促旋酶和拓扑异构酶IV抑制剂

摘要

本发明涉及式（I）的化合物或其药学可接受的盐，其中X和R如本发明定义的。式（I）的化合物作为用于治疗细菌感染的促旋酶和/或拓扑异构酶IV抑制剂是有用的。式（I）的化合物具有广泛范围的抗菌活性和有利的毒理学性质或是具有所述活性的化合物的前体药物。

说明书

与相关申请的交叉参考

本申请根据35U.S.C.§119要求于2011年1月14日提交的美国临时专利申请序列号61/432,965；于2011年8月4日提交的美国临时专利申请序列号61/515,174；于2011年8月4日提交的美国临时专利申请序列号61/515,249；和于2011年6月20日提交的美国临时专利申请序列号61/499,134的利益；每个申请的完整内容通过引用在此合并。

发明背景

长久以来已认识到针对抗生素的细菌抵抗力，并且它在今天视为严重的全世界卫生问题。由于抵抗力，一些细菌感染或难以用抗生素治疗或甚至是无法治疗的。随着特定细菌菌株中的多药抗性的近期发展，这个问题已变得尤其严重，所述特定细菌菌株例如肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）（SP）、结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）和肠球菌属（Enterococcus）。万古霉素抗性肠球菌属的出现是特别令人担忧的，因为万古霉素以前是用于治疗这种感染的唯一有效的抗生素，并且对于许多感染已视为“最后一着”的药物。虽然许多其他抗药细菌例如肠球菌不引起威胁生命的疾病，但存在诱导抗性的基因可能蔓延到更致命的生物体的担心，所述生物体例如其中甲氧西林抗性已普遍的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（De Clerq，等人，Current Opinion in Anti-infective Investigational Drugs，1999，1，1；Levy，″The Challenge of Antibiotic Resistance″，ScientificAmerican，March，1998）。

另一个关注是抗生素抗性可以如何快速地蔓延。例如，在二十世纪六十年代以前，SP普遍对青霉素敏感，并且在1987年，美国中仅0.02%的SP菌株是抗性的。然而，到1995年，据报道对青霉素的SP抗性是约百分之七，并且在美国的一些部分高达30%（Lewis，FDAConsumer magazine（1995年9月）；Gershman in The MedicalReporter，1997）。

医院特别地充当抗药生物体的形成和传播的中心。在医院发生的感染称为医院内感染，成为越来越严重的问题。在医院每年感染的两百万美国人中，这些感染中的超过一半抵抗至少一种抗生素。疾病控制中心报道在1992年，超过13,000个住院患者死于对抗生素治疗抗性的细菌感染（Lewis，″The Rise of Antibiotic-Resistant Infections″，FDAConsumer magazine，1995年9月）。

由于对抗抗药细菌的需要和可用药物的越来越多的失败，已存在复活的开发新抗生素的兴趣。用于开发新抗生素的一种有吸引力的策略是抑制DNA促旋酶和/或拓扑异构酶IV，DNA复制所需且因此细菌细胞生长和分裂所需的细菌酶。促旋酶和/或拓扑异构酶IV也与DNA转录、修复和重组中的事件相关。

促旋酶是拓扑异构酶之一，催化DNA的拓扑异构体互变的一组酶（一般参见，Kornberg和Baker，DNA Replication，第2版，第12章，1992，W.H.Freeman和Co.；Drlica，Molecular Microbiology，1992，6，425；Drlica和Zhao，Microbiology and Molecular BiologyReviews，1997，61，第377-392页）。促旋酶自身控制DNA超螺旋且减轻当亲代双螺旋的DNA链在复制过程期间解开时出现的拓扑压力。促旋酶还催化松弛的、闭合环形双链体DNA转换为对于重组更有利的负超螺旋形式。超螺旋反应的机制涉及促旋酶围绕DNA区域的包装，在那个区域中的双链断裂，通过断裂经过DNA的第二种区域，且重新连接断裂的链。此类切割机制是II型拓扑异构酶特有的。超螺旋反应通过ATP与促旋酶的结合驱动。ATP随后在反应过程中水解。这个ATP结合和后续水解引起DNA结合的促旋酶中的构象变化，这是其活性必需的。还已发现DNA超螺旋（或松弛）的水平依赖ATP/ADP比。在不存在ATP的情况下，促旋酶仅能够松弛超螺旋DNA。

细菌DNA促旋酶是由两个A（GyrA）和两个B亚基（GyrB）组成的400千道尔顿蛋白质四聚体。DNA的结合和切割与GyrA相关，而ATP通过GyrB蛋白质结合且水解。GyrB由具有ATP酶活性的氨基末端结构域和与GyrA和DNA相互作用的羧基末端结构域组成。相比之下，真核II型拓扑异构酶是可以松弛负和正超螺旋，但不能引入负超螺旋的同二聚体。理想地，基于细菌DNA促旋酶和/或拓扑异构酶IV抑制的抗生素对于这些酶是选择性的，并且针对真核II型拓扑异构酶是相对失活的。

拓扑异构酶IV主要分辨在DNA复制结束时连接的染色体二聚体。

广泛使用的喹诺酮抗生素抑制细菌DNA促旋酶（GyrA）和/或拓扑异构酶IV（ParC）。喹诺酮的例子包括早期化合物例如萘啶酸和奥索利酸，以及后期、更有效的荧光喹诺酮例如诺氟沙星、环丙沙星和曲伐沙星。这些化合物与GyrA和/或ParC结合，且稳定切割的复合物，从而抑制总体促旋酶功能，导致细胞死亡。荧光喹诺酮抑制促旋酶（GyrA）和/或拓扑异构酶IV（ParC）的催化亚基（参见Drlica和Zhao，Microbiology and Molecular Biology Reviews，1997，61，377-392）。然而，抗药性也已公认为关于这类化合物的问题（WHOReport，″Use of Quinolones in Food Animals and Potential Impact onHuman Health″，1998）。对于喹诺酮，与其他种类的抗生素一样，暴露于较早期化合物的细菌通常快速发展针对相同种类中更有效的化合物的交叉抗性。

经由ATP水解负责供应酶的催化周转/复位所需的能量的相关亚基分别是GyrB（促旋酶）和ParE（拓扑异构酶IV）（参见Champoux，J.J.，Annu.Rev.Biochem.，2001，70，第369-413页）。靶向GyrB和ParE亚基中的这些相同ATP结合位点的化合物对于治疗多种细菌感染将是有用的（参见Charifson等人，J.Med.Chem.，2008，51，第5243-5263页）。

存在较少的与GyrB结合的已知抑制剂。例子包括香豆素、新生霉素和香豆霉素A1、cyclothialidine、cinodine和克来罗西汀。香豆素已显示非常紧密地与GyrB结合。例如，新生霉素制备氢键与蛋白质的网络和几个疏水性接触。虽然新生霉素和ATP看起来不在ATP结合位点内结合，但在两种化合物的结合方向中存在最低限度的重叠。重叠部分是新生霉素的糖单位和ATP腺嘌呤（Maxwell，Trends inMicrobiology，1997，5，102）。

对于香豆素抗性细菌，最普通的点突变是在表面精氨酸残基上，其与香豆素环的羰基（大肠杆菌（E.coli）GyrB中的Arg136）结合。虽然具有这种突变的酶显示更低的超螺旋和ATP酶活性，但它们对通过香豆素药物的抑制也是较不敏感的（Maxwell，Mol.Microbiol.，1993，9，681）。

尽管是促旋酶超螺旋的有效抑制剂，但香豆素仍未广泛用作抗生素。由于其在细菌中的低穿透力、真核生物毒性和弱水溶性，它们一般是不合适的（Maxwell，Trends in Microbiology，1997，5，102）。将希望具有新的有效GyrB和ParE抑制剂，其克服这些缺点且优选不依赖与Arg136的结合用于活性。此类抑制剂将是有吸引力的抗生素候选物，没有困扰其他种类的抗生素的抗性问题历史。

因为细菌针对抗生素的抵抗力已成为重要的公共健康问题，所以存在开发更新和更有力的抗生素的持续需要。更具体而言，存在对于代表先前未用于治疗细菌感染的新种类化合物的抗生素的需要。靶向GyrB（促旋酶）和ParE（拓扑异构酶IV）亚基中的ATP结合位点的化合物对于治疗多种细菌感染将是有用的。此类化合物在治疗其中抗性细菌的形成和传播变得越来越流行的医院中的医院内感染将是特别有用的。此外，存在关于具有有利的毒理学性质的广谱活性的新抗生素的需要。

发明概述

本发明涉及作为促旋酶和/或拓扑异构酶IV抑制剂有用的化合物及其药学可接受的盐。本发明的促旋酶和/或拓扑异构酶IV抑制剂可以由式（I）或其盐表示：

其中R是氢或氟；X是氢、－PO（OH）₂、－PO（OH）O^-M⁺、－PO（O^-）₂·2M⁺或－PO（O^-）₂·D²⁺；M⁺是药学可接受的一价阳离子；并且D²⁺是药学可接受的二价阳离子。式（I）的化合物具有广泛范围的抗菌活性和有利的毒理学性质或是具有所述活性的化合物的前体药物。

本发明还涉及作为促旋酶和/或拓扑异构酶IV抑制剂有用的式（IA）的化合物或其药学可接受的盐。式（IA）的化合物由式（I）包含。式（IA）的化合物可以表示为：

其中R是氢或氟。式（IA）的化合物具有广泛范围的抗菌活性和有利的毒理学性质。

本发明还涉及作为促旋酶和/或拓扑异构酶IV抑制剂有用的式（IB）的化合物或其药学可接受的盐。式（IB）的化合物由式（I）包含。式（IB）的化合物可以表示为：

其中X是－PO（OH）₂、－PO（OH）O^-M⁺、－PO（O^-）₂·2M⁺或－PO（O^-）₂·D²⁺；M⁺是药学可接受的一价阳离子；并且D²⁺是药学可接受的二价阳离子。式（IB）的化合物是化合物（R）-1-乙基-3-（6-氟-5-（2-（2-羟基丙基-2-基）嘧啶-5-基）-7-（四氢呋喃-2-基）-1H-苯并[d]咪唑-2-基）脲的磷酸酯前体药物，其具有广泛范围的抗菌活性和有利的毒理学性质。除了本文提供的化合物外，本发明进一步提供了药物组合物，其包含式（I）（其包括由式（I）包含的其他式，例如式（IA）、（IB）、（IC）和（ID））的化合物或其药学可接受的盐和药学可接受的载体。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含式（I）的化合物或其药学可接受的盐、药学可接受的载体和选自下述的另外治疗剂的药物组合物：抗生素、抗炎剂、基质金属蛋白酶抑制剂、脂氧合酶抑制剂、细胞因子拮抗剂、免疫抑制剂、抗癌剂、抗病毒剂、细胞因子、生长因子、免疫调节剂、前列腺素或抗血管过度增殖化合物。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗有此需要的哺乳动物中的细菌感染的方法，其包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的式（I）的化合物或其药学可接受的盐。

在进一步的实施方案中，本发明涉及治疗有此需要的哺乳动物中的细菌感染的方法，其包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的式（I）的化合物或其药学可接受的盐和抗生素、抗炎剂、基质金属蛋白酶抑制剂、脂氧合酶抑制剂、细胞因子拮抗剂、免疫抑制剂、抗癌剂、抗病毒剂、细胞因子、生长因子、免疫调节剂、前列腺素或抗血管过度增殖化合物，作为连同所述化合物的多剂型的部分或作为分开的剂型。

附图简述

图1是化合物12的两个对称独立分子的热椭圆体曲线图。

图2是化合物23的两个对称独立分子的热椭圆体曲线图。

详述

如本文使用的，术语“卤素”意指F、Cl、Br或I。

除非另有说明，本文描述的结构还意欲包括该结构的所有立体化学形式；即关于每个不对称中心的R和S构型。因此，呈现的化合物的单个立体化学异构体以及对映体和非对映体混合物在本发明的范围内。

其中一个或多个原子替换为具有与自然界中通常发现的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子的式（I）的化合物的同位素标记形式也包括在本文中。可以掺入本发明的化合物内的同位素的例子包括氢、碳、氮、氧和氟的同位素，例如²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O和¹⁷O。此类放射性标记和稳定同位素标记的化合物是有用的，例如作为研究或诊断工具或者具有改善的治疗概况的促旋酶和/或拓扑异构酶IV抑制剂。当合适时，该结构还包含化合物或盐的两性离子形式。

