转Bt基因棉花外源重组DNA土壤分布特征与水平转移研究

摘要

转Bt基因棉花外源重组DNA在土壤环境中的分子行为及分布特征是转基因植物风险性研究的一项重要内容。本文通过田间试验，采用实时荧光PCR、末端片段多态性分析、菌落PCR和生物信息学等方法，系统研究了转Bt基因棉花外源重组DNA在土壤中的动态变化、空间分布特征，抗生素抗性基因向土壤微生物发生水平转移的生态风险，以及对土壤氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing bacteria，AOB)和氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea，AOA)群落结构组成和丰度的影响，为综合评价转Bt基因棉花的生态安全性提供理论依据。主要研究结果如下:
　　1.转Bt基因棉花外源重组DNA35S-Cry1A片段和35S-NPTⅡ片段拷贝数在土壤中时间动态变化一致。35S-Cry1A片段和35S-NPTⅡ片段拷贝数均随转Bt基因棉花的生长期的推进呈现先上升后下降的趋势。峰值基本出现在铃期（除2012年35 S-NPTⅡ片段峰值出现在蕾期）。铃期与蕾期的外源重组DNA片段拷贝数差异不显著，但与播种前和收获后期相比具有显著性差异(p＜0.05)。同年份同时期35S-Cry1A片段拷贝数均高于35S-NPTⅡ片段拷贝数。
　　2.转Bt基因棉花35S-Cry1A片段和35S-NPTⅡ片段在不同粒级土壤团聚体中分布特征一致。两种外源重组DNA片段拷贝数最大值均出现在500μm～2000μm粒径范围内的土壤团聚体中，其拷贝数均显著高于其他粒径范围(p＜0.05)。
　　3.卡那霉素抗性细菌平板培养结果发现，棉花苗期、蕾期、花铃期和吐絮期土壤中存在具有卡那霉素抗性的细菌。对不同时期获得的抗性细菌中的NPTⅡ基因进行克隆和测序分析，结果表明，所获得的抗性细菌中的NPTⅡ基因序列与转Bt基因棉花内的NPTⅡ基因序列不完全一致，由此可知未在土壤细菌中检测到转Bt基因棉花外源重组的NPTⅡ基因序列。
　　4.转Bt基因棉花土壤中AOB和AOA优势种群与对照相同，随生长时期无显著变化，但在各自样品中所占比例不同。不同生长时期，转Bt基因棉花AOB的Shannon指数和Evenness指数均与对照无显著差异;AOA的Shannon指数与对照也无显著差异，而苗期Evenness指数显著低于对照(p＜0.05)，其它3个生长时期差异均不显著。除花铃期转Bt基因棉花土壤AOB丰度高于对照外，其它3个生长时期均低于对照;而AOA丰度在4个生长时期均低于对照。吐絮期时，转Bt基因棉花与对照土壤AOB和AOA丰度均差异显著(p＜0.05)。转Bt基因棉花对土壤AOB和AOA群落结构组成无显著影响，但降低了AOB和AOA的数量，转Bt基因棉花可能对土壤微生物的某些类群存在潜在的影响。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 全球转基因作物现状

1．2 转基因作物对土壤环境的影响

1．2．1 转基因作物外源基因及其产物在土壤中的持留

1．2．2 转基因作物的基因水平转移

1．2．3 转基因作物对土壤动物的影响

1．2．4 转基因作物对土壤微生物的影响

1．3 研究的背景和意义

1．3．1 研究背景

1．3．2 研究意义

第二章 试验区域概况及研究内容

2．1 试验区域概况

2．2 试验样地设置

2．3 研究内容

2．4 技术路线

第三章 转Bt基因棉花重组DNA的时空分布

3．1 材料和方法

3．1．1 试验样地设计

3．1．2 试剂

3．1．3 主要仪器

3．1．4 土壤样品采集

3．1．5 土壤样品的分级

3．1．6 土壤DNA的提取

3．1．7 引物设计

3．1．8 实时荧光PCR的反应条件

3．2 结果与分析

3．2．1 土壤中转Bt基因棉花35S-Cry1A片段的实时荧光PCR分析

3．2．2 土壤中转Bt基因棉花35S-NPT Ⅱ片段的实时荧光PCR分析

3．2．3 转Bt基因棉花35S-Cry1A片段在土壤团聚体中分布的实时荧光PCR分析

3．2．4 转Bt基因棉花35S-NPT Ⅱ片段在土壤团聚体中分布的实时荧光PCR分析

3．3 讨论

第四章 转Bt基因棉花土壤中卡那霉素抗性细菌检测

4．1 材料与方法

4．1．1 试验样地设置

4．1．2 试剂

4．1．3 主要仪器

4．1．4 土壤样品采集

4．1．5 样品处理

4．1．6 细菌的分离

4．1．7 细菌的扩大培养

4．2 PCR技术检测NPTⅡ基因转移

4．2．1 细菌DNA的提取

4．2．2 引物设计

4．2．3 PCR反应体系和条件

4．2．4 PCR产物的回收纯化

4．2．5 PCR产物的连接转化

4．3 结果与分析

4．3．1 卡那霉素抗性细菌平板培养

4．3．2 卡那霉素抗性基因特异性引物设计

4．3．3 卡那霉素抗性基因的基因转移检测结果

4．4 讨论

第五章 转基因棉花对土壤AOB和AOA群落结构及丰度的影响

5．1 材料和方法

5．1．1 试验样地设置

5．1．2 试剂

5．1．3 主要仪器

5．1．4 土壤样品采集

5．1．5 土壤理化性质和硝化势测定

5．1．6 PCR扩增及T-RFLP分析

5．1．7 实时荧光PCR分析

5．1．8 数据分析

5．2 结果与分析

5．2．1 土壤AOB和AOA群落结构和多样性变化

5．2．2 土壤AOB和AOA群落结构与土壤理化性质的典范对应分析

5．2．3 土壤AOB和AOA丰度变化

5．3 讨论

第六章 结论

参考文献

致谢

作者简历