影响精子功能的唾液酸酶检测方法

摘要

本发明提出了一种影响精子功能的唾液酸酶检测方法。该方法是一种新的评估精子质量与功能的实验室检测方法，可为临床原因不明的男性不育患者提供检测及临床咨询。其特征在于：第一步，通过单精子荧光强度分析直观的量化唾液酸酶在精子中的表达，或者利用显微镜下荧光成像直观的观察唾液酸酶在精子中的表达；若唾液酸酶在精子中高表达，则进行第二步，利用体外获能液使精子获能，并用荧光法检测唾液酸酶活性。

说明书

技术领域

本发明属于医疗检测技术领域，具体涉及一种影响精子功能的唾液酸酶检测方法。 

背景技术

随着社会工业的不断发展，不育夫妇的总发病率明显升高。2004年欧洲生殖学会统计：育龄夫妇1年内不能怀孕者占25%，其中15%寻求治疗，男方因素引起不育占50%。男性不育的病因有性功能障碍(1.7% )，精索静脉曲张(12. 3% )，生殖道感染(6.6%)，先天性发育异常(2.1%)后天获得性疾病(2.6% )，内分泌紊乱(0.6%)，免疫性因素(3.1%)，其他异常(3%)，但是高达60%~75%的患者找不到原因，称为特发性男性不育，他们只表现为少精、弱精或畸形精子症等精子质量异常。不明原因的男性不育可能由于多种因素造成，如长期应激环境因素引起内分泌紊乱、活性氧和基因缺陷等。 

多年来，传统的精液常规分析一直是用于判断男性生育力的最基本临床指标。临床上对绝大部分的男性不育患者的真正不育原因仍然不清楚。尤其是临床上大约有三分之一不育患者，男性的常规精液分析结果均正常和接近正常。临床上把这类患者划为不明原因不育症。因此，长期以来，临床对男性不育的诊断存在很大的困难。最主要的原因是常规精液分析只测定精子的数量，存活力，活动率和形态。这些指标只能反映最基本的精液质量，不能反映所有的精子功能，比如，精子核的成熟和DNA损伤，精子与人卵透明带结合反应与穿透，顶体状况和反应及与卵黄膜结合能力等。因此，需要建立特殊的精子功能试验才能测定以上这些功能。精子获能是精卵结合形成受精卵的必要条件，虽然精子获能的相关研究已有一些进展, 但仍然存在很多尚未阐明的问题。 

临床工作中，一部分原发或继发的不育男性病人利用现有的常规精液质量检查项目提示精子及精液质量无异常。目前常用的精子检测手段为CASA(计算机辅助精子分析 Computer aided of semen analysis)，以及抗精子抗体等。当今最为广泛使用的CASA技术和一些形态学的相关检测，主要能评价精子的活动能力和活精子比率，从而推测其进入女性生殖道的受精能力，而依赖目前的精子功能评价体系，对精子质量及功能的评价存在一定的缺陷，以及难于给病人提供相应的临床咨询。事实上，这仅仅是评价精子功能的一个方面，我们应该考虑到可能还有影响精子生殖能力的更多没有被揭示的因素。 

如文献“哺乳类动物精子自身的唾液酸酶参与获能过程中的唾液酸脱落”（Sialidases on mammalian sperm mediate deciduous sialylation during capacitation，《The Journal of Biological Chemistry》，2012 Nov 2;287(45):38073-9），首次报道了精子膜上的唾液酸酶（NEU1/3）是影响精子生殖能力的新因素。唾液酸(sialic acid)在小鼠及人的体外获能过程中以单个糖分子的方式从精子的细胞膜上脱落，而与此同时，精子膜上的唾液酸酶（NEU1/3）可能由于精子膜的流动性而脱落参与剪切致单个唾液酸分子脱落，文献证实了抑制NEU3的活性会降低精子的获能过程中磷酸化ErK的表达，以及少量不明原因性不育的病人精子这两种酶的低表达。 

文献虽然提出了唾液酸酶可用于评价精子功能，并公开了小鼠和少量人冰冻精子中唾液酸酶的检测方法。但文献只公开了唾液酸酶在精子中的表达检测，并没有对唾液酸酶的活性检测作进一步报道；并且，所公开的表达检测方法无法顺利检测出新鲜精子中的唾液酸酶，还不能适用于临床应用。 