在一个实施方案中，式（I）的化合物包括式（IC）的化合物

其中R如上定义。

在另一个实施方案中，式（I）的化合物包括如下所示的式（ID）和（IE）的化合物：

（R）-1-乙基-3-（5-（2-（2-羟基丙基-2-基）嘧啶-5-基）-7-（四氢呋喃-2-基）-1H-苯并[d]咪唑-2-基）脲或其药学可接受的盐；和

（R）-1-乙基-3-（6-氟-5-（2-（2-羟基丙基-2-基）嘧啶-5-基）-7-（四氢呋喃-2-基）-1H-苯并[d]咪唑-2-基）脲或其药学可接受的盐。除非另有说明，短语“式（I）的化合物”预期包括由式（I）包含的本文所示的其他式，包括式（IA）、（IB）、（IC）、（ID）和（IE）。

式（IB）的化合物是其母体化合物1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲的前体药物。因此，在前体药物施用后显示出的活性主要是由于起因于前体药物切割的母体化合物的存在。

术语“前体药物”指其为药物前体的化合物，其在施用和吸收后经由一些代谢过程在体内释放药物。一般而言，前体药物具有比其母体药物更少的生物活性。前体药物还可以改善母体药物的物理性质和/或它还可以改善总体药物功效，例如通过控制其吸收、血液水平、代谢分布和细胞摄取来减少药物的毒性和不希望有的效应。

术语“母体化合物”或“母体药物”指生物学活性实体，其在前体药物施用后经由代谢或催化过程的酶促作用或者经由化学过程释放。母体化合物还可以是用于其相应前体药物制备的原材料。

由M⁺定义的一价阳离子包括铵，碱金属离子例如钠、锂和钾离子，二环己胺离子和N-甲基-D-葡糖胺离子。由D²⁺定义的二价阳离子包括碱土金属离子例如铝、钙和镁离子。还包括的是氨基酸阳离子例如精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等等的离子。如果M⁺是一价阳离子，则认识到如果存在定义2M⁺，则M⁺各自可以是相同或不同的。此外，类似地认识到如果存在定义2M⁺，则相反可以存在二价阳离子D²⁺。此外，碱性含氮基团可以由此类试剂季铵化，如：低级烷基卤化物，例如甲基、乙基、丙基和丁基氯、溴和碘；二烷基硫酸盐如二甲基、二乙基、二丁基；二戊基硫酸盐；长链卤化物例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂酰氯、溴和碘；芳烷基卤化物如苄基溴及其他。

本发明的多个实施方案包括如下所示的式（IB）的化合物或盐：

（1）化合物，其中X是

（a）－PO（OH）O^-M⁺；

（b）－PO（O^-）₂·2M⁺；或

（c）－PO（O^-）₂·D²⁺；

（2）化合物，其中M⁺是

（a）Li⁺、Na⁺、K⁺、N-甲基-D-葡糖胺、或N（R⁹）₄⁺；或

（b）Na⁺；

（c）每个R⁹独立地是氢或C₁-C₄烷基；

（3）化合物，其中D²⁺是

（a）Mg²⁺、Ca²⁺和Ba²⁺；或

（b）Ca²⁺；

（4）化合物（R）-2-（5-（2-（3-乙基脲基）-6-氟-7-（四氢呋喃-2-基）-1H-苯并[d]咪唑-5-基）嘧啶-2-基）丙基-2-基磷酸盐；和

（5）化合物（R）-2-（5-（2-（3-乙基脲基）-6-氟-7-（四氢呋喃-2-基）-1H-苯并[d]咪唑-5-基）嘧啶-2-基）丙基-2-基磷酸二钠。

应当理解式（IB）的化合物或盐的多个备选实施方案可以通过要求在上文（1）直到（3）列出的一个或多个备选实施方案进行选择。例如，本发明的进一步实施方案可以通过组合（1）（a）和（2）（a）；（1）（a）和（2）（b）；（1）（c）和（3）（a）；（1）（c）和（3）（b）；（1）（b）和（2）（a）；（1）（b）和（2）（b）；等来获得。

本发明的前体药物特征在于出乎意料高的水溶解度。这个溶解性促进更高剂量的前体药物的施用，导致更大的药物负荷/单位剂量。

本发明的一个实施方案涉及治疗有此需要的哺乳动物中的细菌感染的方法，其包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的具有式（I）的化合物或其药学可接受的盐。

根据另一个实施方案，本发明提供了减少或抑制生物样品中的细菌数量的方法。这种方法包括使所述生物样品与式（I）的化合物或其药学可接受的盐接触。

如本文使用的，术语“生物样品”包括细胞培养或其提取物；得自哺乳动物的活组织检查材料或其提取物；和血液、唾液、尿、粪便、精液、泪或其他体液或其提取物。术语“生物样品”还包括活生物体，在所述情况下“使本发明的化合物与生物样品接触”与术语“将所述化合物或包含所述化合物的组合物）施用于哺乳动物”同义。

一个实施方案包括使所述生物样品与选自下述的化合物接触：（R）-1-乙基-3-（5-（2-（2-羟基丙基-2-基）嘧啶-5-基）-7-（四氢呋喃-2-基）-1H-苯并[d]咪唑-2-基）脲或其药学可接受的盐；和（R）-1-乙基-3-（6-氟-5-（2-（2-羟基丙基-2-基）嘧啶-5-基）-7-（四氢呋喃-2-基）-1H-苯并[d]咪唑-2-基）脲或其药学可接受的盐。对于此类方法有用的药物组合物在下文描述。

一个实施方案包括使所述生物样品与如由式（IB）定义的（R）-1-乙基-3-（6-氟-5-（2-（2-羟基丙基-2-基）嘧啶-5-基）-7-（四氢呋喃-2-基）-1H-苯并[d]咪唑-2-基）脲的磷酸酯前体药物接触。对于此类方法有用的药物组合物在下文描述。

式（I）的化合物的抗微生物活性可以在抗微生物敏感性测定法中加以证实。用于微生物敏感性测定法的条件细节在下文实施例中阐述。

本发明的促旋酶和/或拓扑异构酶IV抑制剂或其药学盐可以配制成药物组合物用于施用于哺乳动物或人。有效治疗或预防细菌感染的这些药物组合物是本发明的另一个实施方案，所述药物组合物包含以足以可测量地减少细菌数量的量的促旋酶和/或拓扑异构酶IV抑制剂和药学可接受的载体。如本文使用的，术语“可测量地减少细菌数量”意指在含有所述抑制剂的样品和仅含有细菌的样品之间的细菌数目中可测量的变化。

增加细菌生物体对抗生素的敏感性的试剂是已知的。例如，美国专利号5,523,288、美国专利号5,783,561和美国专利号6,140,306描述了使用杀菌/渗透性增加蛋白质（BPI）用于增加革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的抗生素敏感性的方法。增加细菌生物体的外膜渗透性的试剂已由Vaara，M.在Microbiological Reviews（1992）第395-411页中描述，并且革兰氏阴性菌的致敏作用已由Tsubery，H.等人在J.Med.Chem.（2000）第3085-3092页中描述。

本发明的另一个实施方案涉及如上所述预防、控制、治疗或减少有此需要的哺乳动物中的细菌感染的进展、严重性或效应的方法，但进一步包括给所述哺乳动物施用增加细菌生物体对抗生素的敏感性的试剂的步骤。

根据另一个实施方案，本发明的方法用于治疗兽医领域中的患者，包括但不限于动物园、实验室、人伴侣和农场动物，包括灵长类动物、啮齿类动物、爬行动物和鸟类。所述动物的例子包括但不限于豚鼠、仓鼠、沙鼠、大鼠、小鼠、兔、犬、猫、马、猪、绵羊、牛、山羊、鹿、恒河猴、猴、绢毛猴（tamarind）、类人猿、狒狒、大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿、鸵鸟、鸡、火鸡、鸭和鹅。

本发明的药物组合物和方法一般将用于控制体内的细菌感染。可以通过本发明的组合物和方法控制的细菌生物体的例子包括但不限于下述生物体：肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae）、肠杆菌属物种（Enterobacter spp.）、变形杆菌属物种（Proteus spp.）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大肠杆菌（E.coli）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、凝固酶阴性葡萄球菌（Coag.Neg.Staphylococci）、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）、炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）、肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）、粘膜炎莫拉菌（Moraxella catarrhalis）、肺炎嗜衣原体（Chlamydophila pneumoniae）、沙眼衣原体（Chlamydiatrachomatis）、嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、土拉热弗朗西丝菌（Francisellatularensis）、鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis）、难辨梭菌（Clostridium difficile）、淋病奈瑟球菌（Neisseria gonorrhoeae）、脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis）、鸟复合分枝杆菌（Mycobacterium avium complex）、脓肿分枝杆菌（Mycobacteriumabscessus）、堪萨斯分枝杆菌（Mycobacteriumkansasii）和溃疡分枝杆菌（Mycobacterium ulcerans）。

在另一个实施方案中，本发明还提供了控制、治疗或减少患者中的医院或非医院内细菌感染的进展、严重性或效应的方法，其包括给所述患者施用包含式（I）的化合物或其药学可接受的盐的药物组合物，其中所述细菌感染选自下述中的一种或多种：上呼吸道感染、下呼吸道感染、耳部感染、胸膜肺和支气管感染、并发的泌尿道感染、非并发的泌尿道感染、腹腔内感染、心血管感染、血流感染、败血症、菌血症、CNS感染、皮肤和软组织感染、GI感染、骨与关节感染、生殖器感染、眼部感染或肉芽肿感染、非并发的皮肤和皮肤结构感染（uSSSI）、并发的皮肤和皮肤结构感染（cSSSI）、导管感染、咽炎、窦炎、外耳炎、中耳炎、支气管炎、脓胸、肺炎、社区获得性细菌性肺炎（CABP）、医院获得性肺炎（HAP）、医院获得性细菌性肺炎、呼吸器相关性肺炎（VAP）、糖尿病足感染、万古霉素抗性肠球菌感染、膀胱炎和肾盂肾炎、肾结石、前列腺炎、腹膜炎、并发的腹腔内感染（cIAI）和其他腹腔内感染、透析相关性腹膜炎、内脏脓肿、心内膜炎、心肌炎、心包炎、输液相关败血症、脑膜炎、脑炎、脑脓肿、骨髓炎、关节炎、生殖器溃疡、尿道炎、阴道炎、子宫颈炎、牙龈炎、结膜炎、角膜炎、眼内炎、囊性纤维化患者中的感染或发热性嗜中性粒细胞减少症患者的感染。

术语“非医院内感染”还称为社区获得性感染。

在另一个实施方案中，细菌感染选自下述中的一种或多种：社区获得性细菌性肺炎（CABP）、医院获得性肺炎（HAP）、医院获得性细菌性肺炎、呼吸器相关性肺炎（VAP）、菌血症、糖尿病足感染、导管感染、非并发的皮肤和皮肤结构感染（uSSSI）、并发的皮肤和皮肤结构感染（cSSSI）、万古霉素抗性肠球菌感染或骨髓炎。

在另一个实施方案中，该组合物和方法因此将用于控制、治疗或减少下述的进展、严重性或效应：上呼吸道感染、下呼吸道感染、耳部感染、胸膜肺和支气管感染、并发的泌尿道感染、非并发的泌尿道感染、腹腔内感染、心血管感染、血流感染、败血症、菌血症、CNS感染、皮肤和软组织感染、GI感染、骨与关节感染、生殖器感染、眼部感染或肉芽肿感染、非并发的皮肤和皮肤结构感染（uSSSI）、并发的皮肤和皮肤结构感染（cSSSI）、导管感染、咽炎、窦炎、外耳炎、中耳炎、支气管炎、脓胸、肺炎、社区获得性细菌性肺炎（CABP）、医院获得性肺炎（HAP）、医院获得性细菌性肺炎、呼吸器相关性肺炎（VAP）、糖尿病足感染、万古霉素抗性肠球菌感染、膀胱炎和肾盂肾炎、肾结石、前列腺炎、腹膜炎、复杂性腹腔内感染（cIAI）和其他腹膜内感染、透析相关性腹膜炎、内脏脓肿、心内膜炎、心肌炎、心包炎、输注相关败血症、脑膜炎、脑炎、脑脓肿、骨髓炎、关节炎、生殖器溃疡、尿道炎、阴道炎、子宫颈炎、牙龈炎、结膜炎、角膜炎、眼内炎、囊性纤维化患者中的感染或热性嗜中性粒细胞减少症患者的感染。

在另一个实施方案中，细菌感染的特征在于下述中的一种或多种的存在：肺炎链球菌、化脓性链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌或结核分枝杆菌。

在另一个实施方案中，细菌感染的特征在于下述中的一种或多种的存在：肺炎链球菌、粪肠球菌或金黄色葡萄球菌。

在另一个实施方案中，细菌感染的特征在于下述中的一种或多种的存在：大肠杆菌、粘膜炎莫拉菌或流感嗜血杆菌。

在另一个实施方案中，细菌感染的特征在于下述中的一种或多种的存在：难辨梭菌、淋病奈瑟球菌、脑膜炎奈瑟球菌、鸟复合分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、肺炎嗜衣原体和沙眼衣原体。

