一种杀藻剂在控制微囊藻水华中的用途

摘要

本发明公开了一种杀藻剂在杀灭和控制微囊藻水华中的用途。三氯生和琥珀酸等三羧酸循环中间产物有机羧酸对微囊藻水华的杀灭和控制作用。在室内实验条件下，0.5ppm的三氯生对微囊藻即具有致死作用；在野外条件下，5-15ppm的三氯生可杀灭微囊藻水华群体。在实验条件下，0.01%浓度的琥珀酸对微囊藻具有致死作用；在野外条件下，0.1%的琥珀酸可杀灭微囊藻水华群体。苹果酸和Alpha-酮戊二酸效果次之，柠檬酸和延胡索酸也具有较好的溶藻效果。有机羧酸的溶藻作用主要归因于pH值的迅速降低，为休克酸化。三氯生主要是可用来作为强力杀藻剂，安全无毒、环保、效率高、见效快。

说明书

技术领域

本发明属于水域生态、水产养殖水质保护与水环境保护工程领域，具体地说，涉及一种杀藻剂在杀灭和控制微囊藻水华中的用途。

背景技术

随着我国社会经济和城镇化的迅速发展，大量城市生活污水、工业废水和农业面源污染排入江河湖泊，加速了水体污染和富营养化进程。太湖、巢湖和滇池等湖泊有毒蓝藻（主要是微囊藻）水华频繁暴发，危及多个大中城市的自来水供应和饮用水安全。微囊藻水华可造成水体水质变坏、发臭，所释放的微囊藻毒素是一种七环肽，其性质非常稳定（煮沸不能使之失活），毒性很强。研究显示微囊藻毒素可能与人群中肝癌发病率提高相关。另一方面，高密度精养造成湖泊和池塘水质恶化和微囊藻水华暴发，也造成水产动物的死亡和水产品的安全性降低。目前尚缺乏有效控藻手段，亟需开发有效的微囊藻水华控制措施。为有效控制微囊藻水华暴发及在水华暴发后进行应急控制，筛选具有生物安全性、无毒副作用、不污染环境的杀藻剂已成为必然的趋势。最近两年我们致力于高效低毒、无毒杀藻剂和溶藻细菌的研究开发，筛选到两类有潜力的杀藻剂，在微囊藻水华预防和应急控制中的潜力巨大。

申请人实验室2012年首次发现了三氯生对水华微囊藻具有强力杀灭作用（夏明等，2012，未发表资料），随后我们对三氯生的杀藻效果和作用机制进行系统研究，在野外条件下三氯生对微囊藻水华群体具有良好的杀灭作用。2013年我们发现用低浓度的三羧酸循环（TCA cycle）中间产物有机羧酸如琥珀酸、Alpha-酮戊二酸、柠檬酸、苹果酸以及延胡索酸可引起微囊藻细胞溶解和死亡，而同摩尔浓度下乙酸（醋酸）对水华微囊藻生长没有明显的抑制作用（柏仕杰等，2013，未发表资料），我们将这一现象命名为休克酸化（shock acidification）。我们进一步用野外试验证明这些新型杀藻剂特别是三氯生对微囊藻水华的强力杀灭作用。

发明内容

    本发明的目的是在于提供了一种杀藻剂在杀灭和控制微囊藻水华中的应用。三氯生主要是可用来作为强力杀藻剂，安全无毒、环保、效率高、见效快。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施，

一种杀藻剂在杀灭和控制微囊藻水华中的应用，其步骤是：

1、2013年夏季申请人在水生所官桥试验基地暴发微囊藻水华试验鱼池的现场试验（约10公升的水桶），做了两个三氯生处理组（终浓度为5 mg/L以及15mg/L）和两个红霉素的处理组（终浓度为5 mg/L以及15 mg/L），每个处理组分别做了三个平行，在加入三氯生和红霉素之前均将其避光保存。

2、终浓度为5 mg/L的三氯生处理是分别将0.5 ml工作母液（工作母液配置过程与实施例1相同）加入到三个桶中且混合均匀，同理终浓度为15mg/L的三氯生处理是分别将1.5 ml工作母液（三氯生工作母液配制：将1克三氯生溶解到约5 ml的1摩尔浓度（1 M）的氢氧化钠溶液中，再定容至10ml）加入到三个桶中且混合均匀。

3、终浓度为5 mg/L的红霉素处理组是首先将1g红霉素直接加入10 ml水中配成工作母液（100 g/L），然后终浓度为5 mg/L的红霉素处理是分别将0.5 ml工作母液加入到三个桶中且混合均匀，同理终浓度为15 mg/L的红霉素处理是分别将1.5 ml工作母液加入到三个桶中且混合均匀。

