人体内含有外源重组DNA来源的转录本、DNA片段、或其翻译产物,及其检测方法和应用

摘要

本发明涉及人体内含有外源重组DNA来源的转录本、DNA片段、或其翻译产物，及其检测方法和应用。具体地，人体内来自于外源重组DNA的氨苄青霉素抗性基因的一种转录本(rAmp)能够与内源酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)基因的转录本发生反式剪接，从而形成一种独特的新转录本及其翻译产物。本发明还提供了检测人体内是否含外源重组DNA来源的转录本、DNA片段、或其翻译产物的方法和应用。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学、分子遗传学和细胞生物学领域，具体地，本发明涉及人体内含有外源重组DNA来源的转录本、DNA片段、或其翻译产物，及其检测方法和应用。 

背景技术

重组DNA技术自上世纪七十年代创立以来发展非常快速，不仅产生了分子生物学这一新生学科，也拓展了各类生命学科及其相关学科的前沿基础研究，并且建立了动物、植物、微生物等的细胞、组织、器官、个体等转基因系统。这些研究成果的成功运用获得各种大量的转基因产物，特别是建立了在临床医学中对与疾病治疗和应用相关的基因工程与基因治疗等体系。这些发展既具有商业性、经济性等方面巨大的建设与价值，也产生理论性、社会性等深远的影响与意义。 

利用重组DNA技术建立的各种转基因系统，包括利用重组载体（Vector）或重组质粒（Plasmid）或其它特异重组DNA等，将人工分离或修饰的基因导入到生命体细胞内或进入基因组中，导入基因的表达可以引起宿主生命体性状的可遗传的修饰，建立的这一重组DNA技术系统称之为转基因系统。 

在转基因过程中，体外构建重组载体或重组质粒或其它特异重组DNA等必不可少，通常其含有复制起点、启动子、标记基因、翻译控制元件、转录终止子等各种元件、或其组合元件，使可携带经过人工改造的目的基因或DNA片段进入宿主细胞内或进入基因组内。 

随着重组DNA技术的广泛应用，除转基因系统体外构建的重组载体或重组质粒或其它特异重组DNA等外，还包括大量构建的不同容量的重组DNA库、突变DNA库及其筛选系统等。这些重组DNA技术的产物也已在自然环境中分布，许多已知的这类基因存在于转座子、整合子或质粒中，能够通过接合 (conjunction)或水平基因转移(horizontal gene transfer，HGT)等方式进入到同种甚至不同种的其它细菌等生命体，如在人类的一些病原生物和共生细菌(肠道微生物群)中都有抗性基因转移的证据等，但是否已进入人体内细胞或基因组、是否进入人体内细胞或基因组表达并引起作用，国际社会在非常密切关注中。 

由于重组DNA技术的迅速发展，人们对包括转基因系统、DNA库筛选系统等的安全性越来越重视。就转基因食品而言，虽然市场上第一个转基因食品早在上个世纪九十年代初就出现在美国市场，但是目前经美国食品和药物管理局确定的转基因食品品种只有几十种。此外，由于转基因作物或植物或微生物是人工制造的物种，这些物种对于自然界原来存在的物种而言，是一种外来物种，而且，这些外来物种对环境或生物多样性造成威胁或危险会持续一段较长的时间，如需10年或更长的时间。 

目前本领域尚不明确重组DNA技术的外源产物是否已进入人或非人哺乳动物的体内细胞或基因组、是否进入体内细胞或基因组表达并引起作用、是否由新生重组启动子或其它连接的启动子转录表达、人体内外源重组DNA的转录本或翻译产物或DNA片段及其对人体内源基因组DNA或其来源的转录本与翻译产物的影响等，因此迫切需要进行这些方面的研究。 

发明内容

本发明的目的就是提供一种人体内含有外源重组DNA来源的转录本、DNA片段、或其翻译产物及其检测方法和应用。 

在本发明的第一方面，提供了一种分离的转录本，所述转录本分离自人或非人哺乳动物，并且所述的转录本是： 

(a)：来自于外源重组DNA的转录本与人或非人哺乳动物基因组的转录本的剪接转录本；或 

(b)：来自于外源重组DNA的未剪接的转录本。 

在另一优选例中，所述的转录本是氨苄青霉素抗性基因或其片段与酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)基因或其片段组成的剪接转录本；优选地，所述的剪接转录本具有如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸。 