在另一个实施方案中，细菌感染的特征在于下述中的一种或多种的存在：肺炎链球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、难辨梭菌、粘膜炎莫拉菌、淋病奈瑟球菌、脑膜炎奈瑟球菌、鸟复合分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、肺炎嗜衣原体、沙眼衣原体、流感嗜血杆菌、化脓性链球菌或β-溶血性链球菌（β-haemolytic streptococci）。

在一些实施方案中，细菌感染的特征在于下述中的一种或多种的存在：甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌、氟喹诺酮抗性金黄色葡萄球菌、万古霉素中间体抗性金黄色葡萄球菌、利奈唑胺抗性金黄色葡萄球菌、青霉素抗性肺炎链球菌、大环内酯抗性肺炎链球菌、氟喹诺酮抗性肺炎链球菌、万古霉素抗性粪肠球菌、利奈唑胺抗性粪肠球菌、氟喹诺酮抗性粪肠球菌、万古霉素抗性屎肠球菌（Enterococcus faecium）、利奈唑胺抗性屎肠球菌、氟喹诺酮抗性屎肠球菌、氨苄西林抗性屎肠球菌、大环内酯抗性流感嗜血杆菌、β-内酰胺抗性流感嗜血杆菌、氟喹诺酮抗性流感嗜血杆菌、β-内酰胺抗性卡他莫拉菌、甲氧西林抗性表皮葡萄球菌、甲氧西林抗性表皮葡萄球菌、万古霉素抗性表皮葡萄球菌、氟喹诺酮抗性表皮葡萄球菌、大环内酯抗性肺炎支原体、异烟肼抗性结核分枝杆菌、利福平抗性结核分枝杆菌、甲氧西林抗性凝固酶阴性葡萄球菌（Coagulase negative staphylococcus）、氟喹诺酮抗性凝固酶阴性葡萄球菌、糖肽中间体抗性金黄色葡萄球菌、万古霉素抗性金黄色葡萄球菌、异质性万古霉素中间体抗性金黄色葡萄球菌、异质性万古霉素抗性金黄色葡萄球菌、大环内酯-林可酰胺-链阳性菌素抗性葡萄球菌（Staphylococcus）、β-内酰胺抗性粪肠球菌、β-内酰胺抗性屎肠球菌、酮内酯抗性肺炎链球菌、酮内酯抗性化脓性链球菌、大环内酯抗性化脓性链球菌、万古霉素抗性表皮葡萄球菌、氟喹诺酮抗性淋病奈瑟球菌、多药抗性绿脓假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）或头孢菌素抗性淋病奈瑟球菌。

根据另一个实施方案，甲氧西林抗性葡萄球菌选自甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌、甲氧西林抗性表皮葡萄球菌或甲氧西林抗性凝固酶阴性葡萄球菌。

在一些实施方案中，式（I）的化合物或其药学可接受的盐的形式用于治疗社区获得性MRSA（即，cMRSA）。

在其他实施方案中，式（I）的化合物的一种形式或其药学可接受的盐用于治疗达托霉素抗性生物体，包括但不限于达托霉素抗性屎肠球菌和达托霉素抗性金黄色葡萄球菌。

根据另一个实施方案，氟喹诺酮抗性葡萄球菌选自氟喹诺酮抗性金黄色葡萄球菌、氟喹诺酮抗性表皮葡萄球菌或氟喹诺酮抗性凝固酶阴性葡萄球菌。

根据另一个实施方案，糖肽抗性葡萄球菌选自糖肽中间体抗性金黄色葡萄球菌、万古霉素抗性金黄色葡萄球菌、万古霉素中间体抗性金黄色葡萄球菌、异质性万古霉素中间体抗性金黄色葡萄球菌或异质性万古霉素抗性金黄色葡萄球菌。

根据另一个实施方案，大环内酯-林可酰胺-链阳性菌素抗性葡萄球菌是大环内酯-林可酰胺-链阳性菌素抗性金黄色葡萄球菌。

根据另一个实施方案，利奈唑胺抗性肠球菌选自利奈唑胺抗性粪肠球菌或利奈唑胺抗性屎肠球菌。

根据另一个实施方案，糖肽抗性肠球菌选自万古霉素抗性屎肠球菌或万古霉素抗性粪肠球菌。

根据另一个实施方案，β-内酰胺抗性粪肠球菌是β-内酰胺抗性屎肠球菌。

根据另一个实施方案，青霉素抗性链球菌是青霉素抗性肺炎链球菌。

根据另一个实施方案，大环内酯抗性链球菌是大环内酯抗性肺炎链球菌

根据另一个实施方案，酮内酯抗性链球菌选自大环内酯抗性肺炎链球菌和酮内酯抗性化脓性链球菌。

根据另一个实施方案，氟喹诺酮抗性链球菌是氟喹诺酮抗性肺炎链球菌。

根据另一个实施方案，β-内酰胺抗性嗜血杆菌是β-内酰胺抗性流感嗜血杆菌。

根据另一个实施方案，氟喹诺酮抗性嗜血杆菌是氟喹诺酮抗性流感嗜血杆菌。

根据另一个实施方案，大环内酯抗性嗜血杆菌是大环内酯抗性流感嗜血杆菌。

根据另一个实施方案，大环内酯抗性支原体是大环内酯抗性肺炎支原体。

根据另一个实施方案，异烟肼抗性分枝杆菌是异烟肼抗性结核分枝杆菌。

根据另一个实施方案，利福平抗性分枝杆菌是利福平抗性结核分枝杆菌。

根据另一个实施方案，β-内酰胺抗性莫拉氏菌是β-内酰胺抗性卡他莫拉菌。

根据另一个实施方案，细菌感染的特征在于下述中的一种或多种的存在：甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌、氟喹诺酮抗性金黄色葡萄球菌、万古霉素中间体抗性金黄色葡萄球菌、利奈唑胺抗性金黄色葡萄球菌、青霉素抗性肺炎链球菌、大环内酯抗性肺炎链球菌、氟喹诺酮抗性肺炎链球菌、万古霉素抗性粪肠球菌、利奈唑胺抗性粪肠球菌、氟喹诺酮抗性粪肠球菌、万古霉素抗性屎肠球菌、利奈唑胺抗性屎肠球菌、氟喹诺酮抗性屎肠球菌、氨苄西林抗性屎肠球菌、大环内酯抗性流感嗜血杆菌、β-内酰胺抗性流感嗜血杆菌、氟喹诺酮抗性流感嗜血杆菌、β-内酰胺抗性卡他莫拉菌、甲氧西林抗性表皮葡萄球菌、甲氧西林抗性表皮葡萄球菌、万古霉素抗性表皮葡萄球菌、氟喹诺酮抗性表皮葡萄球菌、大环内酯抗性肺炎支原体、异烟肼抗性结核分枝杆菌、利福平抗性结核分枝杆菌、氟喹诺酮抗性淋病奈瑟球菌或头孢菌素抗性淋病奈瑟球菌。

根据另一个实施方案，细菌感染的特征在于下述中的一种或多种的存在：甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌、甲氧西林抗性表皮葡萄球菌、甲氧西林抗性凝固酶阴性葡萄球菌、氟喹诺酮抗性金黄色葡萄球菌、氟喹诺酮抗性表皮葡萄球菌、氟喹诺酮抗性凝固酶阴性葡萄球菌、万古霉素抗性金黄色葡萄球菌、糖肽中间体抗性金黄色葡萄球菌、万古霉素抗性金黄色葡萄球菌、万古霉素中间体抗性金黄色葡萄球菌、异质性万古霉素中间体抗性金黄色葡萄球菌、异质性万古霉素抗性金黄色葡萄球菌、万古霉素抗性屎肠球菌、万古霉素抗性粪肠球菌、青霉素抗性肺炎链球菌、大环内酯抗性肺炎链球菌、氟喹诺酮抗性肺炎链球菌、大环内酯抗性化脓性链球菌或β-内酰胺抗性流感嗜血杆菌。

根据另一个实施方案，细菌感染的特征在于下述中的一种或多种的存在：甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌、万古霉素抗性屎肠球菌、万古霉素抗性粪肠球菌、万古霉素抗性金黄色葡萄球菌、万古霉素中间体抗性金黄色葡萄球菌、异质性万古霉素中间体抗性金黄色葡萄球菌、异质性万古霉素抗性金黄色葡萄球菌、多药抗性绿脓假单胞菌、异烟肼抗性结核分枝杆菌和利福平抗性结核分枝杆菌。

除了本发明的化合物外，本发明的化合物的药学可接受的衍生物或前体药物也可以用于治疗或预防上文鉴定的病症的组合物中。

“药学可接受的衍生物或前体药物”意指本发明的化合物的任何药学可接受的盐、酯、酯的盐或其他衍生物，在施用于接受者后，其能够直接或间接提供本发明的化合物或其抑制性活性代谢产物或残渣。特别有利的衍生物或前体药物是当此类化合物施用于哺乳动物时（例如通过允许经口施用的化合物更容易吸收到血液内）增加本发明的化合物的生物利用度，或相对于母体种类增强母体化合物对生物区室（例如脑或淋巴系统）的递送的那些。

本发明的化合物的药学可接受的前体药物包括但不限于酯、氨基酸酯、磷酸酯、金属盐和磺酸酯。

本发明的化合物的药学可接受的盐包括衍生自药学可接受的无机和有机酸和碱的那些。合适的酸盐的例子包括乙酸盐、己二酸盐、藻朊酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡糖庚酸盐（glucoheptanoate）、甘油磷酸盐、羟乙酸盐、半硫酸盐（hemisulfate）、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴化物、氢碘化物、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一酸盐。其他酸例如草酸，虽然自身不是药学可接受的，但可以用于制备盐，所述盐在获得本发明的化合物及其药学可接受的酸加成盐中用作中间体。

衍生自合适的碱的盐包括碱金属（例如钠和钾）、碱土金属（例如镁）、铵和N⁺（C_1-4烷基）₄盐。本发明还设想了本文公开的化合物的任何碱性含氮基团的季铵化。水或油溶性或可分散的产物可以通过此类季铵化获得。

本发明的药物组合物包含式（I）的化合物或其药学可接受的盐以及药学可接受的载体。此类组合物可选择地包含另外的治疗剂。此类试剂包括但不限于抗生素、抗炎剂、基质金属蛋白酶抑制剂、脂氧合酶抑制剂、细胞因子拮抗剂、免疫抑制剂、抗癌剂、抗病毒剂、细胞因子、生长因子、免疫调节剂、前列腺素或抗血管过度增殖化合物。

术语“药学可接受的载体”指可以连同本发明的化合物一起施用于患者且不破坏其药理学活性的无毒载体。

可以用于本发明的药物组合物中的药学可接受的载体包括但不限于离子交换剂、铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白质例如人血清白蛋白、缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质，例如鱼精蛋白硫酸盐、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸盐、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、羊毛脂和自乳化药物递送系统（SEDDS）例如α-生育酚、聚乙二醇1000琥珀酸盐或其他相似的聚合递送基质。

术语“药学有效量”指在治疗或改善患者中的细菌感染中有效的量。术语“预防有效量”指在防止或基本上减轻患者中的细菌感染的有效的量。

依赖待治疗或防止的具体病状或疾病状态，通常施用于治疗或防止该病状的另外治疗剂可以同本发明的所述抑制剂一起施用。此类治疗剂包括但不限于抗生素、抗炎剂、基质金属蛋白酶抑制剂、脂氧合酶抑制剂、细胞因子拮抗剂、免疫抑制剂、抗癌剂、抗病毒剂、细胞因子、生长因子、免疫调节剂、前列腺素或抗血管过度增殖化合物。

本发明的化合物可以常规方式用于控制体内细菌感染水平和用于治疗疾病或减少由细菌介导的效应的进展或严重性。此类治疗方法、其剂量水平和需求可以由本领域普通技术人员根据可用方法和技术进行选择。

例如，本发明的化合物可以与药学可接受的佐剂组合用于以药学可接受的方式和有效减轻那种感染或疾病的严重性的量施用于患有细菌感染或疾病的患者。

备选地，本发明的化合物可以用于组合物及方法，其用于治疗或保护个体在延长的时间段抵抗细菌感染或疾病。在一个实施方案中，本发明的化合物可以用于组合物及方法，其用于治疗或保护个体在1-2周期间抵抗细菌感染或疾病。在另一个实施方案中，本发明的化合物可以用于组合物及方法，其用于治疗或保护个体在4-8周期间抵抗细菌感染或疾病（例如，在治疗患有或有风险可发展为心内膜炎或骨髓炎的患者中）。在另一个实施方案中，本发明的化合物可以用于组合物及方法，其用于治疗或保护个体在8-12周期间抵抗细菌感染或疾病。化合物可以单独或连同本发明的其他化合物一起以与药物组合物中酶抑制剂的常规使用一致的方式用于此类组合物中。例如，本发明的化合物可以与常规用于疫苗的药学可接受的佐剂组合，并且以预防有效量施用，以保护个体在延长时间段抵抗细菌感染或疾病。

