一种用废糖蜜和地沟油双碳源发酵生产槐糖脂的方法

摘要

本发明公开了一种用废糖蜜和地沟油双碳源发酵生产槐糖脂的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）将球拟酵母菌接种到YPD斜面培养基上制菌悬液（2）制种子液（3）将种子液接种于以废糖蜜和地沟油为底物的发酵培养基中发酵（4）乙酸乙酯提取槐糖脂。本发明实现废弃物的资源化利用，大大降低了槐糖脂的生产成本。解决了地沟油排放污染大、再次进入食用领域危害大的问题，实现了地沟油资源的合理化利用。该工艺不需要复杂的设备，而且发酵过程简单易行，有利于槐糖脂的开发、应用和推广。

说明书

技术领域

本发明属于生物表面活性剂的制备技术领域，具体涉及一种用废糖蜜和地沟油双碳源发酵生产槐糖脂的方法。

背景技术

表面活性剂除了在日常生活中作为洗涤剂，其他应用几乎可以覆盖所有的精细化工领域。槐糖脂是一种由微生物产生的环境友好型生物表面活性剂，与化学合成或石油炼制法生产的表面活性剂相比，除共有特性外，还具有其自身优点。槐糖脂为糖脂系生物表面活性剂，具有毒性低，与人体和环境相容性好，有良好的乳化、分散、增溶等特性；在食品、医药、化妆品、冶金、环境保护、废油回收等领域具有研究和开发价值。槐糖脂的结构稳定性高，由其可制得各种衍生物，是糖脂系生物表面活性剂中最有应用前途的。目前已在食品工业、石油工业、环境保护、化妆品、洗涤剂及药学中得到了不同程度的应用，国际上对槐糖脂的理论研究及应用开发已开展多年，我国目前该领域还处于起步阶段。

发酵培养基组分是决定槐糖脂生物表面活性剂生产成本的重要因素。目前，槐糖脂发酵大都采用油溶性和水溶性双碳源发酵技术，其中，油溶性碳源主要包括油酸、菜籽油、花生油、大豆油等，水溶性碳源一般为葡萄糖。上述碳源本身价格较高，导致槐糖脂的生产成本高居不下，不利于槐糖脂的推广应用。

废糖蜜是制糖厂的一种副产品，不仅含有高达 40-55%的可发酵糖，而且含有Na⁺、K⁺ Ca²⁺等微生物生长的必须元素以及维生素、蛋白质等有利于微生物生长的营养物质，可作为葡萄糖等水溶性碳源的替代品用于槐糖脂发酵生产中。随着我国制糖工业的发展，废糖蜜的产量日益增加，来源丰富，是大规模工业发酵生产的良好原料。

地沟油也称餐饮废油或废弃食用油脂，主要成分为棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸，其脂肪酸组成与其他动植物油脂的基本一样，碳链长度在14~18个，可作为花生油等油溶性碳源的替代品用于槐糖脂发酵生产中。目前，随着人民生水平的提高，地沟油的产量也越来越大，据不完全统计，我国地沟油的年产量在400~800万吨；如不及时回收利用，不仅造成严重的环境污染，而且可能通过一些不法企业的加工回流进入食用油市场，对人们身体健康造成严重危害。

生物表面活性剂作为一种新型绿色表面活性剂，在日用化工、石油开采、环境修复等领域具有良好的应用前景，目前，高昂的生产成本是限制槐糖脂生物表面活性剂在各工业行业广泛应用的关键。目前采用地沟油作疏水碳源的报道一方面集中在检测方法上，另一方面主要集中在生物柴油及脂肪酸的酯化和皂化上，作为底物进行发酵的还未见报道。因此，如何开发以废弃物为底物发酵制备槐糖脂的方法，变废为宝的同时，提高其利用价值，大大降低槐糖脂的生产成本，是本发明要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于克服上述已有技术的不足之处，提供一种用废糖蜜和地沟油双碳源发酵生产槐糖脂的方法，是一种行之有效且可降低槐糖脂生产成本、易于生产应用的方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种用废糖蜜和地沟油双碳源发酵生产槐糖脂的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）菌悬液的制备：将球拟酵母菌 (Torulopsis bombicola) ATCC 22214接种到由葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和琼脂组成的YPD斜面培养基上，用蒸馏水定容至1L，pH= 6.0；