    4、申请人进行的野外试验中只需要5mg/L的三氯生就能在一周内起到比较好的效果，故如要在实际野外治理每1亩，水深1m的池塘（667m³），一共需要投入三氯生3.33kg，其它每一个具体池塘或湖泊的情况按照这个体积进行扩大。

5、三氯生杀藻活性的生物测定：

a)培养条件下三氯生的杀藻效果和半致死浓度。

b)野外条件下三氯生对水华微囊藻群体的杀灭效果检测。

所述的杀藻剂为三氯生、琥珀酸、苹果酸或柠檬酸其中的一种。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、杀灭微囊藻水华所需的杀藻剂三氯生作用浓度低，野外条件下5 ppm即产生明显效果；15 ppm即可迅速杀灭微囊藻水华。杀藻效果比常用的红霉素高50倍以上（实验室条件下）。

2、三氯生对蓝藻（包括微囊藻）等原核生物具有高度的专一性，而对水产动物和人体不产生影响，生物安全性高，其降解产物也无毒性。

3、TCA循环中间产物有机羧酸为易降解的碳水化合物，无毒副作用，最适于饮用水源微囊藻水华的控制和杀灭。

附图说明

图1 为一种三氯生杀灭微囊藻活性的生物测试。

使用BG11藻类培养基进行微囊藻光照培养（12:12小时光照/黑暗循环）；供试藻株由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库提供。

图2 为一种三氯生对微囊藻生长的抑制作用。

利用在波长680nm处的吸光度（OD₆₈₀）作为微囊藻种群密度指标。

图3 为一种室内培养条件下三氯生和常用杀藻剂红霉素杀灭微囊藻活性的比较。

图4 为一种野外条件下三氯生对微囊藻水华的杀灭和抑制作用及与常用杀藻剂红霉素的比较。

5ppm浓度下处理4天微囊藻水华开始出现变化；15ppm两天微囊藻群体开始脱色变白，三天开始死亡。

图5 为一种野外条件下不同浓度三氯生与常用杀藻剂红霉素对微囊藻水华的叶        绿素a含量的影响。叶绿素a含量可以表征微囊藻水华的生物量和代谢状态。

图6 为一种三羧酸循环中间产物有机羧酸及乙酸对微囊藻1023藻株生长的影响，       分别加入不同的酸使得实验组中酸的终浓度为1mmol/L，对照组加入1mL的BG11液体培养基，OD₆₈₀代表微囊藻1023生长情况，数据增大代表藻类生长良好，数据下降代表藻类死亡，数据表示为平均值 ± 标准误差（SE）。结果显示，杀藻效果最好的是琥珀酸，其次是杀藻效果相似的a 酮戊二酸和苹果酸，而延胡索酸和柠檬酸的杀藻效果要弱于琥珀酸，a 酮戊二酸和苹果酸，但要强于对照组和乙酸组。不同有机酸对微囊藻1023藻株生长的影响。

图 7 为一种经硫酸铵浓缩后的蛋白质吸收光谱图。

    三羧酸循环中间产物有机羧酸处理藻类后，上清液经60%质量体积比硫酸铵浓缩后的蛋白质吸收光谱图。吸收值利用UV-1800 分光光度计进行测定（MAPADA, Shanghai），测定范围为400至750 nm，每隔5个纳米测定一次，最大吸收峰出现在620nm波长附近，说明蛋白质中的主要成分是藻蓝蛋白。

图 8 为三种有机羧酸琥珀酸、α-酮戊二酸、苹果酸处理组和对照组中经60%质量体积比浓缩后的藻蓝蛋白在620 nm处的吸收峰值。

    表示为平均值 ± 标准误差（SE），此图表征为不同酸处理组和对照组中藻蓝蛋白含量差异。结果显示，酸处理组的藻蓝蛋白含量要显著高于对照组(P < 0.01)，大约在24.9倍到27倍之间，最高藻蓝蛋白产量出现在琥珀酸处理组中。