在一些实施方案中，式（I）的化合物或其药学可接受的盐可以预防性地用于防止细菌感染。在一些实施方案中，式（I）的化合物或其药学可接受的盐可以在牙科或外科手术之前、过程中或之后用于防止机会性致病菌感染，例如在细菌性心内膜炎中遇到的那些。在其他实施方案中，式（I）的化合物或其药学可接受的盐可以预防性地用于牙科手术中，包括但不限于拔牙、牙周手术、牙植入物放置和牙髓手术。在其他实施方案中，式（I）的化合物或其药学可接受的盐可以预防性地用于外科手术中，包括但不限于普通外科、呼吸外科（扁桃体切除术/腺样体切除术）、胃肠道外科（上部GI和选择性小肠外科、食道硬化疗法和扩张术、大肠切除术、急性阑尾切除术）、创伤外科（穿透性腹部外科）、泌尿生殖道外科（前列腺切除术、尿道扩张术、膀胱镜检查、阴道或腹式子宫切除术、剖腹产术）、移植外科（肾、肝、胰腺或肾移植）、头与颈外科（皮肤切除、颈淋巴结清扫术、喉头切除术、头颈癌外科、下颌骨折）、整形外科（全关节置换、创伤开放性骨折）、血管外科（外周血管手术）、胸心外科、冠状动脉架桥外科、肺切除术和神经外科。

如本文使用的，除非另有说明，术语“防止细菌感染”意指例如本发明的促旋酶和/或拓扑异构酶IV抑制剂的抗生素来防止细菌感染的预防用途。可以预防性地进行使用促旋酶和/或拓扑异构酶IV抑制剂的治疗以防止由对促旋酶和/或拓扑异构酶IV抑制剂敏感的生物体引起的感染。其中可以考虑预防治疗的一组一般病状是当个体由于如下原因更容易受感染时，例如免疫力减弱、外科、创伤、人工装置在体内的存在（暂时或永久的）、解剖上的缺陷、暴露于高水平的细菌或可能暴露于引起疾病的病原体。可以导致免疫力减弱的因素的例子包括化学疗法、放射疗法、糖尿病、老年、HIV感染和移植。解剖上缺陷的例子将是心脏瓣膜的缺陷，其增加细菌性心内膜炎的危险。人工装置的例子包括人工关节、外科针、导管等。其中促旋酶和/或拓扑异构酶IV抑制剂的预防使用可能合适的另一组情况会是防止病原体在个体之间的传播（直接或间接）。防止病原体传播的预防用途的特定例子是在医疗保健机构（例如医院或疗养所）中个体使用促旋酶和/或拓扑异构酶IV抑制剂。

式（I）的化合物还可以与其他抗生素共施用，以增加治疗或预防针对多种细菌感染的作用。当本发明的化合物在具有其他试剂的联合治疗中施用时，它们可以顺次或同时施用于患者。备选地，根据本发明的药物或预防组合物包含式（I）的化合物和另一种治疗或预防试剂的组合。

在一些实施方案中，另外的一种或多种治疗剂是选自下述的抗生素：天然青霉素、青霉素酶抗性青霉素、抗假单胞菌的青霉素、氨基青霉素、第一代头孢菌素、第二代头孢菌素、第三代头孢菌素、第四代头孢菌素、碳青霉烯、头霉素、喹诺酮、氟喹诺酮、氨基糖苷类、大环内酯、酮内酯、多粘菌素、四环素、糖肽、链阳性菌素、噁唑烷酮、利福霉素或磺胺类。

在一些实施方案中，另外的一种或多种治疗剂是选自青霉素、头孢菌素、喹诺酮、氨基葡糖苷或噁唑烷酮的抗生素。

在其他实施方案中，另外的治疗剂选自天然青霉素包括苄星青霉素G、青霉素G和青霉素V，选自青霉素酶抗性青霉素包括氯唑西林、双氯西林、萘夫西林和苯唑西林，选自抗假单胞菌青霉素包括羧苄西林、美洛西林、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林和替卡西林/克拉维酸，选自氨基青霉素包括阿莫西林、氨苄西林和氨苄西林/舒巴坦，选自第一代头孢菌素包括头孢唑林、头孢羟氨苄、头孢氨苄和头孢拉定，选自第二代头孢菌素包括头孢克洛、头孢克洛-CD、头孢孟多、头孢尼西、头孢丙烯、氯碳头孢和头孢呋辛，来自第三代头孢菌素包括头孢地尼、头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟和头孢曲松，选自第四代头孢菌素包括头孢吡肟、头孢洛林（Ceftaroline）和头孢吡普，选自头霉素包括头孢替坦和头孢西丁，选自碳青霉烯包括多利培南、亚胺培南和美罗培南，选自单酰胺菌素包括氨曲南，选自喹诺酮包括西诺沙星、萘啶酸、奥索利酸和吡哌酸，选自氟喹诺酮包括贝西沙星、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、格帕沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、诺氟沙星、氧氟沙星和司帕沙星，选自氨基糖苷类包括阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、大观霉素、链霉素和妥布霉素，选自大环内酯包括阿奇霉素、克拉霉素和红霉素，选自酮内酯包括泰利霉素，选自四环素包括氯四环素、地美环素、多西环素、米诺环素和四环素，选自糖肽包括奥利万星、达贝万星、特拉万星、替考拉宁和万古霉素，选自链阳性菌素包括达福普汀/奎奴普丁，选自噁唑烷酮包括利奈唑胺，选自利福霉素包括利福布汀和利福平，以及其他抗生素包括杆菌肽、粘菌素、替加环素、达托霉素、氯霉素、克林霉素、异烟肼、甲硝唑、莫匹罗星、多粘菌素B、吡嗪酰胺、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑和磺胺异噁唑。

在其他实施方案中，另外的治疗剂选自天然青霉素包括青霉素G，青霉素酶抗性青霉素包括萘夫西林和苯唑西林，抗假单胞菌青霉素包括哌拉西林/他唑巴坦，氨基青霉素包括阿莫西林，第一代头孢菌素包括头孢氨苄，第二代头孢菌素包括头孢克洛、头孢克洛-CD和头孢呋辛，第三代头孢菌素包括头孢他啶和头孢曲松，第四代头孢菌素包括头孢吡肟，碳青霉烯包括亚胺培南、美罗培南、厄他培南、多利培南、帕尼培南和比阿培南，氟喹诺酮包括环丙沙星、加替沙星、左氧氟沙星和莫西沙星，氨基糖苷类包括妥布霉素，大环内酯包括阿奇霉素和克拉霉素，四环素包括多西环素，糖肽包括万古霉素，利福霉素包括利福平，以及其他抗生素包括异烟肼、吡嗪酰胺、替加环素、达托霉素或甲氧苄啶/磺胺甲噁唑。

在一些实施方案中，固体形式的式（I）的化合物或其药学可接受的盐可以施用于治疗革兰氏阳性感染。在一些实施方案中，组合物是固体、液体（例如悬浮液）或iv（例如式（I）的化合物或其药学可接受的盐的形式溶解成液体且iv施用）组合物。在一些实施方案中，包括式（I）的化合物或其药学可接受的盐的组合物与另外的抗生素试剂组合施用，所述另外的抗生素试剂例如天然青霉素、青霉素酶抗性青霉素、抗假单胞菌青霉素、氨基青霉素、第一代头孢菌素、第二代头孢菌素、第三代头孢菌素、第四代头孢菌素、碳青霉烯、头霉素、喹诺酮、氟喹诺酮、氨基糖苷类、大环内酯、酮内酯、多粘菌素、四环素、糖肽、链阳性菌素、噁唑烷酮、利福霉素或磺胺类。在一些实施方案中，包括固体形式的式（I）的化合物或其药学可接受的盐的组合物口服施用，并且iv.施用另外的抗生素试剂例如天然青霉素、青霉素酶抗性青霉素、抗假单胞菌青霉素、氨基青霉素、第一代头孢菌素、第二代头孢菌素、第三代头孢菌素、第四代头孢菌素、碳青霉烯、头霉素、喹诺酮、氟喹诺酮、氨基糖苷类、大环内酯、酮内酯、多粘菌素、四环素、糖肽、链阳性菌素、噁唑烷酮、利福霉素或磺胺类。

在一些实施方案中，固体形式的式（I）化合物或其药学可接受的盐可以施用于治疗革兰氏阴性感染。在一些实施方案中，组合物是固体、液体（例如悬浮液）或iv（例如式（I）的化合物或其药学可接受的盐的形式溶解成液体且iv施用）组合物。在一些实施方案中，包括式（I）的化合物或其药学可接受的盐的组合物与选自下述的另外的抗生素试剂组合施用：天然青霉素、青霉素酶抗性青霉素、抗假单胞菌青霉素、氨基青霉素、第一代头孢菌素、第二代头孢菌素、第三代头孢菌素、第四代头孢菌素、碳青霉烯、头霉素、单酰胺菌素、喹诺酮、氟喹诺酮、氨基糖苷类、大环内酯、酮内酯、多粘菌素、四环素或磺胺类。在一些实施方案中，包括固体形式的式（I）的化合物或其药学可接受的盐的组合物口服施用，并且口服施用另外的抗生素试剂例如天然青霉素、青霉素酶抗性青霉素、抗假单胞菌青霉素、氨基青霉素、第一代头孢菌素、第二代头孢菌素、第三代头孢菌素、第四代头孢菌素、碳青霉烯、头霉素、单酰胺菌素、喹诺酮、氟喹诺酮、氨基糖苷类、大环内酯、酮内酯、多粘菌素、四环素或酰胺。在一些实施方案中，iv施用另外的治疗剂。

上文描述的另外的治疗剂可以作为多剂量方案的部分与含抑制剂的组合物分别施用。备选地，这些试剂可以是单剂型的部分与抑制剂一起混合在单个组合物中。

本发明的药物组合物可以口服、肠胃外、通过吸入喷雾、外部、直肠、鼻、颊、阴道或经由植入型储存器施用。本发明的药物组合物可以含有任何常规的无毒药学可接受的载体、佐剂或媒介物。在一些情况下，制剂的pH可以用药学可接受的酸、碱或缓冲液调整，以增强配制的化合物或其递送形式的稳定性。如本文使用的术语肠胃外的包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。

药物组合物可以以无菌可注射制剂的形式，例如作为无菌可注射水性或油性悬浮液。这种悬浮液可以根据本领域已知的技术进行配制，使用合适的分散剂或湿润剂（例如Tween80）和悬浮剂。无菌可注射制剂还可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。在可接受的媒介物和溶剂中可采用的是甘露醇、水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，常规地采用无菌的不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为了此目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸例如油酸及其甘油酯衍生物在注射剂制备中有用，同样地天然的药学可接受的油也有用，例如橄榄油或蓖麻油，尤其以其聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬浮液也可以含有长链醇稀释剂或分散剂，例如在PharmacopeiaHelvetica中描述的那些，或相似口服的醇。

本发明的药物组合物可以以任何口服可接受的剂型来口服施用，包括但不限于胶囊、片剂和水悬浮液和溶液。在用于口服使用的片剂的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂例如硬脂酸镁。对于以胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。当水悬浮液和溶液以及聚乙二醇口服施用时，活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。需要时，可以加入一定的甜味剂和/或调味剂和/或着色剂。

本发明的药物组合物还可以以用于直肠施用的栓剂形式进行施用。这些组合物可以通过将本发明的化合物与合适的非刺激性赋形剂混合进行制备，所述赋形剂在室温是固体的但在直肠温度下是液体，并且因此将在直肠中融化以释放活性组分。此类材料包括但不限于可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。

当所需治疗涉及可外部应用容易接近的区域或器官时，本发明的药物组合物的外部施用是尤其有用的。对于对皮肤的外部应用，药物组合物应该用合适的软膏配制，所述软膏含有悬浮或溶解在载体中的活性组分。用于本发明的化合物的外部施用的载体包括但不限于矿物油、液体石油、白色石油、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、乳化蜡和水。备选地，药物组合物可以用合适的乳液或霜剂配制，所述乳液或霜剂含有悬浮或溶解在载体中的活性组分。合适的载体包括但不限于矿物油、山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。本发明的药物组合物还可以通过直肠栓剂制剂或在合适的灌肠剂制剂中外部应用于下部肠道。外部施用的透皮贴剂也包括在本发明中。

本发明的药物组合物可以通过鼻部的气溶胶或吸入剂施用。此类组合物根据药物制剂领域众所周知的技术进行制备，并且可以制备成在生理盐水中的溶液，其采用苯甲醇或其他合适的防腐剂、吸收促进剂以增强生物利用度、氟碳化合物、和/或本领域已知的其他稳定剂或分散剂。