于30℃恒温培养2-3天，用适量质量浓度为0.85%的生理盐水洗脱菌体，制得菌悬液； 

（2）制种子液：将由葡萄糖、酵母粉和尿素组成的种子培养基100ml置于500ml的摇瓶中， 121℃灭菌20min，冷却后按照体积百分比3-5%的接种量接入上述菌悬液，然后将摇瓶置于25-32℃、120-180rpm的摇床上培养24h，得到种子液；

（3）发酵：将上述种子液用于接种无菌的5L发酵罐以废糖蜜和地沟油为底物的发酵培养基中，用自来水定容至3L，pH=6.0，将发酵培养基于121℃灭菌20min，冷却后将上述种子液接入发酵培养基中，保持发酵温度25-32℃，溶氧20-60%，进行发酵；

（4）制槐糖脂：发酵结束后，用与发酵液等体积的有机溶剂乙酸乙酯提取槐糖脂，减压蒸馏除去有机溶剂，得到槐糖脂。

上述步骤（1）中的斜面培养基组成(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10，琼脂15-20。

上述步骤（1）中的菌悬液中菌细胞含量约为10⁷-10⁸个/mL。

上述步骤（2）中的种子培养基组成(g/L)：葡萄糖60-100，酵母粉5-8，尿素0.5-1。

上述步骤（3）中的发酵培养基组成(g/L)：地沟油60-120，废糖蜜60-180，酵母粉3-5。

上述步骤（3）中的将种子液按照体积比3-5%的接种量接入发酵培养基中。 

上述步骤（3）中的发酵时间为72-120h。

上述步骤（4）中槐糖脂的产量为30-100g/L。

上述步骤（3）中的地沟油采用了两种：一是精制的地沟油（市面上购买的），二是从食堂外的地沟里回收的，仅经过简单的离心处理，取上层油层作原料。

本发明的有益效果：

1、本发明采用废糖蜜和地沟油双碳源发酵生产槐糖脂的工艺技术，实现废弃物的资源化利用，减少环境污染治理费用，大大降低了槐糖脂的生产成本。

2、解决了地沟油排放污染大、再次进入食用领域危害大的问题，打开了地沟油回收利用的“瓶颈”，有效保障了人们身体健康，实现了地沟油资源的合理化利用。 

3、该工艺不需要复杂的设备，而且发酵过程简单易行，有利于槐糖脂的开发、应用和推广。

4、该方法还可以通过连续补料发酵进行槐糖脂的生产，实际应用价值较高，市场前景广阔。

具体实施方式

实施例1

(1) 将球拟酵母 (Torulopsis bombicola) ATCC 22214接种到YPD斜面培养基上，30℃恒温培养2天，用为0.85%的生理盐水洗脱菌体，制成细胞含量约为5.3×10⁷个/mL的菌悬液；

(2) 种子液的制备：种子培养基组成(g/L)：葡萄糖60，酵母粉5，尿素0.5，pH 6.0；将100mL该种子培养基置于500mL摇瓶，121℃灭菌20min，冷却后按照体积百分比3%的接种量接入上述菌悬液，将摇瓶置于25℃，转速120rpm的摇床上培养24h，得到种子液； 

(3) 上述种子液用于接种无菌5L发酵罐以废糖蜜和地沟油为底物的发酵培养基中。发酵培养基组成(g/L)：地沟油60，废糖蜜60，酵母粉3，pH=6.0，自来水定容至3L，121℃灭菌20min，冷却后按照体积比3%的接种量将上述种子液接入发酵培养基中，发酵温度30℃，溶氧为20%，发酵时间72h；