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提出了一种影响精子功能的唾液酸酶检测方法。该方法是一种新的评估精子质量与功能的实验室检测方法，可为临床原因不明的男性不育患者提供检测及临床咨询。  

为实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：

影响精子功能的唾液酸酶检测方法，其特征在于：第一步，通过单精子荧光强度分析直观的量化唾液酸酶在精子中的表达，或者利用显微镜下荧光成像直观的观察唾液酸酶在精子中的表达；若唾液酸酶在精子中高表达，则进行第二步，利用体外获能液使精子获能，并用荧光法检测唾液酸酶活性。

所述的体外获能液为HSA (人血清白蛋白)5mg/ml HTF（人输卵管液）。 

所述的第一步，按照下述步骤，分别进行精子唾液酸酶NEU1和NEU3的表达检测： 

A 收集新鲜液化精液标本，低速离心分离出精子，PBS（磷酸缓冲液）洗涤精子，充分除去残留的精浆成分；

B 计数精子数量，冰上置20~30 min，用于制动精子，便于后续的操作；

C 采用0.1%的Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）对精子进行预处理，PBS洗涤精子后，用3%的PFA（多聚甲醛）再次对精子进行预处理；

D 当检测NEU1时，采用1%的BSA（牛血清白蛋白）-PBS溶液进行封闭；或者，当检测NEU3时，采用甲醇固定；

E 采用1ug/ul的抗人NEU1抗体孵育1~3 h，充分保证抗原-抗体结合时间，PBS洗涤精子；

F 在常温下，精子在1:1000的常规荧光二抗中孵育1~2 h；

G 采用流式细胞仪检测或荧光显微镜制作精子的细胞涂片，观察唾液酸酶在精子中的表达。

所述的第二步，具体操作步骤如下： 

A　新鲜液化精液标本收集，低速离心分离精子，保持精子完整性与活力；

B　采用上游法，在5%的CO₂细胞培养箱中培养精子，收获上游精子，进一步获取活力优良的精子，采用BWW（Biggers,Whitten,and Whittinghamreedit）培养液洗涤精子，充分去除精浆中残留的蛋白等成分，避免增加非特异性荧光背景和去除一些“去获能因子”。

由于精子死后会释放唾液酸酶，干扰实验增加非特异性表达，采用上游法可保证活力良好的精子获能，避免死精子。 

C　计数精子数量，用体外获能液HAS 5mg/ml HTF，在5%的CO₂细胞培养箱中孵育精子3~4 h； 

D 先将经上述操作得到的溶液离心分离，收取的上清液再次离心分离，收取上清液，充分去除精子等有形成分，避免增加非特异性荧光背景；

E 立即将获能后的上清液用荧光法检测唾液酸酶活性。

所述第一、二步的A步骤，以500~600 g/min的速度低速离心5~6min，以保证精子形态完整，与精浆分离。 

所述第二步的B步骤，采用上游法于36~37 ℃下，在5%的CO₂细胞培养箱中培养10~30min。 

所述第二步的C步骤，计数精子数量，调整为1×10⁷/ml以上，既保证足够的接近生理的体外获能环境，又使其唾液酸酶活性能够被检测； 

所述第二步的C步骤，用体外获能液HAS 5mg/ml HTF于36~37 ℃下，5%的CO₂细胞培养箱中孵育3~4 h，反应体积100~200ul。

因为精子的酶活性相对细菌非常低，所以为了保证的灵敏度，必须控制反应体积为100~200ul，既保证获能又保证酶的可测的浓度。 

所述第二步的D步骤，先以500~600 g/min的速度低速离心5 ~6min，再以5000~6000g/min的速度低速离心10 ~15min，充分去除精子等有形成分。 

