卡巴胆碱及其杂质含量的液相色谱检测方法

摘要

本发明公开了一种卡巴胆碱原料药、卡巴胆碱制剂中卡巴胆碱及杂质含量的高效液相色谱检测方法，采用亲水相互作用色谱体系进行分离，采用蒸发光散射、示差折光检测器或者质谱检测器进行检测，按外标法以峰面积的常用对数值与进样量的常用对数值作线性回归计算样品中卡巴胆碱及其杂质的含量。本发明的检测方法能够将卡巴胆碱及在卡巴胆碱原料产品中或者卡巴胆碱制剂中所含杂质如氯化胆碱和氯化乙酰胆碱有效分离，从而实现精确测定卡巴胆碱原料药与制剂中卡巴胆碱的含量及其杂质的含量，灵敏度高、重现性良好，适用于卡巴胆碱原料药、卡巴胆碱注射液、卡巴胆碱滴眼液、卡巴胆碱眼内注射溶液的质量控制。

说明书

技术领域

本发明涉及一种卡巴胆碱原料药及其含卡巴胆碱的制剂中卡巴胆碱含量及其杂质的液相色谱检测方法。

背景技术

卡巴胆碱为一种人工合成的M胆碱受体激动剂，具有促进胃肠动力扩张、血管抑制炎症因子释放等作用。临床上常用为快速强效缩瞳剂，具有双重缩瞳作用，能直接作用于瞳孔括约肌产生缩瞳作用，同时还有抗胆碱酯酶间接作用，能维持长时间的缩瞳效果。 

目前国内外药典针对卡巴胆碱的原料药的含量测定用的是非水滴定法，如中国药典2010版二部、USP35、BP2012以及EP7.0；而对于卡巴胆碱制剂的含量测定，如中国药典收载的卡巴胆碱注射液以及USP35收载的卡巴胆碱滴眼液，用的是紫外分光光度法，前处理非常的繁琐，需要用到次氯酸钠、苯酚、盐酸等试剂。而杂质的检测方法，只有EP7.0收载了，选择的是薄层检视。以上检测方法，对主成分以及杂质没有进行分离检测，主成分卡巴胆碱的含量测定数据就会受到杂质的干扰，造成偏差，并且杂质的检查方法不够灵敏。这些方法操作复杂，结果重现性差。由于卡巴胆碱与其他胆碱类杂质都属于强极性的小分子化合物，一般的反相色谱柱上保留较弱，分离效果不佳；并且在紫外吸收光谱上末端吸收，流动相及杂质干扰较大，因此选择常规的RP-HPLC-UV法无法定量检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中操作复杂、重现性差、灵敏度低等缺陷，提供一种方便、快捷、准确的高效液相色谱方法来测定卡巴胆碱原料药以及制剂的卡巴胆碱的含量，并且还可以对杂质氯化胆碱和氯化乙酰胆碱进行定量检测，方法的专属性以及灵敏度提高，并且操作更为简单，通用性得以提高，使得药品的质量控制工艺得以提高。

本发明的卡巴胆碱及其杂质含量的液相色谱检测方法，包括下述步骤：

（1）对照品和供试品溶液制备

取对照品和供试品分别加体积比50-90:10-50的乙腈-水或甲醇-水配制成每1ml各含0.5-1.5mg对照品、供试品的溶液，摇匀过滤，分别取续滤液作为对照品溶液、供试品溶液；所述对照品为卡巴胆碱、氯化胆碱和氯化乙酰胆碱；所述供试品为卡巴胆碱原料药或者卡巴胆碱制剂；