在另一优选例中，所述的转录本是来自于外源重组DNA的未剪接的氨苄青霉素抗性基因或其DNA片段的转录本；优选地，所述的转录本具有如SEQ ID NO.:2所示的多核苷酸。 

在本发明的第二方面，提供了一种分离的DNA片段，所述的DNA片段分离自人或非人哺乳动物，并且所述的DNA片段来自于外源重组DNA，并重组于人或非人哺乳动物基因组中。 

在另一优选例中，所述的DNA片段编码权利要求1所述的来自于外源重组DNA的未剪接的转录本。 

在本发明的第三方面，提供了一种分离的翻译产物，所述的翻译产物是由第一方面所述转录本所翻译的。 

在本发明的第四方面，提供了一种第一方面所述的转录本、第二方面所述的DNA片段、或第三方面所述的翻译产物的用途，用于制备检测试剂或试剂盒，所述检测试剂或试剂盒用于检测人或非人哺乳动物基因组中是否含有来自于外源重组DNA的DNA片段，或所述的人或非人哺乳动物中是否存在来自于外源重组DNA的转录本或其翻译产物。 

在本发明的第五方面，提供了一种非诊断性和非治疗性的检测方法，包括步骤：检测待测样本中是否含有来自于外源重组DNA的DNA片段、或来自于外源重组DNA的转录本，或所述转录本的翻译产物，其中所述的待测样本为人或非人哺乳动物的样本，并且所述的来自于外源重组DNA的DNA片段、或来自于外源重组DNA的转录本，或所述转录本的翻译产物在样本中是不存在的。 

在另一优选例中，所述的内源基因组来源的转录本或翻译产物样本是没有被外源重组DNA污染的样本。 

在另一优选例中，所述的样本含DNA或RNA，并且所述检测包括步骤： 

(1)获得待测样本的基因组DNA，或将待测样本的RNA逆转录为DNA； 

(2)检测步骤(1)所述的DNA中是否含有来自于外源重组DNA的多核苷酸或其互补序列，并且所述的多核苷酸或其互补序列在内源基因组中、或其转录本中不存在。 

在另一优选例中，所述的转录本包括未剪接的转录本和经剪接的转录本。 

在另一优选例中，所述的经剪接的转录本包括经反式剪接或顺式剪接的转录本。 

在另一优选例中，所述的待测样本为人的样本。 

在另一优选例中，所述的人的样本选自下组：体液样本、唾液样本、血液样 本、血清样本、淋巴液样本、脊髓液样本、精液样本、尿液样本、毛发样本、细胞样本、组织样本、或器官样本。 

在另一优选例中，所述的外源重组DNA选自下组：表达载体或其片段、表达质粒或其片段、穿梭载体或其片段、穿梭质粒或其片段、重组载体或其片段、重组质粒或其片段、或其它特异重组DNA或其片段。 

在另一优选例中，所述重组载体为pBR322、pUC18/19、pFLAG、pGL、pGEM-T、pCMV、pBluescript或pcDNA系列，或其片段。 

在另一优选例中，所述的重组载体为pBR322。 

在另一优选例中，所述的来自于外源重组DNA的转录本为任选自下组的一个或多个转录本： 

(1)与连接的启动子同方向的正向转录本； 

(2)与连接的启动子反方向的反向转录本； 

(3)标记基因或抗性基因的正、反向转录本； 

(4)含有翻译控制元件的正、反向转录本； 

(5)含有转录终止子的正、反向转录本； 

(6)来源于所述体外重组DNA的其它转录本。 

在另一优选例中，所述的标记基因或抗性基因选自下组：二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因、绿色荧光蛋白基因、四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、其它特异标记基因等。 

在另一优选例中，所述的翻译控制元件为如核糖体结合元件、核糖体内部进入位点元件、上游小开放阅读框元件、5'非翻译区特异元件等。 

在另一优选例中，所述的转录本是：氨苄青霉素抗性基因或其片段与酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)基因或其片段组成的反式剪接转录本。 