本发明的有益效果在于： 

1、本发明提供了一种影响精子功能的唾液酸酶检测方法，是新的评估精子质量与功能的实验室检测方法，对患者无创，为原发性不育患者提供更多的检测指标和临床解释。

2、本发明使用荧光法来检测和评估精子中的唾液酸酶，由于从精子上脱落的唾液酸酶在获能过程中参与了精子表面的唾液酸剪切，因为检测唾液酸酶的活性理论依据是用唾液酸酶去剪切带荧光的唾液酸复合物，如有活性，带荧光基团分离能产生荧光，所以能检测和评估其活性。因此，本方法是精子的唾液酸酶活性需要的高灵敏度检测法。 

3、本发明在检测唾液酸酶在精子中的表达时，将精子在冰上置20~30 min，用于制动精子，使新鲜的液化精子活动静止，便于后续的操作。 

4、本发明在检测唾液酸酶活性时，采用上游法来获取活力优良的精子，由于精子死后会释放唾液酸酶，干扰实验增加非特异性表达，上游法可保证活力良好的精子获能，避免死精子；同时，采用BWW培养液洗涤精子，充分去除精浆中残留的蛋白等成分，避免增加非特异性荧光背景和去除一些“去获能因子”，保证了实验的准确性。 

5、本发明在检测唾液酸酶活性时，采取两次离心分离的方法，充分去除精子等有形成分，避免增加非特异性荧光背景。并且，本发明严格控制离心速度，先以500~600 g/min的速度低速离心5 ~6min，再以5000~6000g/min的速度低速离心10 ~15min，进一步充分去除精子等有形成分，避免为检测带来干扰。 

6、本发明在采集精子时，以500~600 g/min的速度低速离心5~6min，以保证精子形态完整，与精浆分离完全。 

7、本发明在检测唾液酸酶活性时，计数精子数量，调整为1×10⁷/ml以上，既保证足够的接近生理的体外获能环境，又使其唾液酸酶活性能够被检测。 

8、本发明在检测唾液酸酶活性时，用体外获能液HAS 5mg/ml HTF于36~37 ℃下，5%的CO₂细胞培养箱中孵育3~4 h，控制反应体积为100~200ul。因为精子的酶活性相对细菌非常低，所以为了保证的灵敏度，必须控制反应体积，既保证获能又保证酶的可测的浓度。 

附图说明

图1为唾液酸酶(NEU1/3)在不明原因性男性不育患者的表达。 

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。 

实施例1 

影响精子功能的唾液酸酶检测方法，其特征在于：第一步，通过单精子荧光强度分析直观的量化唾液酸酶在精子中的表达，或者利用显微镜下荧光成像直观的观察唾液酸酶在精子中的表达；若唾液酸酶在精子中高表达，则进行第二步，利用体外获能液使精子获能，并用荧光法检测唾液酸酶活性。

实施例2 

影响精子功能的唾液酸酶检测方法，其特征在于：第一步，通过单精子荧光强度分析直观的量化唾液酸酶在精子中的表达，或者利用显微镜下荧光成像直观的观察唾液酸酶在精子中的表达；若唾液酸酶在精子中高表达，则进行第二步，利用体外获能液使精子获能，并用荧光法检测唾液酸酶活性。