（2）液相色谱分离

采用亲水相互作用色谱体系对卡巴胆碱及其杂质进行分离；采用蒸发光散射、示差折光检测器或者质谱检测器进行检测；色谱条件如下：

色谱柱：氨基、氰基、二醇基、酰胺基或磺酸基键合的硅胶色谱柱；色谱柱内径2-8mm，色谱柱长度250±100mm，填充物粒径1.5-10um；

流动相：甲醇和/或乙腈与醋酸铵水溶液的混合溶液，醋酸铵水溶液的浓度为5-60mmol/L；

流速：1.0±0.5ml/min；

柱温：30± 15℃；

蒸发光散射检测器的漂移管温度为80±5℃，以高纯氮气作为雾化气，流速为1.6±0.5L/min；

（3）浓度计算方法和检测限

按外标法以峰面积的常用对数值与进样量ug的常用对数值作线性回归计算样品中卡巴胆碱及其杂质的含量。

优选的，步骤（1）所述对照品和供试品的配制溶液为体积比70:30的乙腈-水溶液或甲醇-水溶液。

优选的，步骤（2）所述色谱柱为二醇基、酰胺基或磺酸基键合的硅胶色谱柱。

作为优选，步骤（2）所述流动相为甲醇：醋酸铵水溶液（v/v）=40~99%:1~60%或乙腈：醋酸铵水溶液（v/v）=40~99%:1~60%或甲醇：乙腈：醋酸铵水溶液（v/v/v）=98~1%:98~1%：1~60%。

作为优选，本发明卡巴胆碱及其杂质含量的液相色谱检测方法，采用下述步骤：

（1）对照品溶液制备

   取对照品卡巴胆碱、氯化胆碱、氯化乙酰胆碱适量加体积比70:30的乙腈-水制成每1ml各含1mg对照品、供试品的溶液，摇匀，过0.45mm微孔滤膜，取续滤液作为对照品溶液；

（2）供试品溶液制备

称取卡巴胆碱原料药或者卡巴胆碱制剂，加体积比70:30的乙腈-水制成每1mL含1mg的溶液，用0.45um微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液；

（3）液相色谱分离

色谱条件如下：

色谱柱：酰胺基硅胶色谱柱；色谱柱内径4.6mm，色谱柱长度250mm，填充物粒径5um；

流动相：乙腈：醋酸铵水溶液（v/v）=70%:30%，醋酸铵水溶液浓度为40mmol/L；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

采用蒸发光散射器进行检测，蒸发光散射器的漂移管温度为80℃，以高纯氮气作为雾化气，流速为1.6L/min；

（4）浓度计算方法和检测限

按外标法以峰面积的常用对数值与进样量ug的常用对数值作线性回归计算样品中卡巴胆碱及其杂质的含量。

本发明是一种卡巴胆碱原料药及其含卡巴胆碱的制剂中卡巴胆碱含量及其杂质的高效液相色谱检测方法。采用亲水相互作用色谱体系进行分离，流动相为甲醇或乙腈与醋酸铵的混合液或甲醇、乙腈与醋酸铵的混合液或甲醇、乙腈与醋酸铵的混合液等度分离，流速为0.5~1.5ml/min，柱温为15℃~45℃，样品预处理为采用乙腈与水或甲醇与水超声提取样品，采用蒸发光散射或者示差折光、质谱检测器进行检测，以外标法定量测定结果。所述亲水相互作用色谱体系，是极性基团键合硅胶为填充剂的液相色谱柱（NH2、SiO₂、CN、DiO₂、Amide、Amphion等）。优选的固定相为酰胺基键合的硅胶色谱柱。优选的色谱柱规格，内径是4.6mm，色谱柱长度是250mm，填充物粒径是5um。

本发明的检测方法能够将卡巴胆碱及在卡巴胆碱原料产品中或者卡巴胆碱制剂中所含杂质如氯化胆碱和氯化乙酰胆碱有效分离，从而实现精确测定卡巴胆碱原料药与制剂中卡巴胆碱的含量及其杂质的含量，灵敏度高、重现性良好，适用于卡巴胆碱原料药、卡巴胆碱注射液、卡巴胆碱滴眼液、卡巴胆碱眼内注射溶液的质量控制。本发明方法操作简捷，样品色谱分析只需20分钟内完成。

附图说明

图1为卡巴胆碱原料药在Hilic Amide色谱柱出的色谱图；

图2为卡巴胆碱注射液在Hilic Amide色谱柱出的色谱图；

图3为卡巴胆碱原料药在Hilic DiO₂色谱柱出的色谱图；

图4为卡巴胆碱原料药在Hilic CN色谱柱出的色谱图；

图中，1：氯化胆碱；2：氯化乙酰胆碱；3：卡巴胆碱。

具体实施方式

下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。

实施例1

（1）对照品溶液制备

   取对照品卡巴胆碱、氯化胆碱、氯化乙酰胆碱适量加体积比70:30的乙腈-水制成每1ml各含1mg的溶液，摇匀，过0.45mm微孔滤膜，取续滤液作为对照品溶液；

（2）供试品溶液制备

取卡巴胆碱原料药，含量为99%，加体积比70:30的乙腈-水制成每1mL含1mg卡巴胆碱的溶液，用0.45um微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液；