图 9 为一种α-酮戊二酸实验组和对照组中藻细胞微囊藻毒素合成基因 mcyA 和 mcyD基因转录水平的比较。

   利用RT-PCR方法对α-酮戊二酸处理组和对照组中微囊藻1023细胞中微囊藻毒素合成基因 mcyA 和 mcyD基因转录水平进行比较，每组采集三个数据。9a，9b，9c 分别为在加入α-酮戊二酸1，3，6个小时后，微囊藻细胞中微囊藻毒素合成基因mcyA和mcyD的表达情况，以微囊藻16S rRNA基因为参照。9d与9e利用基因相对表达量分别表征微囊藻毒素合成基因mcyA和mcyD在不同时间下，α-酮戊二酸处理组和对照组中微囊藻1023细胞中微囊藻毒素合成基因 mcyA 和 mcyD基因转录水平的差异，数据表示为平均值 ± 标准误差（SE）。结果显示这两个微囊藻毒素合成基因的转录水平并没有上调，这些结果显示当加入这些有机羧酸来杀藻时，其藻毒素并没有增加。16S rRNA基因用于作为对照，每组三个数据，取样时间分别为加入α-酮戊二酸后1，3和6小时后。下面的图是定量分析结果。

具体实施方式

     下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当说明的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求的保护范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：《水和废水监测分析方法》（第四版，2002年，北京：中国环境科学出版社）和《高级水生生物学》（1999年，北京：科学出版社）等书中所述的条件，或按照制造厂商的操作指南所建议的方法。

实施例1：

    一种杀藻剂在杀灭和控制微囊藻水华中的应用，其步骤是：

1、2013年夏季申请人在水生所官桥试验基地暴发微囊藻水华试验鱼池的现场试验（约10公升的水桶），做了两个三氯生处理组（终浓度为5 mg/L以及15mg/L）和两个红霉素的处理组（终浓度为5 mg/L以及15 mg/L），每个处理组分别做了三个平行，在加入三氯生和红霉素之前均将其避光保存。

 2、终浓度为5mg/L的三氯生处理是分别将0.5 ml工作母液（工作母液配置过程请见本实施例第三步）加入到三个桶中且混合均匀，同理终浓度为15 mg/L的三氯生处理是分别将1.5 ml工作母液（三氯生工作母液配制：将1克三氯生溶解到约5 ml的1摩尔浓度（1 M）的氢氧化钠溶液中，再定容至10ml）加入到三个桶中且混合均匀。

 3、终浓度为5 mg/L的红霉素处理组是首先将1g红霉素直接加入10ml水中配成工作母液（100 g/L），然后终浓度为5mg/L的红霉素处理是分别将0.5ml工作母液加入到三个桶中且混合均匀，同理终浓度为15mg/L的红霉素处理是分别将1.5ml工作母液加入到三个桶中且混合均匀。

4、申请人进行的野外试验中只需要5mg/L的三氯生就能在一周内起到比较好的效果，故如要在实际野外治理每1亩，水深1 m的池塘（667 m³），一共需要投入三氯生3.33 kg，其它每一个具体池塘或湖泊的情况按照这个体积进行扩大。如果在微囊藻水华未暴发前进行预防，三氯生用量可以适当降低。

5、三氯生杀藻活性的生物测定：

a)培养条件下三氯生的杀藻效果和半致死浓度。

b)野外条件下三氯生对水华微囊藻群体的杀灭效果检测。

所述的杀藻剂为三氯生、琥珀酸、苹果酸或柠檬酸其中的一种。

实施例2：

     三氯生对培养条件下微囊藻的杀灭和杀藻活性的生物测定

图1和图2 三氯生杀灭微囊藻生物活性试验的结果：在实验室条件下只需0.5mg/L （百万分之一）浓度的三氯生即可有效抑制微囊藻的生长；1mg/L则可完全抑制微囊藻的生长。

其它实施步骤与实施例1相同。

实施例3：

     室内培养条件下三氯生和常用杀藻剂红霉素杀灭微囊藻活性的比较

     图3显示室内培养条件下三氯生和常用杀藻剂红霉素杀灭微囊藻活性的比较。

其它实施步骤与实施例1相同。

实施例4：

 野外条件下三氯生对养殖池微囊藻水华的杀灭

具体操作如下：

1、2013年夏季申请人在水生所官桥试验基地暴发微囊藻水华试验鱼池的现场试验（约10公升的水桶），做了两个三氯生处理组（终浓度为5 mg/L以及15 mg/L）和两个红霉素的处理组（终浓度为5mg/L以及15mg/L），每个处理组分别做了三个平行，在加入三氯生和红霉素之前均将其避光保存。

 2、终浓度为5 mg/L的三氯生处理是分别将0.5ml工作母液加入到三个桶中且混合均匀，同理终浓度为15 mg/L的三氯生处理是分别将1.5ml工作母液（工作母液配置过程与实施例1相同）加入到三个桶中且混合均匀。