在另一优选例中，所述的反式剪接转录本具有如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸。 

在另一优选例中，所述的检测包括： 

对于转录本或DNA片段，通过体外扩增法和/或核酸测序法进行检测；和/或 

对于转录本的翻译产物，用选自下组的方法进行检测：免疫沉淀法、电泳法、Western印迹法、色谱分离法、质谱分析法、氨基酸测序法、或其组合。 

在本发明的第六方面，提供了一种鉴定导致人或非人哺乳动物遗传变异的核苷酸序列分析的方法，包括步骤： 

(1)测定来自于人或非人哺乳动物的待测样本DNA和/或RNA的序列； 

(2)将所测定的样本DNA序列和/或RNA序列，与所属同种类的内源基因组序列和/或转录本序列比对，从而确定变异的序列，其中所述变异的序列是核苷酸序列的插入或置换； 

(3)将确定的变异序列与外源重组DNA的核苷酸序列进行比对，从而鉴别出来自于外源重组DNA且在同种类内源基因组中不存在的、导致人或非人哺乳动物遗传变异的核苷酸序列。 

在另一优选例中，所述方法还包括步骤： 

(4)检测所述人或非人哺乳动物中，是否存在对应于所述导致哺乳动物遗传变异的核苷酸序列的转录本或其翻译产物或DNA片段。 

在本发明的第六方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括： 

(1)使用说明书；以及 

(2)一容器以及位于所述容器内的试剂，所述试剂用于检测待测样本中的基因组中是否含有来自于外源重组DNA的DNA片段，或所述试剂用于检测待测样本中是否含有来自于外源重组DNA的转录本或其翻译产物； 

其中所述的待测样本为人或非人哺乳动物的样本，并且所述的来自于外源重组DNA的DNA片段、转录本或其翻译产物是人或非人哺乳动物的内源基因组或其来源的转录本或翻译产物中不存在的。 

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。 

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。 

图1显示人体内来自于外源重组DNA的氨苄青霉素抗性基因的一种转录本(rAmp)能够与ACAT1基因的转录本发生反式剪接，从而形成一种独特的新 转录本及其翻译产物；图1A显示质粒转染AC29细胞表达后经蛋白质二维电泳纯化的一种人ACAT1蛋白，其中带有人ACAT156kD异构体N端的蛋白为P1，P2和P3等三个点；图1B显示经MALDI-TOF质谱分析、蛋白质N端序列测定、蛋白质及DNA文库分析，测定人56kD异构体N端的氨基酸序列是来自于外源重组载体的氨苄青霉素抗性基因的一种转录本(rAmp)的翻译产物；图1C显示rAmp转录本与ACAT1基因转录本发生反式剪接的产物的序列测定分析结果；图1D显示人56kD异构体的N端序列是rAmp转录本翻译产物rAmp-P88的第1至第46个氨基酸组成的肽段。 

图2显示人血液白细胞（PBMC）基因组DNA中的rAmp DNA分析结果，PBMC经分离得到非贴壁(ua)和贴壁(a)细胞，抽提细胞基因组DNA后，利用特异性引物对rAmp DNA实施PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。 

图3显示人血液白细胞（PBMC）RNA中的rAmp RNA分析结果，抽提细胞总RNA后，利用特异性引物对rAmp RNA实施RT-PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。 

图4显示人血液白细胞（PBMC）RNA中外源rAmp RNA与内源ACAT1mRNA的反式剪接产物分析结果；图4A显示抽提细胞总RNA后，利用特异性引物对外源rAmp RNA与内源ACAT1mRNA的反式剪接产物实施RT-PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定；图4B显示反式剪接RNA的RT-PCR产物经测序鉴定。 

图5显示人血液白细胞（PBMC）中反式剪接mRNA的翻译产物分析，抽提细胞总蛋白后，利用特异性抗体对反式剪接mRNA的翻译产物实施Western blotting分析。 

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，人体内天然酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)基因的转录本竟然能够与来自于外源重组载体的氨苄青霉素抗性基因的一种转录本(rAmp)发生反式剪接，从而形成一种新转录本及其翻译产物。本发明还提供了待测样本中人体内含外源重组DNA来源的转录本或翻译产物或片段的检测方法和应用。在此基础上完成了本发明。 

术语 

酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶(ACAT) 

酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶(acyl-coenzyme A：cholesterol acyltransferase，ACAT)是细胞内唯一催化游离胆固醇与长链脂肪酸合成胆固醇酯的酶，是参与生命体吸收、转运或储存胆固醇而维持体内胆固醇代谢平衡的关键酶之一，在生命细胞游离胆固醇更新变化、维持血液胆固醇水平等平衡代谢的生理功能中起关键作用，病理上其与胆固醇代谢平衡异常引起的动脉粥样硬化(AS)、老年性痴呆症(AD)等病变直接相关。ACAT的主要包括成员ACAT1和ACAT2。 

