℃条件下反应30min。致敏用多杀性巴 氏杆菌荚膜抗原，例如，优选为多杀性巴氏杆菌的热提取抗原。

在本发明的一个具体的实施例中，在建立初级多杀性巴氏杆菌间 接血凝试验法的步骤中，将待测血清样品进行2倍梯度稀释，加入使 用多杀性巴氏杆菌荚膜抗原致敏的醛化绵羊红细胞，室温反应60min 或37℃反应30min，反应后肉眼直接观察凝集情况，结果判定终点为 100％凝集。

在建立初级多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法的步骤中，初级多杀 性巴氏杆菌间接血凝试验优选96孔V型反应板为媒介。所使用的稀 释液优选为含1％BSA的PBS液。绵羊红细胞的醛化优选使用戊二醛 溶液进行醛化。

在本发明的一个优选实施例中，在步骤B中，所述最高血清IHA 效价所对应的荚膜多糖含量为100～200μg/ml。

根据本发明方法，例如，优选在步骤A中，采用苯酚-硫酸法测 定多杀性巴氏杆菌荚膜抗原中荚膜多糖的含量。所述苯酚-硫酸法的标 准品包括葡聚糖、葡萄糖。优选所述苯酚-硫酸法的标准品为葡萄糖。

研究发现，巴氏杆菌荚膜主要由多糖组成，其含量为蛋白质含量 的15倍以上，因此，使用不同荚膜多糖含量的多杀性巴氏杆菌荚膜 抗原致敏绵羊红血球测定同一血清样品的IHA效价，并确定最高血清 IHA效价所对应的荚膜多糖含量，可以筛选间接血凝试验法中抗原最 佳稀释度，并在此基础上建立敏感性、重复性好的稳定的多杀性巴氏 杆菌间接血凝试验法。

本发明还提供了一种根据本发明方法所建立的多杀性巴氏杆菌 间接血凝试验法在多杀性巴氏杆菌疫苗效力检验中的应用，包括：

步骤1：进行不同剂量的动物免疫及攻毒试验；

步骤2：测定免疫后多杀性巴氏杆菌IHA效价，并建立多杀性巴 氏杆菌IHA效价与强毒攻毒保护率之间的平行关系；

步骤3：基于多杀性巴氏杆菌IHA效价与强毒攻毒保护率之间的 平行关系，确定以多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法替代疫苗效力检验 中的免疫后强毒攻毒的方法；

其中，免疫后多杀性巴氏杆菌IHA效价采用根据本发明方法所建 立的多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法来测定。

本发明中，在测定多杀性巴氏杆菌荚膜抗原中荚膜多糖含量，以 及测定细菌细胞密度时，采用生物分光光度计(6132，Eppendorf， 德国)测量OD(光密度)值。

研究发现，巴氏杆菌荚膜主要由多糖组成，其含量为蛋白质含量 的15倍以上，因此，通过筛选间接血凝试验中抗原最佳稀释度，可 以建立稳定的多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法，检测疫苗免疫动物血 清的间接血凝效价，探索血清间接血凝效价与免疫后强毒攻毒保护率 之间的平行关系，并应用于多杀性巴氏杆菌疫苗的效力检验。

根据本发明方法所建立的多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法成本 低，操作简单，且敏感性及可重复性好，反应时间快，在37℃条件下， 30min即可判定结果，将该方法应用于多杀性巴氏杆菌疫苗的效力检 验，省去强毒攻毒的环节，不仅节约成本，而且降低了强毒散毒的生 物风险。

本发明以多杀性巴氏杆菌荚膜抗原中的多糖含量为依据，通过筛 选间接血凝试验中抗原最佳稀释度，建立敏感性、重复性好的稳定的 多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法，采用该试验法检测疫苗免疫动物血 清的间接血凝效价，探索血清间接血凝效价与免疫后强毒攻毒保护率 之间的平行关系，并应用于多杀性巴氏杆菌疫苗的效力检验。该方法 也同样适用于其他有荚膜细菌的间接血凝试验及其疫苗的效力检验。