3、终浓度为5 mg/L的红霉素处理组是首先将1g红霉素直接加入10 ml水中配成工作母液（100 g/L），然后终浓度为5mg/L的红霉素处理是分别将0.5 ml工作母液加入到三个桶中且混合均匀，同理终浓度为15mg/L的红霉素处理是分别将1.5 ml工作母液加入到三个桶中且混合均匀。

4、申请人进行的野外试验中只需要5 mg/L的三氯生就能在一周内起到比较好的效果，故如要在实际野外治理每1亩，水深1 m的池塘（667 m³），一共需要投入三氯生3.33 kg，其它每一个具体池塘或湖泊的情况按照这个体积进行扩大。

其它实施步骤与实施例1相同。

实施例5：

 三氯生与溶藻细菌共同作用杀灭微囊藻

申请人还分离了一系列的溶藻细菌，可以用于养殖水体和饮用水源微囊藻水华的防治和水质改善。目前正在研究细菌溶藻机理，分离和鉴定溶藻活性物质。对于水体中藻菌关系和微囊藻水华暴发机理的揭示有一定作用。在实验中申请人发现溶藻细菌与三氯生共同作用可以取得更好杀藻和控藻的效果。

其它实施步骤与实施例1相同。

实施例6：

三氯生施用后使用微生态制剂对水质进行进一步净化，同时可以促进残留的三氯生降解以及三氯生降解菌的分离。

微生物制剂单独使用不能有效控制微囊藻水华。申请人所使用的三氯生浓度对假单胞菌的生长没有影响。可以在施用三氯生成功控制微囊藻水华后，再施用微生物制剂进一步净化水质，同时也可降解三氯生，将其环境影响降低到最低限度。申请人正在分离和收集三氯生降解菌。

其它实施步骤与实施例1相同。

实施例7：

  有机羧酸对微囊藻水华的杀灭

申请人在实验中发现在微囊藻培养液中少量（约1毫摩尔浓度）添加5种三羧酸循环中间产物有机酸可以导致微囊藻细胞的迅速溶解。所试验的有机酸可导致培养基pH值显著降低并进而诱发微囊藻细胞的死亡和溶解，而添加等摩尔浓度的乙酸对pH值和微囊藻细胞增殖几乎没有影响 （图6），因此申请人将这一现象命名为休克酸化（Shock acidification）。由于琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、α-酮戊二酸和延胡索酸均是三羧酸循环的中间代谢物，生物可利用性高，对水体环境和生态系统不会造成长期的毒副作用。

其它实施步骤与实施例1相同。

实施例8：

  野外条件下有机羧酸对微囊藻杀灭

2013年夏季申请人在水生所官桥试验基地暴发微囊藻水华试验鱼池的现场试验（约10公升的水桶）揭示0.1%浓度以上的琥珀酸可以杀死水华微囊藻，浓度越高，效果越好。申请人认为休克酸化法可用作一种高效安全的微囊藻水华治理和控制方法。

其它实施步骤与实施例1相同。

实施例9：

   有机羧酸处理可以提高蓝藻藻胆蛋白产量

申请人在实验中发现在有机羧酸不仅可以导致微囊藻细胞的迅速溶解，与此同时蓝藻细胞中藻蓝蛋白大量合成并释放到培养基中。所提取的藻蓝蛋白量可达对照组的27倍之多。因此可以用作一种微囊藻水华废物利用、生产藻蓝蛋白的一种新方法（图7和图8）。

其它实施步骤与实施例1相同。

实施例10：

有机羧酸α-酮戊二酸处理对微囊藻毒素基因的表达没有影响

    蓝藻细胞内α-酮戊二酸的积累是活化全局调节因子NtcA的细胞信号，进而促进微囊藻毒素的生物合成，但申请人发现所添加的外源α-酮戊二酸并未诱导微囊藻毒素合成基因簇转录水平的上升，因此不会导致藻毒素合成和释放的增加。申请人用RT-PCR检测α 酮戊二酸实验组和对照组中藻细胞微囊藻毒素合成基因 mcyA 和 mcyD基因的转录水平，发现α 酮戊二酸处理没有增加微囊藻毒素基因的表达（图9）。

三氯生是一个强力杀灭微囊藻的杀藻剂，有作为杀灭和控制微囊藻水华的杀藻剂的巨大潜力。TCA循环中间产物有机羧酸是一类完全无毒和可作为微生物有机碳源被迅速降解成水和二氧化碳的碳水化合物，休克酸化法在环境和生物安全性上具有无可比拟的优势，可以在饮用水源附近使用、特别是进行紧急修复时更加适合。

其它实施步骤与实施例1相同。