（4）发酵结束后，用与发酵液等体积的乙酸乙酯提取槐糖脂，减压蒸馏除去有机溶剂，得到槐糖脂产量为33.5g/L。

实施例2

(1) 将球拟酵母 (Torulopsis bombicola) ATCC 22214接种到YPD斜面培养基上，30℃恒温培养2天，用为0.85%的生理盐水洗脱菌体，制成细胞含量约为6.2×10⁷个/mL的菌悬液；

(2) 种子液的制备：种子培养基组成(g/L)：葡萄糖80，酵母粉6，尿素0.8，pH 6.0；将100mL该种子培养基置于500mL摇瓶，121℃灭菌20min，冷却后按照体积百分比4%的接种量接入上述菌悬液，将摇瓶置于28℃，转速150rpm的摇床上培养24h，得到种子液；

(3) 上述种子液用于接种无菌的5L发酵罐以废糖蜜和地沟油为底物的发酵培养基中。发酵培养基组成(g/L)：地沟油80，废糖蜜100，酵母粉4，pH=6.0，自来水定容至3L，121℃灭菌20min，冷却后按照体积比4%的接种量将上述种子液接入发酵培养基中，发酵温度28℃，溶氧为35%，发酵时间84h；

（4）发酵结束后，用与发酵液等体积的乙酸乙酯提取槐糖脂，减压蒸馏除去有机溶剂，得到槐糖脂产量为59.0g/L。

实施例3

(1) 将球拟酵母 (Torulopsis bombicola) ATCC 22214接种到YPD斜面培养基上，30℃恒温培养2天，用为0.85%的生理盐水洗脱菌体，制成细胞含量约为7.4×10⁷个/mL的菌悬液；

(2) 种子液的制备：种子培养基组成(g/L)：葡萄糖100，酵母粉7，尿素1，pH 6.0；将100mL该种子培养基置于500mL摇瓶，121℃灭菌20min，冷却后按照体积百分比5%的接种量接入上述菌悬液，将摇瓶置于30℃，转速180rpm的摇床上培养24h，得到种子液；

(3) 上述种子液用于接种无菌的5L发酵罐以废糖蜜和地沟油为底物的发酵培养基中。发酵培养基组成(g/L)：地沟油100，废糖蜜160，酵母粉4，pH=6.0，自来水定容至3L，121℃灭菌20min，冷却后按照体积比4%的接种量将上述种子液接入发酵培养基中，发酵温度30℃，溶氧为45%，发酵时间96h；

（4）发酵结束后，用与发酵液等体积的乙酸乙酯提取槐糖脂，减压蒸馏除去有机溶剂，得到槐糖脂产量为83.4g/L。

实施例4

(1) 将球拟酵母 (Torulopsis bombicola) ATCC 22214接种到YPD斜面培养基上，30℃恒温培养2天，用为0.85%的生理盐水洗脱菌体，制成细胞含量约为8.5×10⁷个/mL的菌悬液；

(2) 种子液的制备：种子培养基组成(g/L)：葡萄糖80，酵母粉8，尿素0.8，pH 6.0；将100mL该种子培养基置于500mL摇瓶，121℃灭菌20min，冷却后按照体积百分比5%的接种量接入上述菌悬液，将摇瓶置于32℃，转速180rpm的摇床上培养24h，得到种子液；

(3) 上述种子液用于接种无菌的5L发酵罐以废糖蜜和地沟油为底物的发酵培养基中。发酵培养基组成(g/L)：地沟油120，废糖蜜180，酵母粉5，pH=6.0，自来水定容至3L，121℃灭菌20min，冷却后按照体积比5%的接种量将上述种子液接入发酵培养基中，发酵温度32℃，溶氧为60%，发酵时间120h；

（4）发酵结束后，用与发酵液等体积的乙酸乙酯提取槐糖脂，减压蒸馏除去有机溶剂，得到槐糖脂产量为99.3g/L。