与胆固醇代谢途径中的其它关键酶的快速研究进展相反，ACAT的研究进展相当缓慢，到目前为止天然的ACAT还未纯化得到，主要原因在于ACAT为内质网膜蛋白，其纯化十分困难。人ACAT1 cDNA K1是目前克隆得到唯一的人ACAT1基因的cDNA。人ACAT1 cDNA K1对应序列来源于两条染色体，由18个外显子组成，从5’至3’依次命名为外显子Xa、Xb和外显子1-16，其外显子Xa和外显子1-16分别与人7号和1号染色体的相应序列一致。外显子Xa下游和外显子1上游序列都是非典型的真核基因内含子剪接位点特征序列，而位于外显子Xa与外显子1之间的10bp微小外显子Xb的基因组定位至今仍未确定。序列来源于人两条不同染色体的ACAT1 cDNA K1在内源ACAT基因缺失的CHO细胞株AC29中表达时，除了能够以AUG_1397-1399密码子起始表达出人50 kD ACAT1之外，还表达出一种56 kD异构体蛋白。人50 kD和56 kD ACAT1异构体蛋白在细胞内具有相同的内质网定位，人ACAT1 56kD异构体的酶活性较低，约为人50 kD ACAT1酶活性的30%左右，当人56 kD和50 kD ACAT1异构体蛋白在同一个细胞中共表达时，测定的ACAT1活性仅为单独表达50 kD ACAT1时酶活性的50%，表明人ACAT1 56-kD异构体可调控细胞ACAT1活性。 

反式剪接(trans-splicing) 

如本文所用，术语“反式剪接”是指：剪接机器能够识别位于不连续的两分子pre-RNAs上的剪接位点，并将它们正确连接。在包括人的高等动物中都存在反式剪接。天然哺乳动物pre-RNA反式剪接现象有外显子的重复(exon duplication)(如鼠COT基因和人Sp1基因等)、有相邻基因间(intergenic)剪接(如人RGS12基因和细胞色素P450 3A基因)、以及属于跨染色体(interchromosomal)的反式剪接。 

抗生素抗性基因 

如本文所用，术语“抗生素抗性基因”是指编码抵抗某种抗生素的物质(如酶蛋白)的多核苷酸序列。常用的抗生素抗性基因包括(但不限于)：抗氨苄青霉素基因、抗四环素基因、抗新霉素基因、抗氯霉素基因、抗链霉素基因、抗卡那霉素基因。 

将所述的抗生素抗性基因置于重组质粒中，并将所述质粒转入宿主细胞中，在一定的条件下，可以赋予宿主细胞抵抗特定抗生素的能力。对于抗生素抗性基因的选择和重组质粒的制备是本领域的普通技术人员所熟知的。 

氨苄青霉素抗性基因 

如本文所用，术语“氨苄青霉素抗性基因”或“抗氨苄青霉素基因”是指编码β-内酰胺酶(beta-lactamase)的多核苷酸序列，所述编码的β-内酰胺酶蛋白可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化β-内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。氨苄青霉素抗性基因是目前重组质粒中最为常见的选择标记。 

重组载体 

如本文所用，术语“重组载体”是指经过人工构建或改造的能够携带目的DNA片段并在宿主细胞内实现复制的DNA载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、抗生素港行基因及启动子、翻译控制元件(如核糖体结合位点)、转录终止子、或其组合等。 

常见的重组载体包括(但不限于)：pBR322、pUC18/19、pFLAG、pGL、pGEM-T、pCMV、pBluescript、pcDNA3系列等。 

重组载体可以包括重组质粒和重组黏粒等。质粒具有性质稳定可靠和操作简便的优点，因此质粒要比其它任何载体都要好。本领域的普通技术人员可以使用常规方法在质粒载体上进行操作。这些方法包括DNA的体外重组技术、合成技术、体内重组技术等。重组载体上的特定DNA序列可有效连接到适当启动子的下游，以指导mRNA合成。 

重组载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或四环素或氨苄青霉素抗性。包含适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋 白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。 