附图说明

图1是多糖含量测定的标准曲线。

图2是C51-2株多杀性巴氏杆菌OD600值-细菌数回归方程曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图 仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。

实施例

实施例1：初级多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法的建立

1.材料

(1)培养基：马丁琼脂、改良马丁肉汤

(2)菌株：C51-2(多杀性巴氏杆菌，菌株保藏编号CVCC499)、 BS039(支气管败血波氏杆菌，菌株保藏编号HNAU0220)、 CMCC44149(大肠埃希氏菌，菌株保藏编号CVCC20725)，均购于 中国兽医药品监察所。

(3)实验动物：1.5～2.0kg的健康易感兔(购自河南康达实验动物有 限公司)。

(4)试剂

磷酸二氢钠(天津市凯通化学试剂有限公司，分析纯，20110308)； 磷酸二氢钾(成都市科龙化工试剂厂，分析纯，20100125)；磷酸氢 二钠(成都市科龙化工试剂厂，分析纯，20091031)；戊二醛(批号 060318，Green bird进口分装，上海双向西巴斯科技发展有限公司)； 鞣酸(天津市博迪化工有限公司，分析纯，20090127)；氯化钠(天 津市永大化学试剂有限公司，分析纯，20100105)；TSB(BD Dfico)、 TSA(BD Dfico)；铝胶佐剂(ALHYDROGEL，Brenntag Biosector)。

(5)主要仪器

恒温摇床(Excella E24R，New Brunswick)；生物分光光度计 (6132，Eppendorf，德国)；超净工作台(SW-CF-2FD，苏州安泰)。

2.方法

(1)荚膜抗原的制备

将C51-2接种于马丁琼脂平板，37℃培16～18h，用生理盐水4～5ml 洗下带有荧光的菌苔，置小试管中56℃水浴30分钟后8000r/min离心 20分钟，上清液即为荚膜抗原，EP管分装后置2～8℃保存，1ml/只， 编号为R1-Ag。

(2)致敏绵羊红细胞的制备

①绵羊红细胞的采集及洗涤

将新鲜抗凝绵羊血4℃保存稳定后2000rpm离心10min，弃上清 及白细胞。用0.15M pH7.2的PBS洗涤3～5次，按体积比配成5％的 红细胞悬液，4℃保存备用。

②红细胞的醛化和鞣酸化

将戊二醛用水按体积比配成2.5％的溶液，4℃保存。

将4℃预冷的红细胞悬液置于磁力搅拌器，低速搅拌，按5∶1的 体积比逐滴加入4℃预冷的戊二醛溶液。然后将红细胞悬液于恒温振 荡器30℃150rpm醛化5h。用PBS(0.15mol/L，pH7.2)洗3次，配成 5％的红细胞悬液，4℃保存。取5％醛化红细胞悬液与等量新配制的鞣 酸(1∶20000)混合，置37℃水浴30min，用PBS(0.15mol/L，pH6.4)洗3 次后，恢复到原体积，4℃保存备用。

③醛化红细胞自凝性的检测

在96孔V型血凝板上任选3孔，分别滴入稀释液、4倍稀释的 阴性血清及阳性血清各25μl，取醛化的红细胞0.1mL，加稀释液 0.9mL，混匀后滴入25ul，置振荡器上混匀，盖上玻板室温下放置2h， 观察红细胞是否凝集。

④绵羊红细胞的致敏

将5％的鞣酸化绵羊红细胞与等量10倍稀释的R1-Ag抗原液混 合，37℃水浴致敏30min，其间不断轻轻振荡，3000r/min离心3min， 弃上清，用PBS(0.15mol/L、pH7.2)洗3次后，再用此稀释液配成1％ 的致敏红细胞悬液。