根据另一个实施方案，式（I）的化合物或其药学可接受的盐也可以通过植入（例如外科）例如用可植入或留置装置递送。可植入或留置装置可以设计为永久或暂时驻留于受试者中。可植入和留置装置的例子包括但不限于隐型眼镜、中心静脉导管和无针连接器、气管内插管、宫内避孕器、机械心脏瓣膜、起搏器、腹膜透析导管、假关节例如髋和膝置换、鼓膜造孔插管、尿管、发声假体、支架、输送泵、血管滤器和可植入的控制释放组合物。生物薄膜对具有可植入或留置装置的患者健康可以是有害的，因为它们将人工基质引入体内且可以引起持续性感染。因此，在可植入或留置装置之中或上面提供式（I）的化合物或其药学可接受的盐可以防止或减少生物薄膜的产生。此外，可植入或留置装置可以用作式（I）的化合物或其药学可接受的盐的积存处或储存器。任何可植入或留置装置都可以用于递送式（I）的化合物或其药学可接受的盐，条件是a）所述装置、式（I）的化合物或其药学可接受的盐、以及包括式（I）的化合物或其药学可接受的盐的任何药物组合物是生物相容的，和b）所述装置可以递送或释放有效量的式（I）的化合物或其药学可接受的盐，以对治疗的患者赋予疗效。

治疗剂由可植入或留置装置的递送是本领域已知的。参见例如，通过Hofma等人在Current Interventional Cardiology Reports 2001，3:28-36中发表的“Recent Developments in Coated Stents”，其完整内容包括其中引用的参考文献通过引用合并入本文。可植入装置的其他描述可以在美国专利号6,569,195和6,322,847；以及美国专利申请号2004/0044405、2004/0018228、2003/0229390、2003/0225450、2003/0216699和2003/0204168中发现，每个所述专利通过引用整体合并入本文。

在一些实施方案中，可植入装置是支架。在一个特定实施方案中，支架可以包括互锁网状缆线。每根缆线可以包括用于结构支持的金属线和用于递送治疗剂的聚合线。聚合线可以通过将聚合物浸入治疗剂溶液中进行给药。备选地，治疗剂可以在线由聚合前体溶液形成的过程中包埋在聚合线中。

在其他实施方案中，可植入或留置装置可以用包括治疗剂的聚合包衣包被。聚合包衣可以设计为控制治疗剂的释放速率。治疗剂的控制释放可以利用多种技术。已经知道装置具有整体的层或包衣，其将活性剂的异质溶液和/或分散体整合在聚合物质中，其中试剂的扩散是速率限制的，因为试剂通过聚合物扩散到聚合物-液体界面，且释放到周围液体中。在一些装置中，可溶物质也溶解或分散在聚合材料中，使得在材料溶解后留下另外的孔或通道。基质装置一般也是扩散限制的，但装置的通道或其他内部几何结构也在试剂释放到液体中起作用。通道还可以是预先存在的通道或通过释放试剂或其他可溶物质后留下的通道。

可侵蚀或可降解装置通常将活性剂物理地固定化在聚合物中。活性剂可以溶解和/或分散遍布聚合材料。聚合材料通常通过不稳定键的水解随时间以水解作用降解，允许聚合物侵蚀到液体内，将活性剂释放到液体内。亲水聚合物相对于疏水聚合物具有通常更快的侵蚀率。疏水聚合物被认为具有活性剂的几乎纯粹的表面扩散，具有从表面向内的侵蚀。亲水聚合物被认为允许水穿透聚合物的表面，允许在表面下的不稳定键水解，这可以导致聚合物的均匀的或大量的侵蚀。

可植入或留置装置的包衣可以包括聚合物掺和物，其各自具有不同的治疗剂释放率的。例如，包衣可以包括聚乳酸/聚氧化乙烯（PLA-PEO）共聚物或聚乳酸/聚己酸内酯（PLA-PCL）共聚物。相对于聚乳酸/聚己酸内酯（PLA-PCL）共聚物，聚乳酸/聚氧化乙烯（PLA-PEO）共聚物可以显示出更高的治疗剂释放率。随时间递送的治疗剂的相对量和剂量的速率可以通过控制更快速释放的聚合物相对于更缓慢释放的聚合物的相对量进行控制。对于更高的最初释放率，更快速释放的聚合物的比例相对于更缓慢释放的聚合物可以增加。如果大多数剂量需要经过长时间段释放，那么大多数聚合物可以是更缓慢释放的聚合物。装置包衣可以通过用聚合物、活性剂和溶剂的溶液或分散物来对装置进行喷雾。溶剂可以蒸发，留下聚合物和活性剂的包衣。活性剂可以溶解和/或分散在聚合物中。在一些实施方案中，共聚物可以在挤到装置上。

约0.01-约100mg/kg体重/天、优选0.5-约75mg/kg体重/天、和最优选约1-50mg/kg体重/天的活性成分化合物的剂量水平在用于防止和治疗细菌感染的单一疗法中是有用的。

通常，本发明的药物组合物将每天施用约1–5次或备选地作为连续输注。备选地，本发明的组合物可以在脉冲制剂中施用。此类施用可以用作慢性或急性治疗。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将依赖治疗的宿主和具体施用模式而改变。典型制剂将含有约5%-约95%的活性化合物（w/w）。优选地，此类制剂含有约20%-约80%活性化合物。

当本发明的组合物包含式（I）的化合物或其药学可接受的盐、和一种或多种另外的治疗剂或预防剂的组合时，所述化合物和另外的试剂应以单一疗法方案中通常施用的约10%-80%剂量的剂量水平存在。

在患者的病状改善后，需要时，可以施用维持剂量的本发明的化合物、组合物或组合。随后，根据症状，施用的剂量或频率或两者同时，作为症状的函数，可以减少至保持住改善的病状的水平，当症状已减轻至所需水平时，治疗应停止。然而，基于任何复发或疾病症状患者可能需要在长期基础上的间隙疗法。

如技术人员应当理解的，可能需要比上文所述那些更低或更高的剂量。用于任何具体患者的特定剂量和治疗方案将依赖多种因素，包括采用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状态、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合、疾病的严重性和过程、和患者对疾病的心理倾向和对治疗医生的判断。

根据另一个实施方案，本发明提供了用于治疗或防止细菌感染或疾病状态的方法，其包括给患者施用本文描述的任何化合物、药物组合物或组合的步骤。如本文使用的，术语“患者”意指动物，优选哺乳动物，且最优选地是人。

本发明的化合物还用作商业试剂，其与促旋酶B和/或拓扑异构酶IV酶有效结合。作为商业试剂，本发明的化合物及其衍生物可以在用于细菌促旋酶B和/或拓扑异构酶IV或其同源物的生物化学或细胞测定法中用于阻断促旋酶B和/或拓扑异构酶IV的活性，或可以衍生为与稳定树脂结合作为栓系底物用于亲和色谱法应用。表征商业促旋酶B和/或拓扑异构酶IV抑制剂的这些和其他用途对于本领域普通技术人员将是显而易见的。

本发明的化合物可以根据本领域技术人员对于类似化合物的已知常规方法来制备，如美国专利号RE40245E；美国专利号7,495,014B2；美国专利号7,569,591B2；美国专利号7,582,641B2；美国专利号7,618,974B2；和美国专利号7,727,992B2所教导的。所有这6个专利通过引用将其全文并入本文。用于制备本发明的化合物的详细条件在实施例中进一步说明。

为了更全面理解本发明，阐述下述方案和实施例。这些实施例仅用于举例说明的目的，并且不应解释为以任何方式限制本发明的范围。

下述定义描述本文描述的术语和缩写：

实施例1

2-（2-硝基苯基）-2,5-二氢呋喃和2-（2-硝基苯基）-2,3-二氢呋喃（3a&3b）的制备。

混合1-溴-2-硝基苯（1）（600g，99%，2.941mol，Alfa AesarA11686）、1,3-二（二苯基膦）丙烷（62.50g，97%，147.0mmol，Alfa Aesar A12931）、1,4-二噁烷（2.970L，Sigma-Aldrich360481）、碳酸钾（812.9g，5.882mol，JT-Baker301201）和2,3-二氢呋喃（2）（1.041kg，99%，1.124L，14.70mol，Aldrich200018）。将氮流鼓泡通过搅拌混合物4小时，随后加入乙酸钯(II)（16.51g，73.52mmol，Strem461780），并且继续脱氧另外10分钟。将反应混合物在回流下在氮下搅拌过夜（工作（worked-up）等分试样的NMR显示芳基溴的完全消耗）。允许它冷却，用己烷（1L）稀释，通过Florisil的短塞（500g，-200网目）过滤，且用EtOAc洗脱。将滤液在减压下浓缩（2-（2-硝基苯基）-2,3-二氢呋喃在高真空下是挥发性的，并且在室温可以是略微不稳定的），给出作为暗褐色油（654.0g）的（3a）和（3b）的混合物。将粗材料贮存于冰箱中，并且无需进一步纯化而推进。

实施例2

2-四氢呋喃-2-基-苯胺（4）的制备。

将5%碳钯（16.3g，50%湿润的，3.83mmol，Aldrich330116）置于Parr瓶中在氮下，随后为MeOH（100mL，JT-Baker909333）。加入溶解于MeOH（389mL）中的2-（2-硝基苯基）-2,5-二氢呋喃和2-（2-硝基苯基）-2,3-二氢呋喃（3a&3b））（163g）的粗混合物，随后为NEt₃（237.6mL，1.705mol，Sigma-Aldrich471283）。将容器置于Parr振荡器上且用H₂饱和。加入30psi H₂，并且振荡直至消耗完全（LCMS和NMR显示完全反应）。将反应混合物用氮净化，通过Celite^TM过滤且用EtOAc冲洗。将滤液在旋转蒸发器上浓缩，给出褐色油。将反应在相同规模上再重复三次，并且将分批合并用于纯化。将粗产物真空蒸馏（约15托），在108-129℃收集馏出物，以给出作为澄清淡黄色油的（4）（427.9g，平均得率是84%；98%GCMS纯度）。LCMS（经过5分钟用10-90%CH₃CN/水梯度洗脱C18柱，使用甲酸改性剂）M+1：163.95（1.46分钟）。¹H NMR（300MHz，CDCl₃）：δ7.15–7.04（m，2H），6.77–6.62（m，2H），4.85–4.77（m，1H），4.18（s，2H），4.12–4.02（m，1H），3.94–3.85（m，1H），2.25–1.95（m，4H）ppm。

实施例2a

（R）-2-（四氢呋喃-2-基）苯胺（4a）的制备。

将33g化合物（4）溶解到MeOH（265ml）内，这导致约125mg/ml的浓度。将混合物通过0.2微米膜滤器过滤，随后使用Berger multigram超临界流体色谱系统以100巴在ChiralPakIC柱（30mmX150mm，柱温35℃，Chiral Technologies）上进行色谱。移动相是以350ml/分钟洗脱的（90:10）CO₂:CH₃OH，伴随在220纳米处的UV监控。获得作为绿色油的15.64g所需产物（4a）。分析SFC（[90:10]CO₂:CH₃OH，以5ml/分钟在保持于35℃且在100巴压力下运行的ChiralPak IC柱（4.6X100mm）上，伴随在220nm处的UV监控）显示具有95%总体纯度的95.5%ee。

实施例3

4-溴-2-四氢呋喃-2-基-苯胺（5）的制备。

向冷却至2℃的2-四氢呋喃-2-基-苯胺（4）（53.45g，327.5mmol）在甲基叔丁醚（MTBE，641.4mL）和乙腈（213.8mL）中的搅拌溶液中加入4份N-溴琥珀酰亚胺（58.88g，99%，327.5mmol，Aldrich B81255），维持内部温度低于约8℃。搅拌反应混合物，同时用冰水浴冷却30分钟（工作等分试样的NMR显示原材料的完全消耗）。加入含水1N Na₂S₂O₃（330mL），去除冷水浴且搅拌20分钟。将混合物用EtOAc稀释且分离层。将有机相用饱和含水NaHCO₃（2x）、水、卤水洗涤，在MgSO₄上干燥，通过二氧化硅的短塞过滤，用EtOAc洗脱，且在减压下浓缩，以给出作为极暗色琥珀油的（5）（82.25g，77-94%HPLC纯度）。无需进一步纯化而推进。LCMS（经过5分钟用10-90%CH₃CN/水梯度洗脱C18柱，使用甲酸改性剂）M+1：242.10（2.89分钟）。¹H NMR（300MHz，CDCl₃）δ7.22（d，J=2.3Hz，1H），7.16（dd，J=8.4，2.3Hz，1H），6.54（d，J=8.4Hz，1H），4.79–4.73（m，1H），4.15（s，2H），4.10–4.01（m，1H），3.93–3.85（m，1H），2.26–2.13（m，1H），2.12–1.97（m，3H）ppm。