（3）液相色谱分离

色谱条件如下：

色谱柱：酰胺基硅胶色谱柱（Hilic Amide）；色谱柱内径4.6mm，色谱柱长度250mm，填充物粒径5um；

流动相：乙腈：醋酸铵水溶液（v/v）=70:30，醋酸铵水溶液浓度为40mmol/L；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

采用蒸发光散射器进行检测，蒸发光散射器的漂移管温度为80℃，以高纯氮气作为雾化气，流速为1.6L/min；

（4）浓度计算方法和检测限

按外标法以峰面积的常用对数值与进样量ug的常用对数值作线性回归计算样品中卡巴胆碱及其杂质的含量。色谱图如图1。

本发明方法的检测限为（信噪比≥3）；线性范围为，相关系数r为；精密度不超过2.0%；重复性不超过2.0%；回收率达到92%以上。

实施例2

（1）对照品溶液制备

   取对照品卡巴胆碱、氯化胆碱适量加体积比70:30的乙腈-水制成每1ml各含1mg对照品、供试品的溶液，摇匀，过0.45mm微孔滤膜，取续滤液作为对照品溶液；

（2）供试品溶液制备

精密移取卡巴胆碱注射液，标示量为1ml：0.1mg，用0.45um微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液；

（3）液相色谱分离

色谱条件如下：

色谱柱：酰胺基硅胶色谱柱（Hilic Amide）；色谱柱内径3.9mm，色谱柱长度250mm，填充物粒径4um；

流动相：乙腈：醋酸铵水溶液（v/v）=75%:25%，醋酸铵水溶液浓度为20mmol/L；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

采用蒸发光散射器进行检测，蒸发光散射器的漂移管温度为85℃，以高纯氮气作为雾化气，流速为1.8L/min；

（4）浓度计算方法和检测限

按外标法以峰面积的常用对数值与进样量ug的常用对数值作线性回归计算样品中卡巴胆碱及其杂质的含量。色谱图如图2。

实施例3

（1）对照品溶液制备

   取对照品卡巴胆碱、氯化胆碱、氯化乙酰胆碱适量加体积比70:30的乙腈-水制成每1ml各含1mg对照品、供试品的溶液，摇匀，过0.45mm微孔滤膜，取续滤液作为对照品溶液；

（2）供试品溶液制备

称取卡巴胆碱原料药，含量为99%，加体积比70:30的乙腈-水制成每1mL含1mg的溶液，用0.45um微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液；

（3）液相色谱分离

色谱条件如下：

色谱柱：二醇基硅胶色谱柱（Hilic DiO₂）；色谱柱内径3.0mm，色谱柱长度150mm，填充物粒径3um；

流动相：乙腈：醋酸铵水溶液（v/v）=80%:20%，醋酸铵水溶液浓度为10mmol/L；

流速：1.2ml/min；

柱温：25℃；

采用蒸发光散射器进行检测，蒸发光散射器的漂移管温度为80℃，以高纯氮气作为雾化气，流速为1.6L/min；

（4）浓度计算方法和检测限

按外标法以峰面积的常用对数值与进样量ug的常用对数值作线性回归计算样品中卡巴胆碱及其杂质的含量。色谱图如图3。

实施例4

（1）对照品溶液制备

   取对照品卡巴胆碱、氯化胆碱、氯化乙酰胆碱适量加体积比70:30的乙腈-水制成每1ml各含0.5mg对照品、供试品的溶液，摇匀，过0.45mm微孔滤膜，取续滤液作为对照品溶液；

（2）供试品溶液制备

称取卡巴胆碱原料药，含量为99%，加体积比70:30的乙腈-水制成每1mL含0.5mg的溶液，用0.45um微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液；

（3）液相色谱分离

色谱条件如下：

色谱柱：氰基键合硅胶色谱柱（Hilic CN）；色谱柱内径4.0mm，色谱柱长度150mm，填充物粒径5um；

流动相：甲醇：醋酸铵水溶液（v/v）=90:10，醋酸铵水溶液浓度为20mmol/L；

流速：0.8ml/min；

柱温：25℃；

采用示差折光检测器进行检测，检测器温度30℃；

（4）浓度计算方法和检测限

按外标法以峰面积与进样量ug作线性回归计算样品中卡巴胆碱及其杂质的含量。色谱图如图4。