(3)多杀性巴氏杆菌阳性、阴性血清的制备

将C51-2、BS039和CMCC44149菌株分别接种于TSA固体培养 基，37℃培养18～20h后取单个菌落分别接种于5mlTSB液体培养基中， 37℃180rpm震荡培养14～16h，取0.1ml接种于100mlTSB液体培养基 中进行扩大培养，37℃，200rpm震荡10h后取样做活菌计数，加入 0.15％甲醛溶液对菌液灭活24h，根据活菌计数结果将灭活菌液浓缩至 100亿CFU/ml，加入20％的铝胶佐剂，混匀后分别为制备多杀性巴氏 杆菌(Pm)血清、支气管败血波氏杆菌(Bb)血清、大肠埃希氏杆 菌(E.coli)血清用抗原。

取试验兔8只，随机分成4组，2只/组，三组分别接种C51-2、 BS039和CMCC44149抗原，另一组接种无菌生理盐水，2ml/只，背 部皮下注射；14天后相同剂量加强免疫一次，加强免疫后21天分别 采集各免疫组试验兔血清，即分别为Pm血清、Bb血清、E.coli血清 和阴性血清。

(4)微量间接血凝试验(IHA)方法的建立

①取含1％牛血清白蛋白的PBS(0.15mol/L、pH7.2)25μl于96孔V 型间接血凝板孔中，取Pm血清、Bb血清、E.coli血清和阴性血清25μl 分别加于第一排、第二排、第三排、第四排的第1孔，倍比稀释至第 11孔，第12孔作为空白对照，每孔加25μl致敏红细胞悬液。在微型 振荡器上轻振1min，使其充分混合，37℃孵育30min或室温孵育60min 后观察结果。用“-”、“++”、“+++”、“#”表示红细胞的凝集强度。 ②判定标准：“#”表示凝集的红细胞呈薄膜状均匀铺满孔底，强凝集 时，凝集皱缩成团。“+++”表示凝集的红细胞铺满孔底，但中央有少 量红细胞沉降成小圆点。“++”表示红细胞沉于孔底中央，周围仍然有 散在的凝集红细胞。“-”表示红细胞全部沉在孔底中央，周围无散在的 红细胞。以出现“#”的血清最高稀释倍数为该血清的血凝效价。

3.结果

间接血凝试验方法的检测结果：使用R1-Ag的10倍稀释液致敏 的绵羊红血球，对各待检血清样品的检测结果为，37℃作用30min和 室温作用60min后，空白对照孔的血球均完全沉降为一个小圆点，以 100％凝集为判定终点，Pm血清的IHA效价为1∶2⁶，Bb血清、E.coli 血清和阴性血清均为阴性(详见表1)，且37℃作用30min和室温作 用60min后的结果一致，表明该方法具有很好的特异性和稳定性。

表1：间接血凝试验方法的检测结果

实施例2：多杀性巴氏杆菌荚膜抗原中荚膜多糖的测定

1.材料

无水葡萄糖(sigma)；苯酚(进口分装)；浓硫酸(洛阳市试剂 化工厂，091102)；100℃水浴锅、50ml容量瓶、25ml容量瓶。

2.方法

(2)标准曲线的绘制

①对照品溶液的配制

取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水 溶解制成0.5mg/ml的溶液，摇匀。

②标准曲线绘制

精密量取上面对照品溶液1、2、3、5、10ml，分别置50ml量瓶 中，各加水稀释至刻度，摇匀。分别精密量取上述溶液2ml置25ml 量瓶中，精密加5％苯酚溶液1ml，浓硫酸5ml，振摇2min，置沸水 浴加热15min，取出置冰水浴中冷却5min，取出放至室温，加水稀释 至刻度。以苯酚-浓硫酸溶液为空白，照紫外分光光度法在490nm波 长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，糖浓度为横坐标，得多糖的回 归方程和相关系数。

(2)样品测定

(根据实施例1的方法再制备2批荚膜抗原，分别编号为R2-Ag 和R3-Ag)将R1-Ag、R2-Ag和R3-Ag等3批抗原样品分别进行40 倍稀释(使最终OD490nm在所绘制标准曲线的OD490nm范围内)， 精密量取稀释的待测样品2ml，置25ml量瓶中，精密加5％苯酚溶液 1ml，浓硫酸5ml，振摇2min，置沸水浴加热15min，取出置冰水浴 中冷却5min，取出放至室温，加水稀释至刻度。以苯酚-浓硫酸溶液 为空白，照紫外分光光度法在490nm波长处测定吸光度，根据回归方 程计算多糖含量。