实施例4

N-（4-溴-2-硝基-6-四氢呋喃-2-基-苯基）-2,2,2-三氟乙酰胺（6）的制备。

经过15分钟（反应温度升至14℃）经由添加漏斗向在2℃搅拌的三氟乙酸酐（455.3mL，3.275mol，Sigma-Aldrich106232）中缓慢加入作为粘稠油的4-溴-2-四氢呋喃-2-基-苯胺（5）（79.29g，327.5mmol）。将剩余的油用无水2-甲基四氢呋喃（39.6mL，Sigma-Aldrich414247）冲洗到反应混合物内。去除冷水浴且加入硝酸铵（34.08g，425.8mmol，Aldrich 467758）。反应温度经过约30分钟升至40℃，在这时冷水浴用于控制放热性且使反应达到室温。随后去除冷水浴且将搅拌继续另外40分钟（HPLC显示极少剩余的未硝酸化材料）。将反应混合物缓慢倾入碎冰（800g）的搅拌混合物内。通过过滤收集固体沉淀物，用水、饱和含水NaHCO₃（至pH8）、再次的水和己烷洗涤。将湿润固体首先在对流加热炉中在50℃干燥几小时，并且随后在减压下在加热炉中在40℃过夜，给出作为淡褐色固体的（6）（77.86g，62%得率；98%HPLC纯度）。LCMS（经过5分钟用10-90%CH₃CN/水梯度洗脱C18柱，使用甲酸改性剂）M+1：383.19（3.27分钟）。¹H NMR（300MHz，CDCl₃）δ9.81（s，1H），8.08（d，J=2.2Hz，1H），7.73（d，J=2.2Hz，1H），4.88（dd，J=9.0，6.5Hz，1H），4.17–4.08（m，1H），4.03–3.95（m，1H），2.45–2.34（m，1H），2.17–2.06（m，2H），1.96–1.83（m，1H）ppm。

实施例5

4-溴-2-硝基-6-四氢呋喃-2-基-苯胺（6a）的制备。

将N-（4-溴-2-硝基-6-四氢呋喃-2-基-苯基）-2,2,2-三氟乙酰胺（6）（54.00g，140.9mmol）溶解于1,4-二噁烷（162mL）中，并且加入含水6M NaOH（70.45mL，422.7mmol，JT-Baker567202）。将反应混合物在回流下搅拌2天（HPLC显示完全消耗），允许冷却，用MTBE（800mL）稀释，用水（2x200mL）、饱和含水NH₄Cl、水和卤水洗涤。将混合物在MgSO₄上干燥，过滤且在减压下浓缩，以给出作为暗色琥珀油的（6a）（40.96g，93%得率；总体92%HPLC加上NMR纯度）。LCMS（从3-5分钟用10-90%MeOH/水梯度洗脱C18柱，使用甲酸改性剂）M+1：287.28（3.44分钟）。¹H NMR（300MHz，CDCl₃）δ8.24（d，J=2.4Hz，1H），7.41（d，J=2.3Hz，1H），6.91（s，2H），4.80（t，J=7.2Hz，1H），4.14–4.05（m，1H），3.98–3.90（m，1H），2.36–2.19（m，1H），2.15–2.01（m，3H）ppm。

实施例6

2-[5-（4-氨基-3-硝基-5-四氢呋喃-2-基-苯基）嘧啶-2-基]丙基-2醇（8）的制备。

混合4-溴-2-硝基-6-四氢呋喃-2-基-苯胺（6a）（40.40g，92%，129.5mmol）、1,4-二噁烷（260mL，Sigma-Aldrich360481）、2-[5-（4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基）嘧啶-2-基]丙基-2醇（7）（41.05g，155.4mmol）和含水2.7MNa₂CO₃（143.9mL，388.5mmol）。将氮流鼓泡通过搅拌混合物1小时，随后加入四（三苯基膦）钯（0）（7.48g，6.47mmol，Strem462150）。将反应混合物在回流下搅拌2小时（HPLC显示完全反应），允许冷却，用EtOAc稀释，用水、饱和含水NH₄Cl、卤水洗涤，在MgSO₄上干燥，且通过Florisi短塞过滤，用EtOAc洗脱。将滤液在减压下浓缩，给出暗褐色油。将油溶解于CH₂Cl₂中，且通过硅胶的短塞用CH₂Cl₂随后为EtOAc洗脱。将所需馏分在旋转蒸发器上浓缩，直至形成沉淀物，给出用MTBE研磨的浓稠褐色浆。将固体通过过滤收集，用MTBE洗涤，且在高真空下干燥，给出作为黄色固体的（8）（35.14g，99+%HPLC纯度）。LCMS（经过5分钟用10-90%CH₃CN/水梯度洗脱C18柱，使用甲酸改性剂）M+1：345.00（2.69分钟）。¹HNMR（300MHz，CDCl₃）δ8.88（s，2H），8.36（d，J=2.2Hz，1H），7.56（d，J=2.1Hz，1H），7.09（s，2H），4.92（t，J=7.2Hz，1H），4.62（s，1H），4.20–4.11（m，1H），4.03–3.94（m，1H），2.39–2.26（m，1H），2.23–2.08（m，3H），1.64（s，6H）ppm。将滤液进一步浓缩且通过用0-80%EtOAc/己烷洗脱的ISCO硅胶色谱法纯化，给出作为琥珀色固体的第二次收获的产物（8）（4.46g，88%总体得率；88%HPLC纯度。

实施例7

2-[5-（4-氨基-3-硝基-5-四氢呋喃-2-基-苯基）嘧啶-2-基]丙基-2醇（8）的备选制备。

混合N-（4-溴-2-硝基-6-四氢呋喃-2-基-苯基）-2,2,2-三氟乙酰胺（6）（19.00g，49.59mmol）、2-[5-（4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基）嘧啶-2-基]丙基-2醇（7）（14.41g，54.55mmol）、含水2.7M碳酸钠（73.48mL，198.4mmol）和1,4-二噁烷（190mL，Sigma-Aldrich 360481）。将氮流鼓泡通过搅拌混合物40分钟，随后加入1,1’-双（二苯基膦）二茂铁二氯化钯二氯甲烷加合物（2.025g，2.480mmol，Strem 460450）。将反应混合物在回流下在N₂下搅拌7小时，加入另外50mL饱和含水碳酸钠，并且回流加热另外16小时。允许混合物冷却，随后用EtOAc（500mL）和水（200mL）稀释。将层分离，并且用EtOAc（200mL）提取水相。将合并的有机相用水（500mL）、卤水（500mL）洗涤，在Na₂SO₄上干燥，通过Florisil塞过滤，并且在旋转蒸发器上浓缩，以给出作为橙色油的粗制品（8）。通过用20-90%EtOAc/己烷洗脱的ISCO硅胶色谱法纯化粗产物，以给出作为橙色固体的（8）（15.00g，87%得率；81-88%纯度）。LCMS（经过5分钟用10-90%CH₃CN/水梯度洗脱C18柱，使用甲酸改性剂）M+1：345.35（2.68分钟）。¹H NMR（300MHz，CDCl₃）δ8.88（s，2H），8.36（d，J=2.2Hz，1H），7.56（d，J=2.1Hz，1H），7.09（s，2H），4.92（t，J=7.2Hz，1H），4.62（s，1H），4.20–4.11（m，1H），4.03–3.94（m，1H），2.39–2.26（m，1H），2.23–2.08（m，3H），1.64（s，6H）ppm。

实施例8

2-[5-（3,4-二氨基-5-四氢呋喃-2-基-苯基）嘧啶-2-基]丙基-2醇（9）的制备。

在氮下向2-[5-（4-氨基-3-硝基-5-四氢呋喃-2-基-苯基）嘧啶-2-基]丙基-2醇（8）（30.10g，87.41mmol）和THF（90mL）在Parr瓶中的悬浮液中加入5%碳钯（3.01g，50%湿润的，0.707mmol，Aldrich330116）在MeOH（90mL，JT-Baker909333）中的浆，随后为NEt₃（24.37mL，174.8mmol，Sigma-Aldrich471283）。将容器置于Parr振荡器上且用H₂饱和。加入45psiH₂且振荡直至消耗完全（HPLC显示完全转换）。将反应混合物用氮净化，通过Celite^TM过滤且用EtOAc冲洗。将滤液通过夹在两张P5纸之间的0.5微米玻璃纤维滤纸再过滤，并且在减压下浓缩，给出作为淡褐色泡沫的（9）（28.96g，98%得率；93%NMR纯度）。LCMS（经过5分钟用10-90%CH₃CN/水梯度洗脱C18柱，使用甲酸改性剂）M+1：315.32（1.54分钟）。¹HNMR（300MHz，CDCl₃）δ8.83（s，2H），6.92（d，J=1.8Hz，1H），6.88（d，J=1.8Hz，1H），4.90（dd，J=7.9，6.2Hz，1H），4.72（s，1H），4.18（s，2H），4.17–4.08（m，1H），3.99–3.89（m，1H），3.46（s，2H），2.34–2.19（m，1H），2.17–2.05（m，3H），1.63（s，6H）ppm。

实施例9

1-乙基-3-[5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-四氢呋喃-2-基-1H-苯并咪唑-2-基]脲（11）的制备。

向2-[5-（3,4-二氨基-5-四氢呋喃-2-基-苯基）嘧啶-2-基]丙基-2醇（9）（32.10g，102.1mmol）在1,4-二噁烷（160.5mL，Sigma-Aldrich360481）中的搅拌溶液中加入pH3.5缓冲液（240.8mL），所述pH3.5缓冲液通过将NaOAc三水合物（34.5g）溶解于1N含水H₂SO₄（240mL）中制备。加入1-乙基-3-（N-（乙基氨甲酰基）-C-甲基硫代-碳亚氨基）脲（10）（28.46g，122.5mmol，CB Research andDevelopment），且在回流下搅拌过夜（HPLC显示起始二胺的99%消耗）。将反应混合物冷却至室温，且逐份倾入（起泡）含水饱和NaHCO₃（480mL）和水（120mL）的起始溶液内，给出pH8-9。将这搅拌30分钟，将固体通过过滤收集，用水充分洗涤至中性pH，且随后用EtOH更节约地洗涤。固体在减压下干燥，给出作为米白色固体的（11）（34.48g，82%得率；99.4%HPLC纯度）。LCMS（经过5分钟用10-90%CH₃CN/水梯度洗脱C18柱，使用甲酸改性剂）M+1：411.41（1.73分钟）。¹H NMR（300MHz，MeOD）δ9.02（s，2H），7.62（s，1H），7.37（s，1H），5.31（s，1H），4.23（dd，J=14.5，7.3Hz，1H），4.01（dd，J=15.0，7.1Hz，1H），3.38–3.28（m，2H），2.58–2.46（m，1H），2.16–2.05（m，2H），2.02–1.88（m，1H），1.63（s，6H），1.22（t，J=7.2Hz，3H）ppm。

实施例10

1-乙基-3-[5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲（12）的手性色谱法分离

在35℃在用DCM/MeOH/TEA（60/40/0.1）洗脱的CHIRALPAKIC柱（通过Chiral Technologies）上分辨1-乙基-3-[5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-四氢呋喃-2-基-1H-苯并咪唑-2-基]脲（11）（24.60g）的外消旋样品，给出作为白色固体的所需对映体（12）（11.35g，45%得率；99+%HPLC纯度，99+%ee）。分析手性HPLC保留时间是6.2分钟（CHIRALPAKIC4.6x250mm柱，1mL/分钟流速，30℃）。

通过单晶x射线衍射分析证实12的结构和绝对立体化学。在配备密封管Cu K-α来源（Cu Kα放射，）和Apex II CCD检测器的Bruker Apex II衍射仪上获得单晶衍射数据。选择具有1/2x0.05x0.05mm尺度的晶体，使用矿物油清洁，在MicroMount上固定且在Bruker APEXII系统上集中。获得在倒易空间中分离的三批40帧，以提供方向矩阵和初始晶胞参数。获得最终晶胞参数，且在数据收集完成后基于全数据集精炼。基于系统消光和强度统计学，解决结构且在无中心的P2₁空间群中精炼。

使用对于每帧60秒的暴露使用0.5°步获得倒易空间的衍射数据集至的分辨率。在100（2）K时收集数据。使用APEXII软件完成强度的积分和晶格参数的精炼。在数据收集后的晶体观察显示无分解征兆。如图1中所示，存在结构中的两个对称独立分子且两个对称独立分子都是R异构体。

使用Apex II软件将数据收集，精炼且简化。使用SHELXS97（Sheldrick，1990）；程序解决结构，并且使用SHELXL97（Sheldrick，1997）程序精炼结构。晶体显示具有P2₁空间群的单斜晶胞。晶格参数是β=102.966（3）°。