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。 

转录本或对应的翻译产物与DNA片段 

本发明提供了一种分离的转录本，所述转录本分离自人或非人哺乳动物，并且所述的转录本是：来自于外源重组DNA的转录本与人或非人哺乳动物基因组的转录本的剪接转录本；或来自于外源重组DNA的未剪接的转录本。 

本发明还提供了一种分离的DNA片段，所述的DNA片段分离自人或非人哺乳动物，并且所述的DNA片段来自于外源重组DNA，并重组于人或非人哺乳动物基因组中；优选地，所述的DNA片段编码权利要求1所述的来自于外源重组DNA的未剪接的转录本。 

本发明还提供了一种分离的翻译产物，所述的翻译产物是由所述转录本所翻译的。 

本发明还提供所述转录本，或DNA片段，或翻译产物的用途，用于制备检测试剂或试剂盒，所述检测试剂或试剂盒用于检测人或非人哺乳动物中是否含有来自于外源重组DNA的DNA片段，或所述的人或非人哺乳动物中是否存在来自于外源重组DNA的转录本或其翻译产物。 

应用 

本发明提供了一种非诊断性和非治疗性的检测方法：检测待测样本中是否含有来自于外源重组DNA的DNA片段、或来自于外源重组DNA的转录本，或所述转录本的翻译产物，其中所述的待测样本为人或非人哺乳动物的样本，并且所述的来自于外源重组DNA的DNA片段、或来自于外源重组DNA的转录本，或所述转录本 的翻译产物在样本中是不存在的。 

在本发明的一个优选例中，所述的人或非人哺乳动物基因组来源的转录本或翻译产物或DNA片段样本是没有被外源重组DNA污染的样本。 

如果所述的样本含DNA或RNA，则所述方法优选地包括步骤：(1)获得待测样本的基因组DNA，或将待测样本的RNA逆转录为DNA；(2)检测步骤(1)所述的DNA中是否含有来自于外源重组DNA的多核苷酸或其互补序列，并且所述的多核苷酸或其互补序列在内源基因组中、或其转录本中不存在。 

更优选地，所述的转录本包括未剪接的转录本和经剪接的转录本；经剪接的转录本包括经反式剪接或顺式剪接的转录本。 

所述的待测样本为人的样本；人的样本选自下组：体液样本、唾液样本、血液样本、血清样本、淋巴液样本、脊髓液样本、精液样本、尿液样本、毛发样本、细胞样本、组织样本、或器官样本。 

或优选地，来自于外源重组DNA的转录本为任选自下组的一个或多个转录本：(1)与连接的启动子同方向的正向转录本；(2)与连接的启动子反方向的反向转录本；(3)标记基因或抗性基因的正、反向转录本；(4)含有翻译控制元件的正、反向转录本；(5)含有转录终止子的正、反向转录本；(6)来源于所述体外重组DNA的其它转录本。 

本发明所述的检测包括：对于来自于外源重组DNA的转录本或DNA片段，通过体外扩增法和/或核酸测序法进行检测；和/或对于转录本的翻译产物，用选自下组的方法进行检测：免疫沉淀法、电泳法、Western印迹法、色谱分离法、质谱分析法、氨基酸测序法、或其组合。 

本发明还提供了一种鉴定导致人或非人哺乳动物遗传变异的核苷酸序列分析的方法，包括步骤：测定来自于人或非人哺乳动物的待测样本DNA和/或RNA的序列；将所测定的样本DNA序列和/或RNA序列，与所属同种类的内源基因组序列和/或转录本序列比对，从而确定变异的序列，其中所述变异的序列是核苷酸序列的插入或置换；将确定的变异序列与外源重组DNA的核苷酸序列进行比对，从而鉴别出来自于外源重组DNA且在同种类内源基因组中不存在的、导致人或非人哺乳动物遗传变异的核苷酸序列。 

优选地，所述方法还包括步骤：检测所述人或非人哺乳动物中，是否存在对应于所述导致哺乳动物遗传变异的核苷酸序列或其来源的转录本或翻译产物或 DNA片段。 

试剂盒 

本发明提供了一种试剂盒，包括：使用说明书；以及一容器以及位于所述容器内的试剂，所述试剂用于检测待测样本中的基因组中是否含有来自于外源重组DNA的DNA片段，或所述试剂用于检测待测样本中是否含有来自于外源重组DNA的转录本或其翻译产物；其中所述的待测样本为人或非人哺乳动物的样本，并且所述的来自于外源重组DNA的DNA片段、转录本或其翻译产物是人或非人哺乳动物的内源基因组或其来源的转录本或翻译产物中不存在的。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