3.结果

(1)荚膜抗原多糖含量的测定

根据无水葡糖糖制备的标准曲线(详见表2和图1)，回归方程为 y＝1.3914x+0.0086(R²＝0.997)，将R1-Ag、R2-Ag和R3-Ag荚膜抗原做 40倍稀释后经苯酚-硫酸处理后测得OD490分别为0.028、0.015和 0.020，根据回归方程计算得荚膜抗原的多糖含量分别为0.05、0.03和 0.04mg/ml，因此R1-Ag、R2-Ag和R3-Ag荚膜抗原中的多糖含量分 别为2.0、1.2和1.6mg/ml(详见表3)。

表2：多糖含量测定标准曲线的制备

  OD490nm   0   0.01   0.016   0.028   0.066   糖含量(mg/ml)   0.01   0.02   0.03   0.05   0.10

将荚膜抗原做40倍稀释后再通过苯酚硫酸法进行测定，结果见 表3。

表3：荚膜抗原中多糖含量的测定

实施例3：多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法的敏感性和重复性

将三批荚膜抗原R1-Ag、R2-Ag和R3-Ag分别进行2、4、8、10、 16、20、25倍稀释后，分别致敏醛化绵羊红细胞对自制的各种血清进 行间接血凝试验。结果显示，荚膜抗原中多糖含量为100～200μg/ml 时，Pm血清的间接血凝效价最高(详见表4)，Bb血清、E.coli血清 和阴性血清均检测为阴性，表明该方法具有很好的特异性和重复性。

表4：间接血凝试验方法的敏感性和重复性试验结果

实施例4：免疫兔多杀性巴氏杆菌间接血凝效价与攻毒保护率之间的 平行研究

1.材料

(1)菌株：C51-2(兔多杀性巴氏杆菌)，购自中国兽医药品监察所。

(2)实验动物：1.5～2.0kg的健康易感兔(购自河南康达实验动物有 限公司)。

2.方法

(1)多杀性巴氏杆菌灭活疫苗的制备

按实施例一中2.3的方法制备多杀性巴氏杆菌灭活疫苗，佐剂为 铝胶，灭活前含菌量为2.5×10⁹CFU/ml。

(2)C51-2株多杀性巴氏杆菌毒力的测定

①C51-2株多杀性巴氏杆菌OD值-细菌数回归方程的建立

将菌种复苏后取单个菌落接种于5ml含5％血清的TSB培养基中， 37℃180rpm震荡培养15～18h后，按照0.1％的接种量接种于新鲜培养 基中，37℃200rpm震荡培养，每1小时取样测定OD600，同时做活 菌计数，根据OD600和活菌计数结果建立线性回归方程。

②攻毒用菌液的准备

将菌种复苏后取单个菌落接种于5ml含5％血清的TSB培养基中， 37℃180rpm震荡培养15～18h后，按照0.1％的接种量接种于新鲜培养 基中，37℃200rpm震荡培养5小时后，取样测定OD600，OD600在 0.1～1.0之间时停止培养，根据所建立的OD值-细菌数回归方程计算 菌液浓度，同时取样做活菌计数。

③C51-2株毒力的测定：

菌液的稀释：根据回归方程的计算结果，用新鲜培养基将菌液稀 释至4CFU/ml、3CFU/ml、2CFU/ml和1CFU/ml，同时取样做活菌计 数，以确定实际攻毒剂量。

动物分组：将试验兔随机分成5组，4只/组，分别编号为1、2、 3、4和5组，1、2、3和4组为试验组，5组为对照组。

攻毒：取4CFU/ml、3CFU/ml、2CFU/ml和1CFU/ml的菌液分别 对1、2、3和4组的动物进行攻毒，攻毒途径为皮下注射，攻毒剂量 为1ml/只。对照组使用新鲜培养基进行皮下注射，1ml/只。