实施例11

1-乙基-3-[5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲（13）的甲磺酸盐的制备。

用冰水浴冷却1-乙基-3-[5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲（12）（9.32g，22.71mmol）在无水乙醇（93.2mL）中的搅拌悬浮液。加入甲磺酸（1.548mL，23.85mmol，Sigma-Aldrich471356），去除冷水浴且在室温搅拌20分钟。它在35℃在旋转蒸发器上浓缩至浓稠浆，用EtOAc稀释，通过过滤收集固体，用EtOAc洗涤，且在减压下干燥，给出作为白色固体的最初收获的（13）（8.10g）。将滤液在旋转蒸发器（rotavap）上浓缩，给出微黄色玻璃状泡沫，将它溶解于EtOH中，浓缩至固体浆，用EtOAc/Et₂O研磨，且通过过滤收集。将固体用EtOAc/Et₂O洗涤，与第一次收获组合，且在减压下干燥，给出作为白色固体的（13）（9.89g，86%得率；99+%HPLC纯度，99+%ee）。分析手性HPLC显示在CHIRALPAKIC4.6x250mm柱上用DCM/MeOH/TEA（60/40/0.1）洗脱具有6.3分钟的保留时间的一种对映体，使用在30℃1mL/分钟流速。LCMS（经过5分钟用10-90%CH₃CN/水梯度洗脱C18柱，使用甲酸改性剂）M+1：411.53（1.74分钟）。¹H NMR（300MHz，MeOD）δ9.07（s，2H），7.79（s，1H），7.62（s，1H），5.30（t，J=7.3Hz，1H），4.24（dd，J=14.6，7.3Hz，1H），4.04（dd，J=15.0，7.6Hz，1H），3.40–3.30（m，2H），2.72（s，3H），2.65–2.54（m，1H），2.20–2.07（m，2H），2.04–1.90（m，1H），1.64（s，6H），1.23（t，J=7.2Hz，3H）ppm。

实施例12

2-（2-氟-6-硝基-苯基）-2,3-二氢呋喃（15A）和2-（2-氟-6-硝基-苯基）-2,5-二氢呋喃（15B）的制备。

将2-溴-1-氟-3-硝基-苯（14）（200.3g，98%，892.3mmol，Bosche F6657）、1,4-二噁烷（981.5mL，Sigma-Aldrich360481）和2,3-二氢呋喃（2）（341.1mL，99%，4.462mol，Aldrich200018）装入反应烧瓶中，随后为N,N-二异丙基乙胺（155.4mL，892.3mmol，Sigma-Aldrich550043）和溴（三叔丁基膦）钯（I）二聚体（6.936g，8.923mmol，Johnson Matthey C4099）。将混合物在回流下搅拌2小时（HPLC显示起始芳基溴的98%消耗）。允许它冷却，通过过滤去除沉淀物，用EtOAc冲洗，并且在真空中浓缩滤液至暗赤褐色半固态油。将这溶解于CH₂Cl₂中，通过具有CH₂Cl₂的二氧化硅塞洗脱，并且在真空中浓缩，给出作为暗琥珀油的15A和15B的混合物（291.3g）。粗产物无需进一步纯化而推进。主要产物是2-（2-氟-6-硝基-苯基）-2,3-二氢呋喃（15A）（96%）：LCMS（经过5分钟用10-90%CH₃CN/水梯度洗脱C18柱，使用甲酸改性剂）M+1：210.23（3.13分钟）；¹HNMR（300MHz，CDCl₃）δ7.54（dt，J=8.0，1.2Hz，1H），7.43（td，J=8.2，5.2Hz，1H），7.32（ddd，J=9.7，8.3，1.3Hz，1H），6.33（dd，J=4.9，2.4Hz，1H），5.80（t，J=10.9Hz，1H），5.06（q，J=2.4Hz，1H），3.18–3.07（m，1H），2.94–2.82（m，1H）ppm。次要产物是2-（2-氟-6-硝基-苯基）-2,5-二氢呋喃（15B）（4%）：GCMS（Agilent HP-5MS30mx250μmx0.25μm柱在60℃加热2分钟至300℃超过15分钟，使用1mL/分钟的流速）M+1：210（11.95分钟）。¹H NMR（300MHz，CDCl₃）δ7.47（d，J=8.0Hz，1H），7.43–7.34（m，1H），7.30–7.23（m，1H），6.21–6.15（m，1H），6.11–6.06（m，1H），5.97–5.91（m，1H），4.89–4.73（m，2H）ppm。

实施例13

3-氟-2-四氢呋喃-2-基-苯胺（16）的制备。

将5%碳钯（37.3g，50%湿润的，8.76mmol，Aldrich330116）置于Parr瓶中在氮下，随后为MeOH（70mL，JT-Baker909333）。加入溶解于MeOH（117mL）中的2-（2-氟-6-硝基-苯基）-2,3-二氢呋喃和2-（2-氟-6-硝基-苯基）-2,5-二氢呋喃（15A&15B）（186.6g，892.1mmol）的粗混合物，随后为NEt₃（124.3mL，892.1mmol，Sigma-Aldrich471283）。将容器置于Parr振荡器上且用H₂饱和。在加入45psi H₂后，将反应混合物振荡直至原材料消耗完全（HPLC和LCMS显示完全反应）。将反应混合物用氮净化，通过Celite^TM过滤且用EtOAc冲洗。将滤液在旋转蒸发器上浓缩，给出褐色油，将所述褐色油溶解于Et₂O中且用水（2x）洗涤。用含水1N HCl（5x250mL）提取醚相，将所述醚相用Et₂O（3x）洗涤且随后用含水6N NaOH碱化至pH12-14。用CH₂Cl₂（4x）提取碱性水相，并且用饱和含水NH₄Cl洗涤合并的有机提取物，在MgSO₄上干燥且通过二氧化硅垫过滤，用CH₂Cl₂洗脱至25%EtOAc/己烷。将所需滤液在减压下浓缩，给出作为淡褐色油的16（121.8g，84%GCMS加上NMR纯度）。GCMS（Agilent HP-5MS30mx250μmx0.25μm柱在60℃加热2分钟至300℃超过15分钟，使用1mL/分钟的流速）M+1：182.0（11.44分钟）。LCMS（经过5分钟用10-90%CH₃CN/水梯度洗脱C18柱，使用甲酸改性剂）M+1：182.10（2.61分钟）。¹H NMR（300MHz，CDCl₃）δ6.97（td，J=8.1，6.3Hz，1H），6.43–6.35（m，2H），5.21–5.13（m，1H），4.54（s，2H），4.16–4.07（m，1H），3.90–3.81（m，1H），2.23–2.00（m，4H）ppm。另外的收获如下获得：将合并的醚相用饱和含水NaHCO₃、卤水洗涤，在Na₂SO₄上干燥，倾析且在减压下浓缩。将油真空蒸馏（约15托），在101–108℃下收集馏出物。在2℃向馏出油在EtOH（1体积）中的搅拌溶液中缓慢加入在iPrOH中的5M HCl（1当量）。使所得到的悬浮液达到室温，用EtOAc（3体积，体积/体积）稀释，并且搅拌2小时。通过过滤收集白色固体，用EtOAc洗涤，并且在减压下干燥，给出作为HCl盐的第二次收获的产物。将母液浓缩至浆，用EtOAc稀释且通过过滤收集固体，用EtOAc洗涤，并且在真空中干燥，给出作为HCl盐的第三次收获的产物。LCMS（经过5分钟用10-90%CH₃CN/水梯度洗脱C18柱，使用甲酸改性剂）M+1：182.10（2.58分钟）。¹H NMR（300MHz，CDCl₃）δ10.73（br.s，3H），7.66（d，J=8.1Hz，1H），7.33（td，J=8.2，5.9Hz，1H），7.13–7.05（m，1H），5.26（dd，J=9.0，6.5Hz，1H），4.38–4.28（m，1H），4.00–3.91（m，1H），2.59–2.46（m，1H），2.30–1.95（m，3H）ppm。来自三次收获的总体得率是76%。

实施例14

4-溴-3-氟-2-四氢呋喃-2-基-苯胺（17）的制备。

向冷却至-20℃的3-氟-2-四氢呋喃-2-基-苯胺（16）（131.9g，92%，669.7mmol）在甲基叔丁醚（1.456L）和乙腈（485mL）中的搅拌溶液中加入3份N-溴琥珀酰亚胺（120.4g，99%，669.7mmol，Aldrich B81255），维持反应温度低于约-15℃。在完全添加后，搅拌在-15至-10℃继续30分钟。工作等分试样的¹H NMR显示起始苯胺的96%消耗，因此加入另外4.82g NBS并且在-10℃搅拌另外30分钟。将含水1N Na₂S₂O₃（670mL）加入反应混合物中。去除冷水浴，将混合物搅拌20分钟，随后用EtOAc稀释。分离层且用饱和含水NaHCO₃（2x）、水、卤水洗涤有机相，在Na₂SO₄上干燥，倾析且在减压下浓缩，给出暗琥珀油。将残渣用己烷稀释且通过二氧化硅短塞洗脱，用25%EtOAc/己烷洗脱至50%EtOAc/己烷。将所需滤液在真空中浓缩，给出作为暗褐色油的17（182.9g，90%得率；86%NMR纯度）。LCMS（经过5分钟用10-90%CH₃CN/水梯度洗脱C18柱，使用甲酸改性剂）M+1：260.12（3.20分钟）。¹H NMR（300MHz，CDCl₃）δ7.15（dd，J=8.6，7.6Hz，1H），6.30（dd，J=8.7，1.3Hz，1H），5.19–5.12（m，1H），4.58（s，2H），4.16–4.07（m，1H），3.90–3.81（m，1H），2.23–1.99（m，4H）ppm。

实施例15

N-（4-溴-3-氟-6-硝基-2-四氢呋喃-2-基-苯基）-2,2,2-三氟-乙酰胺（18）的制备。

经过约20分钟（反应温度升至13℃）经由添加漏斗向在2℃搅拌的三氟乙酸酐（565.3mL，4.067mol，Sigma-Aldrich106232）中缓慢加入作为浓稠油的净4-溴-3-氟-2-四氢呋喃-2-基-苯胺（17）（123.0g，86%，406.7mmol）。将剩余的油用无水THF（35mL）冲洗到反应混合物内。去除冷水浴且将反应加热至35℃，随后经过2.5小时逐份加入NH₄NO₃（4.88gx20份，1.22mol，Sigma-Aldrich A7455），将反应温度维持在30–41℃，仅在需要时使用冰水浴以控制放热性。在完全添加后，将反应混合物搅拌另外10分钟（HPLC显示反应99%完全）。将它缓慢倾入碎冰（1.23kg）内，并且搅拌1小时，以允许形成可过滤的固体沉淀物，收集所述固体沉淀物且用水洗涤，用饱和含水NaHCO₃节约地洗涤，且再次用水洗涤（至pH7）。将产物在对流加热炉中在40℃干燥过夜，并且随后在减压下在加热炉中在50℃过夜，给出作为米色固体的18（152.5g，90%得率；96%HPLC纯度）。LCMS（经过5分钟用10-90%CH₃CN/水梯度洗脱C18柱，使用甲酸改性剂）M+1：401.30（3.41分钟）。¹H NMR（300MHz，CDCl₃）δ10.56（s，1H），8.19（d，J=6.6Hz，1H），5.22（dd，J=10.3，6.4Hz，1H），4.22（dd，J=15.8，7.2Hz，1H），3.99（dd，J=16.1，7.5Hz，1H），2.50–2.38（m，1H），2.22–2.11（m，2H），1.86–1.71（m，1H）ppm。

实施例16

4-溴-3-氟-6-硝基-2-四氢呋喃-2-基-苯胺（19）的制备。

将反应烧瓶装入N-（4-溴-3-氟-6-硝基-2-四氢呋喃-2-基-苯基）-2,2,2-三氟-乙酰胺（18）（242.3g，604.1mmol）、1,4-二噁烷（1.212L）、含水2M硫酸（362.4mL，724.9mmol），并且在回流下搅拌5天（HPLC显示98%转换）。允许冷却，用EtOAc稀释，用饱和含水NaHCO₃中和，分离层，并且用EtOAc（2x）再次提取水相。将合并的有机相用卤水（2x）洗涤，在MgSO₄上干燥，过滤且在真空中浓缩，给出作为褐绿色固体的19（181.7g，94%得率；95%HPLC纯度）。产物无需进一步纯化而推进下一步。LCMS（经过5分钟用10-90%CH₃CN/水梯度洗脱C18柱，使用甲酸改性剂）M+1：305.20（3.63分钟）。¹H NMR（300MHz，CDCl₃）δ8.35（d，J=7.3Hz，1H），7.45（s，2H），5.23–5.16（m，1H），4.23–4.14（m，1H），3.93–3.84（m，1H），2.31–1.96（m，4H）ppm。