所述的体外获能液为HSA 5mg/ml HTF。 

实施例3 

    本实施例的实施方式与实施例1基本相同，在此基础上：

按照下述步骤，进行精子唾液酸酶NEU1的表达检测：

A 收集新鲜液化精液标本，离心分离出精子，PBS洗涤精子2次；

B 计数精子数量，冰上置20 min；

C 采用0.1%的Triton X-100对精子进行预处理，PBS洗涤精子2次，用3%的PFA再次对精子进行预处理；

D采用1%的BSA-PBS溶液进行封闭；

E 采用1ug/ul的抗人NEU1抗体孵育1 h，PBS洗涤精子2次；

F 在常温下，精子在1:1000的常规荧光二抗中孵育1 h；

G 采用流式细胞仪检测或荧光显微镜制作精子的细胞涂片，观察唾液酸酶在精子中的表达。

实施例4 

本实施例的实施方式与实施例1基本相同，在此基础上：

按照下述步骤，进行精子唾液酸酶NEU3的表达检测：

A 收集新鲜液化精液标本，离心分离出精子，PBS洗涤精子2次；

B 计数精子数量，冰上置30 min；

C 采用0.1%的Triton X-100对精子进行预处理，PBS洗涤精子2次，用3%的PFA再次对精子进行预处理；

D采用甲醇固定；

E 采用1ug/ul的抗人NEU1抗体孵育3 h，PBS洗涤精子2次；

F 在常温下，精子在1:1000的常规荧光二抗中孵育2 h；

G 采用流式细胞仪检测或荧光显微镜制作精子的细胞涂片，观察唾液酸酶在精子中的表达。

实施例5 

本实施例的实施方式与实施例1基本相同，在此基础上：

按照下述步骤，检测唾液酸酶活性：

A　收集新鲜液化精液标本，离心分离精子；

B　采用上游法，在5%的CO₂细胞培养箱中培养精子，收获上游精子，采用BWW培养液洗涤精子。

C　计数精子数量，用体外获能液HSA 5mg/ml HTF，在5%的CO₂细胞培养箱中孵育精子3h； 

D 先将经上述操作得到的溶液离心分离，收取的上清液再次离心分离，收取上清液；

E 立即将获能后的上清液用荧光法检测唾液酸酶活性。

实施例6 

本实施例的实施方式与实施例1基本相同，在此基础上：

按照下述步骤，检测唾液酸酶活性：

A　收集新鲜液化精液标本，离心分离精子；

B　采用上游法于36 ℃下，在5%的CO₂细胞培养箱中培养10 min，收获上游精子，采用BWW培养液洗涤精子3次。

C　计数精子数量，用体外获能液HSA 5mg/ml HTF，在5%的CO₂细胞培养箱中孵育精子4 h； 

D 先将经上述操作得到的溶液离心分离，收取的上清液再次离心分离，收取上清液；

E 立即将获能后的上清液用荧光蓝法检测唾液酸酶活性。

使用ABCAM的唾液酸酶检测试剂盒(Fluorometric - Blue) (ab138888)，检测获能上清液中的唾液酸酶活性。 

采用Ex/Em = ~320/~450 nm的荧光酶标仪检测，按阳性对照标准曲线，计算唾液酸活性，单位为：uUAUS /1×10⁶精子(微单位/1×10⁶精子)。 

实施例7 

第一步，按照下述步骤，进行精子唾液酸酶NEU1的表达检测：

A 收集新鲜液化精液标本，离心分离出精子，以500 g/min的速度低速离心6min，PBS洗涤精子3次；

B 计数精子数量，冰上置25 min；

C 采用0.1%的Triton X-100对精子进行预处理，PBS洗涤精子3次，用3%的PFA再次对精子进行预处理；

D采用1%的BSA-PBS溶液进行封闭；

E 采用1ug/ul的抗人NEU1抗体孵育2h，PBS洗涤精子3次；

F 在常温下，精子在1:1000的常规荧光二抗中孵育1.5 h；

G 采用流式细胞仪检测或荧光显微镜制作精子的细胞涂片，观察唾液酸酶在精子中的表达。

再按照下述步骤，进行精子唾液酸酶NEU3的表达检测： 

A 收集新鲜液化精液标本，离心分离出精子，以500 g/min的速度低速离心6min，PBS洗涤精子3次；

B 计数精子数量，冰上置25 min；

C 采用0.1%的Triton X-100对精子进行预处理，PBS洗涤精子3次，用3%的PFA再次对精子进行预处理；

D采用甲醇固定；

E 采用1ug/ul的抗人NEU1抗体孵育2h，PBS洗涤精子3次；

F 在常温下，精子在1:1000的常规荧光二抗中孵育1.5 h；

G 采用流式细胞仪检测或荧光显微镜制作精子的细胞涂片，观察唾液酸酶在精子中的表达。

流式细胞仪检测后分析单个精子荧光强度，采用两种比较方法：a 绝对比较：所检测标本与抗体的同型对照（同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景）b 相对比较：同批量检测标本之间比较单个精子荧光强度。 

本发明利用单精子荧光强度分析（同型对照/批量对照）可相对直观的量化唾液酸酶在精子的表达；或者利用显微镜下荧光成像可直观的观察到唾液酸酶的表达，所以本发明采用的是一种直观成像与相对量化的检测方法来评估精子表达唾液酸酶(NEU1/3)的一种方法。 