观察：观察期为72小时，每天观察并记录试验动物的发病及死 亡情况。对照组动物应全部健活，攻毒组全部死亡的最小攻毒量为该 菌株对兔的最小致死剂量(Minimum Lethal Dose，MLD)。

(3)试验兔的免疫及攻毒

通过皮下注射对试验兔进行免疫，分别设1ml/只、2ml/只和3ml/ 只通过皮下注射进行免疫，5只/组，同时设5只对照兔皮下注射2ml 无菌生理盐水，相同条件下饲养。21天后通过耳缘静脉采血分离血清， 检测血清的间接血凝效价；同时，将C51-2株多杀性巴氏杆菌培养5h 的新鲜菌液测定OD600，按照所建立的回归方程计算菌液浓度，根据 计算结果对菌液进行稀释(同时取样做活菌计数，以确定实际攻毒剂 量)，使攻毒剂量为1个MLD/只，攻毒途径为皮下注射，攻毒后连 续观察10日。

3.结果

(1)C51-2株多杀性巴氏杆菌回归方程的建立

根据OD600值和活菌计数结果，发现在3h到6h之间两者具有良 好的线性关系，其OD600值-细菌数回归方程为y＝32.263*x-2.1053 (R²＝0.9946)，详见表5和图2。

表5：C51-2株多杀性巴氏杆菌OD600值和活菌计数结果

(2)C51-2株多杀性巴氏杆菌的毒力测定

根据活菌计数结果，实际攻毒剂量分别为4.7、3.5、2.4、1.3和 0CFU/只，在观察期内，对照组(0CFU/只)试验兔100％(5/5)健康 存活，攻毒组全部死亡(详见表6)，因此，确定C51-2株多杀性巴 氏杆菌对1.5～2.0kg健康易感兔的MLD为1CFU。

表6：C51-2株多杀性巴氏杆菌的毒力试验结果

(3)免疫兔的攻毒剂量

培养5h的新鲜菌液的OD600为0.4，根据回归方程计算得菌液浓 度为11.2×10⁸CFU/ml，而活菌计数结果为14.7×10⁸CFU/ml。因此，根 据回归方程计算结果稀释至1CFU/ml，实际菌液浓度即为1.3CFU/ml， 即实际攻毒剂量为1.3CFU/只。

(4)多杀性巴氏杆菌IHA效价与强毒攻毒保护率之间的关系

取16倍稀释的R1-Ag多杀性巴氏杆菌荚膜抗原按实施例一中的 方法致敏绵羊红血球后，并按照实施例一中的方法对免疫21天后的 血清进行间接血凝试验方法检测，检测结果为：免疫剂量为1ml/只时， 其IHA效价分别为1∶2、1∶2²、1∶2、1∶2²和1∶2³，仅1∶2³的 兔强毒攻毒后被保护；免疫剂量为2ml/只时，其间接血凝效价分别为 1∶2³、1∶2³、1∶2²、1∶2⁴和1∶2³，仅1∶2²的兔强毒攻毒后死亡； 免疫剂量为3ml/只时，其间接血凝效价分别为1∶2⁶、1∶2⁷、1∶2⁵、 1∶2⁴和1∶2⁵，强毒攻毒后100％保护；对照兔强毒攻毒后100％死亡。 结果详见表7。

从表7中可以看出，当IHA效价为1∶2¹时，免疫兔攻毒后绝对 不能获得保护；当IHA效价为1∶2²时，免疫兔攻毒后可获得部分保 护；当IHA效价≥1∶2³时，免疫兔攻毒后可以获得100％的保护，表 明免疫后血清中的IHA抗体水平与强毒攻毒保护之间存在良好的平 行关系，完全可以作为巴氏杆菌疫苗效力检验的替代方法。并且建立 的该方法成本低，可重复性好，特异性强、反应时间快，37℃30min 即可判定结果，将该方法应用于多杀性巴氏杆菌疫苗的效力检验，省 去强毒攻毒的环节，不仅节约成本，而且降低了强毒散毒的生物风险。

表7：免疫21天后的血凝效价和攻毒保护情况

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡 在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。