材料和方法 

细胞培养基RPMI1640和胎牛血清购自Life Technologies公司(Rockville,USA)；MMLV-逆转录酶购自Promega公司(Madison,USA)；Taq DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司(Dalian,China)；TRIzol Reagent购自Sigma公司(St.Louis,USA)；引物寡聚核苷酸由上海生工生物技术有限公司(Shanghai,China)合成；HRP耦联的Anti-rabbit IgG购自Pierce公司(Rockford,USA)；ECL检测试剂购自Santa Cruz Biotechnology公司(Santa Cruz,USA)；人AB血清、蛋白酶抑制剂购自Sigma公司(St.Louis,USA)；TIANamp Genomic DNA Kit购自北京TIANGENBIOTECH有限公司(Beijing,China)。真核表达载体pcDNA3购自Invitrogen公司(Carlsbad,USA)。 

Flag融合表达的ACAT1-NTP的纯化 

转染的AC29细胞培养48h后，利用含有相应蛋白酶抑制剂的裂解液(50mMTris HCl,pH7.4,150mM NaCl,1mM EDTA,1%Triton X-100)于冰上处理30min，12,000×g离心10min，取可溶部分裂解液加入到经TBS(50mM Tris HCl,150 mM NaCl,pH7.4)预处理的 M2 Affinity Gel中，4℃进行结合反应，过夜；1,000×g离心5min，收集结合有Flag融合蛋白的 M2Affinity Gel，用TBS洗涤数次去净非特异结合蛋白；加入100μl洗脱液(0.1Mglycine-HCl,pH3.5)洗脱Flag融合蛋白；洗脱液迅速加入到中和缓冲液(0.5MTris-HCl,pH7.4,1.5M NaCl)中，保存样品于-80℃备用。 

考马斯亮蓝快速染色 

含有分离蛋白样品的SDS-PAGE胶经去离子水漂洗，用25%的乙醇于微波炉中加热处理4min，弃净乙醇用去离子水漂洗，反复处理4次；然后用快染液(100mg CBB G250，100ml浓磷酸，定容至1,000ml)于微波炉中加热处理2min，脱色摇床上反应至显色。 

总蛋白制备及Western blot分析 

培养的细胞用预冷的PBS洗两次，用含有蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液(50mM Tris-HCl pH8.0，0.1%SDS，150mM NaCl，2mM MgCl2，1.5%NP-40，0.5%Deoxycholate，50mM DTT)溶解细胞蛋白质。蛋白溶液经18号注射器针头剪切10次，然后用37℃水浴30min。蛋白含量测定用BCA蛋白测定试剂盒(Bio-Rad)进行。按照Laemmli的方法(Laemmli UK.1970)，蛋白样品用12%或10%的SDS-PAGE电泳分离。电泳完毕后，利用Amersham湿式电转仪将蛋白转印到硝酸纤维素膜(NC)上，设定电流为400mA，时间2h。转印完毕后取出NC膜，含有转移蛋白的膜面向上。依次用封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST(50mMTris-HCl，0.15M NaCl和0.05%Tween-20，pH值为7.6)在室温孵育2h，特异抗体在室温孵育3h，HRP耦联的二抗室温孵育1h。孵育后分别用TBST和TBS洗NC膜三次。最后，用ECL检测试剂进行荧光显影。 

基因组DNA，总RNA制备及PCR，RT-PCR分析 

细胞基因组DNA的制备依照TIANamp Genomic DNA Kit提取试剂盒的说明操作。总RNA的制备利用Trizol Reagent(Sigma)抽提。 

反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)：cDNA的合成采用20μl反应体系中，含有4μg细胞总RNA或5μl体外剪接产物RNA、2pmol人ACAT1基因特异性逆转录引物、10nmol dNTPs、4μl5×First Strand Buffer和1μl(200U/μl)MMLV Reverse  Transcriptase，42℃反应1小时后，70℃15min灭活反应体系中的MMLV逆转录酶。多聚酶链式反应(PCR)在25μl反应体系中包含1μl逆转录合成的cDNA模板、5nmol dNTP、10pmol each of primer sets和1U Taq DNA polymerase。PCR反应条件如下：先94℃变性3min；再进入94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s的循环38次；最后72℃延伸5min。10μl PCR产物用2%agarose胶分离、鉴定其大小。所有特异性引物见下表（表1）。 