上述检测发现唾液酸酶NEU1和唾液酸酶NEU3在精子中的高表达，第二步，按照如下操作检测唾液酸酶活性： 

A　收集新鲜液化精液标本，离心分离精子，以500 g/min的速度低速离心6min；

B　采用上游法于37 ℃下，在5%的CO₂细胞培养箱中培养30 min，收获上游精子，采用BWW培养液洗涤精子3次。

C　计数精子数量，用体外获能液HSA 5mg/ml HTF，在5%的CO₂细胞培养箱中孵育精子3.5h； 

D 先将经上述操作得到的溶液离心分离，收取的上清液再次离心分离，收取上清液；

E 立即将获能后的上清液用荧光法检测唾液酸酶活性。

实施例8 

本实施例与实施例7基本相同，在此基础上：

按照如下操作检测唾液酸酶活性：

A　收集新鲜液化精液标本，离心分离精子，以600 g/min的速度低速离心5min；

B　采用上游法于36.5 ℃下，在5%的CO₂细胞培养箱中培养20min，收获上游精子，采用BWW培养液洗涤精子3次。

C　计数精子数量，调整为1×10⁷/ml以上，用体外获能液HSA 5mg/ml HTF，在5%的CO₂细胞培养箱中孵育精子3.5h； 

D 先将经上述操作得到的溶液离心分离，收取的上清液再次离心分离，收取上清液；

E 立即将获能后的上清液用荧光法检测唾液酸酶活性。

实施例9 

本实施例与实施例7基本相同，在此基础上：

按照如下操作检测唾液酸酶活性：

A　收集新鲜液化精液标本，离心分离精子，以550 g/min的速度低速离心5.5min；

B　采用上游法于36℃，在5%的CO₂细胞培养箱中培养15 min，收获上游精子，采用BWW培养液洗涤精子3次。

C　计数精子数量，调整为1×10⁷/ml以上，用体外获能液HSA 5mg/ml HTF于36℃ ，5%的CO₂细胞培养箱中孵育3.5 h，反应体积100ul。 

D 先将经上述操作得到的溶液离心分离，以500 g/min的速度低速离心6min，收取的上清液再次离心分离，以5000g/min的速度低速离心15min，收取上清液； 

E 立即将获能后的上清液用荧光法检测唾液酸酶活性。

实施例10 

本实施例与实施例7基本相同，在此基础上：

按照如下操作检测唾液酸酶活性：

A　收集新鲜液化精液标本，离心分离精子，以580g/min的速度低速离心5min；

B　采用上游法于37 ℃下，在5%的CO₂细胞培养箱中培养2 min，收获上游精子，采用BWW培养液洗涤精子3次。

C　计数精子数量，调整为1×10⁷/ml以上，用体外获能液HAS 5mg/ml HTF于37 ℃，5%的CO₂细胞培养箱中孵育3.5 h，反应体积200ul。 

D 先将经上述操作得到的溶液离心分离，以600 g/min的速度低速离心5 min，收取的上清液再次离心分离，以6000g/min的速度低速离心10 min，收取上清液； 

E 立即将获能后的上清液用荧光法检测唾液酸酶活性。

实施例11 

本实施例与实施例7基本相同，在此基础上：

按照如下操作检测唾液酸酶活性：

A　收集新鲜液化精液标本，离心分离精子，以520 g/min的速度低速离心5min；

B　采用上游法于36~37 ℃下，在5%的CO₂细胞培养箱中培养18 min，收获上游精子，采用BWW培养液洗涤精子3次。

C　计数精子数量，调整为1×10⁷/ml以上，用体外获能液HAS 5mg/ml HTF于36.5℃下，5%的CO₂细胞培养箱中孵育3.5 h，反应体积150ul。 

D 先将经上述操作得到的溶液离心分离，以540 g/min的速度低速离心5 .5min，收取的上清液再次离心分离，以5500g/min的速度低速离心12min，收取上清液； 

E 立即将获能后的上清液用荧光法检测唾液酸酶活性。