表1 

人血液白细胞的处理 

人血液白细胞（PBMC）通过上海市血液中心获得，研究方法经过中国科学院上海生命科学院相关部门允许。 

将细胞以1,100rpm水平离心5min，吸去上清培养基，用10ml RPMI1640+10%FBS重悬；取5μl到200μl新鲜RPMI1640培养基中混匀(稀释40倍)，从中取10μl进行细胞计数，以2.5×10⁷/60mm dish的细胞量接种细胞；在湿度95%、5%CO2、37oC的条件下静置培养2小时，使其自然贴壁分化。轻柔晃动细胞，收 集非贴壁细胞，用移液枪小心加入培养基(RPMI1640+7%人AB血清)，在湿度95%、5%CO2、37℃的条件下静置培养8天，中间每4天更换培养基，最后收集贴壁细胞。 

实施例1 

来自于外源重组DNA的氨苄青霉素抗性基因的一种转录本(rAmp)能够与ACAT1基因的转录本发生反式剪接并编码产生人ACAT156kD异构体 

在本实施例中，发明人利用细胞转染表达质粒、蛋白质二维电泳纯化、MALDI-TOF质谱分析、蛋白质N端序列测定、蛋白质及DNA文库分析等方法，鉴定人56kD异构体的N端序列来源。 

结果显示，人56kD异构体N端的氨基酸序列来自于外源重组载体的氨苄青霉素抗性基因的一种转录本(rAmp)的翻译产物（图1A，图1B），rAmp转录本能够与ACAT1基因的转录本发生反式剪接（图1C），人56kD异构体的N端序列是rAmp转录本翻译产物rAmp-P88的第1至第46个氨基酸组成的肽段（图1D）。 

以上结果表明，来自于外源重组DNA的rAmp转录本能够与ACAT1基因的转录本发生反式剪接并编码产生人ACAT156kD异构体。 

实施例2 

人血液白细胞基因组DNA中存在rAmp DNA 

为了研究来自于外源重组DNA的rAmp DNA是否存在于人体内，发明人通过上海市血液中心获得人血液白细胞（PBMC），经分离得到非贴壁(ua)和贴壁(a)细胞，抽提细胞基因组DNA后，利用特异性引物对rAmp DNA实施PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。 

结果显示，PBMC基因组DNA中确实存在rAmp DNA，且不同个体和不同细胞类型之间具有差异（图2）。 

实施例3 

人血液白细胞中有rAmp RNA的表达 

在本实施例中，发明人进一步抽提人血液白细胞（PBMC）总RNA，并利用特异性引物对rAmp RNA实施RT-PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定 

结果表明，PBMC中确实有rAmp RNA的表达，且不同个体和不同细胞类型 之间表达水平有所不同（图3）。 

实施例4 

人血液白细胞中有外源rAmp RNA与内源ACAT1mRNA的反式剪接产物 

为检测人血液白细胞（PBMC）中外源rAmp RNA与内源ACAT1mRNA的反式剪接产物，本实施例在抽提细胞总RNA后，利用特异性引物对反式剪接产物RNA实施RT-PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定。 

结果显示，在PBMC中检测到外源rAmp RNA与内源ACAT1mRNA的反式剪接产物（图4A），而且对应的RT-PCR产物经DNA测序鉴定正确（图4B）。 

实施例5 

人血液白细胞中存在反式剪接mRNA的翻译产物 

在本实施例中，发明人进一步抽提人血液白细胞（PBMC）总蛋白，并利用针对rAmp转录本翻译产物rAmp-P88和ACAT1蛋白的两种特异性抗体对反式剪接mRNA的翻译产物实施Western blotting分析。 

结果表明，PBMC中存在反式剪接mRNA的翻译产物，即PBMC内源性表达的人56kD异构体（图5）。 

实施例6 

试剂盒 

本实施例提供了一种试剂盒，包括：一容器以及位于所述容器内的试剂，所述试剂是用于检测氨苄青霉素抗性基因转录本与人基因转录本经剪接形成的反式剪接转录本或翻译产物的试剂；或检测来自于外源重组DNA的插入于基因组的DNA片段；以及使用说明书。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。