实施例17

2-[5-（4-氨基-2-氟-5-硝基-3-四氢呋喃-2-基-苯基）嘧啶-2-基]丙基-2-醇（20）的制备。

向4-溴-3-氟-6-硝基-2-四氢呋喃-2-基-苯胺（19）（525.0g，1.721mol，Bridge Organics Co.）在1,4-二噁烷（4.20L，Sigma-Aldrich360481）中的搅拌溶液中加入1.2M NaHCO₃水溶液（4.302L，5.163mol）。将氮流鼓泡通过搅拌混合物2小时，随后加入2-[5-（4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基）嘧啶-2-基]丙基-2-醇（7）（545.4g，2.065mol，Bridge Organics Co.）和1,1’-双（二苯基膦）二茂铁二氯化钯二氯甲烷加合物（42.16g，51.63mmol，Strem460450）。将反应混合物在回流下搅拌，允许冷却，用EtOAc（8.4L）稀释，并且分离层。用饱和含水NH₄Cl和随后为卤水洗涤有机相。用EtOAc（4L）再次提取水相，并且用卤水洗涤这个有机提取物。将合并的有机相在MgSO₄上干燥，通过Florisil短塞过滤，用EtOAc洗脱，并且在旋转蒸发器上浓缩滤液，给出暗褐色湿润固体。将这溶解于CH₂Cl₂中，装载到硅胶垫上，用己烷、随后为25%EtOAc/己烷、和随后为50%EtOAc/己烷洗脱。将所需滤液在旋转蒸发器上浓缩至浓稠悬浮液，并且通过过滤收集固体，用MTBE研磨，并且在真空中干燥，给出作为亮黄色固体的20（55.8%得率，90-97%HPLC纯度）。浓缩滤液并且重复上述纯化，给出作为亮黄色固体的第二次收获20（19.7%得率）。再次浓缩滤液，给出暗褐色油，并且将这装载到具有甲苯和最少的CH₂Cl₂的二氧化硅柱上。将它用EtOAc/己烷（0%至50%）洗脱。将所需馏分浓缩至浆，且用MTBE/己烷稀释。通过过滤收集固体，并且用最少的MTBE洗涤，给出作为亮黄色固体的第三次收获20（4.9%得率），具有来自三次收获80%的总体得率。LCMS（经过5分钟用10-90%CH₃CN/水梯度洗脱C18柱，使用甲酸改性剂）M+1：363.48（2.95分钟）。¹HNMR（300MHz，CDCl₃）δ8.84（d，J=1.6Hz，2H），8.27（d，J=8.0Hz，1H），7.62（s，2H），5.31–5.24（m，1H），4.63（s，1H），4.27–4.18（m，1H），3.97–3.87（m，1H），2.33–2.05（m，4H），1.64（s，6H）ppm。

实施例18

2-[5-（4,5-二氨基-2-氟-3-四氢呋喃-2-基-苯基）嘧啶-2-基]丙基-2-醇（21）的制备。

将5%碳钯（14.21g，50%湿润的，3.339mmol，Aldrich330116）置于Parr瓶中在氮下，随后为MeOH（242mL，JT-Baker909333）和NEt₃（46.54mL，333.9mmol，Sigma-Aldrich471283）。将2-[5-（4-氨基-2-氟-5-硝基-3-四氢呋喃-2-基-苯基）嘧啶-2-基]丙基-2-醇（20）（121.0g，333.9mmol）溶解于热THF（360mL）中，允许冷却，加入反应混合物中，并且用另一份THF（124mL）冲洗。将容器置于Parr振荡器上且用H₂饱和。加入45psi H₂且振荡直至消耗完全（HPLC和LCMS显示完全反应）。将反应混合物用氮净化，通过Celite^TM过滤且用EtOAc冲洗。将它通过纸（玻璃微纤维）再过滤，并且在真空中浓缩滤液。将反应在相同规模上再重复三次，并且将分批合并，给出作为褐色固体的21（447g，99%得率；93%HPLC纯度）。LCMS（经过5分钟用10-90%CH₃CN/水梯度洗脱C18柱，使用甲酸改性剂）M+1：333.46（1.79分钟）。¹H NMR（300MHz，CDCl₃）δ8.81（d，J=1.4Hz，2H），6.69（d，J=7.3Hz，1H），5.27–5.20（m，1H），4.73（s，1H），4.70（s，2H），4.23–4.14（m，1H），3.94–3.86（m，1H），3.22（s，2H），2.32–2.22（m，1H），2.18–1.99（m，3H），1.63（s，6H）ppm。

实施例19

1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-四氢呋喃-2-基-1H-苯并咪唑-2-基]脲（22）的制备。

向2-[5-（4,5-二氨基-2-氟-3-四氢呋喃-2-基-苯基）嘧啶-2-基]丙基-2-醇（21）（111.3g，334.9mmol）和1,4-二噁烷（556.5mL，Sigma-Aldrich360481）的搅拌悬浮液中加入1-乙基-3-（N-（乙基氨甲酰基）-C-甲基硫代-碳亚氨基）脲（10）（93.36g，401.9mmol，CB Researchand Development），随后为通过将NaOAc三水合物（158.1g）溶解于1N含水H₂SO₄（1.100L）中制备的pH3.5缓冲液（1.113L）。将反应混合物在回流下搅拌过夜（HPLC显示完全转换），冷却至室温，并且逐份倾入（起泡）含水饱和NaHCO₃（2.23L）的起始溶液内，给出pH8-9。将这搅拌30分钟，将固体通过过滤收集，用水充分洗涤至中性pH，且随后用EtOH更节约地洗涤。固体在减压下干燥，给出作为米白色微黄色固体的22（135.2g，94%得率；99%HPLC纯度）。LCMS（经过5分钟用10-90%CH₃CN/水梯度洗脱C18柱，使用甲酸改性剂）M+1：429.58（2.03分钟）。¹H NMR（300MHz，MeOD）δ8.95（d，J=1.6Hz，2H），7.45（d，J=6.5Hz，1H），5.38（br.s，1H），4.27（dd，J=14.9，7.1Hz，1H），4.01（dd，J=15.1，7.0Hz，1H），3.37–3.29（m，2H），2.55（br.s，1H），2.19–2.07（m，2H），2.02–1.82（br.s，1H），1.63（s，6H），1.21（t，J=7.2Hz，3H）ppm。

实施例20

1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲（23）的手性色谱法分离。

在25℃在用DCM/MeOH/TEA（60/40/0.1）洗脱的CHIRALPAKIC柱（通过Chiral Technologies）上分辨1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-四氢呋喃-2-基-1H-苯并咪唑-2-基]脲（22）（133.60g）的外消旋样品，给出作为米白色固体的所需对映体23（66.8g，45%得率；99.8%HPLC纯度，99+%ee）。分析手性HPLC保留时间是7.7分钟（CHIRALPAKIC4.6x250mm柱，1mL/分钟流速，30℃）。将固体悬浮于2:1EtOH/Et₂O（5体积）中，搅拌10分钟，通过过滤收集，用2:1EtOH/Et₂O洗涤，并且在减压下干燥，给出白色固体（60.6g）。

通过单晶x射线衍射分析证实23的结构和绝对立体化学。在配备密封管Cu K-α来源（Cu Kα放射，和Apex II CCD检测器的Bruker Apex II衍射仪上获得单晶衍射数据。选择具有0.15x0.15x0.10mm尺度的晶体，使用矿物油清洁，在MicroMount上固定且在Bruker APEXII系统上集中。获得在倒易空间中分离的三批40帧，以提供方向矩阵和初始晶胞参数。获得最终晶胞参数，且在数据收集完成后基于全数据集精炼。基于系统消光和强度统计学，解决结构且在无中心的P2₁空间群中精炼。

使用对于每帧30秒的暴露使用0.5°步获得倒易空间的衍射数据集至的分辨率。在100（2）K时收集数据。使用APEXII软件完成强度的积分和晶格参数的精炼。在数据收集后的晶体观察显示无分解征兆。如图2中所示，存在结构中的两个对称独立分子且两个对称独立分子都是R异构体。

使用Apex II软件将数据收集，精炼且简化。使用SHELXS97（Sheldrick，1990）；程序解决结构，并且使用SHELXL97（Sheldrick，1997）程序精炼结构。晶体显示具有P2₁空间群的单斜晶胞。晶格参数是β=102.826（1）°。

实施例21

1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲（23A）的甲磺酸盐的制备。

向1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲（23）（15.05g，35.13mmol）在二氯甲烷（60mL，J.T.Baker931533）和无水乙醇（15mL，Pharmco-AAPER111000200）中的搅拌悬浮液中加入甲磺酸（2.392mL，36.89mmol，Sigma-Aldrich471356）。在室温搅拌直至观察到澄清溶液。经过约1小时缓慢加入庚烷（300mL），并且通过过滤收集固体沉淀物（使用在Whatman GF/F玻璃微纤维纸之上的Whatman定性#3纸）。在减压下在真空加热炉中（用硫酸钙和氢氧化钾脱水）在40℃干燥过夜，给出作为白色固体的23A（13.46g，99+%HPLC纯度，99+%ee）。分析手性HPLC显示在CHIRALPAKIC4.6x250mm柱上用CH₂Cl₂/MeOH/TEA（60/40/0.1）洗脱具有8.6分钟的保留时间的一种对映体，使用在30℃1mL/分钟流速。从滤液获得白色固体产物23A的第二次收获（4.36g，98%HPLC纯度，99+%ee）。LCMS（经过5分钟用10-90%CH₃CN/水梯度洗脱C18柱，使用甲酸改性剂）M+1：429.58（2.03分钟）。¹H NMR（300MHz，MeOD）δ9.00（d，J=1.6Hz，2H），7.67（d，J=6.1Hz，1H），5.39（t，J=7.7Hz，1H），4.30（dd，J=14.9，6.9Hz，1H），4.03（dd，J=14.8，7.7Hz，1H），3.40–3.31（m，2H），2.72（s，3H），2.70–2.60（m，1H），2.21–2.08（m，2H），1.98–1.84（m，1H），1.65（s，6H），1.22（t，J=7.2Hz，3H）ppm。

（R）-1-乙基-3-（6-氟-5-（2-（2-羟基丙基-2-基）嘧啶-5-基）-7-（四氢呋喃-2-基）-1H-苯并[d]咪唑-2-基）脲23随后可以根据下文所述的方案转换为磷酸盐或磷酸盐前体药物。

方案1

试剂和条件：（a）二苄基N,N-二异丙基亚磷酰胺、四唑、23℃、DMF；（b）mCPBA、0-23℃、DMF；（c）H₂、Pd/C、M⁺OH^-或D²⁺（OH^-）₂、EtOH、H₂O；（d）含水H⁺；（e）含水M⁺OH^-。

式（IB）的化合物可以如方案1中所示由化合物23制备。在步骤1中，用二苄基N,N-二异丙基亚磷酰胺和四唑处理化合物23，随后为间氯过氧苯甲酸（mCPBA），以提供磷酸二苄酯24。在步骤2中，在M⁺OH^-或D²⁺（OH^-）₂的存在下24的氢解提供式（IB）的化合物的双阴离子形式（X=–PO（O^-）₂·2M⁺或–PO（O^-）₂·D²⁺）。式（IB）的化合物的游离酸形式（X=PO（OH）₂）可以通过用含水酸处理双阴离子形式获得。式（IB）的化合物的单阴离子形式（X=PO（OH）O^-M⁺）可以通过用一当量M⁺OH^-处理游离酸形式获得。

方案2

试剂和条件：（a）Boc₂O、DMF、23℃；（b）二苄基N,N-二异丙基亚磷酰胺、四唑、23℃、DMF；（c）mCPBA、0-23℃、DMF；（d）TFA、H₂O、MeOH、DCM、23℃；（e）H₂、Pd/C、M⁺OH^-或D²⁺（OH^-）₂、EtOH、H₂O；（f）含水H⁺；（_g）含水M⁺OH^-。

备选地，式（IB）的化合物可以如方案2中所示由化合物23制备。在步骤1中，用二叔丁基二碳酸酯（Boc₂O）处理化合物23，以提供受保护的苯并咪唑化合物25。在步骤2中，用二苄基N,N-二异丙基亚磷酰胺和四唑，随后为mCPBA处理化合物25，以提供受保护的磷酸二苄酯26。在步骤3中，用三氟乙酸（TFA）处理化合物26，以去除保护基团且提供磷酸二苄酯24。在步骤4中，在M⁺OH^-或D²⁺（OH^-）₂的存在下24的氢解提供式（IB）的化合物的双阴离子形式（X=–PO（O^-）₂·2M⁺或–PO（O^-）₂·D²⁺）。式（IB）的化合物的游离酸形式（X=PO（OH）₂）可以通过用含水酸处理双阴离子形式获得。式（I）的化合物的单阴离子形式（X=PO（OH）O^-M⁺）可以通过用一当量M⁺OH^-处理游离酸形式获得。

方案3

试剂和条件：（a）Boc₂O、DMAP、DMF、23℃；（b）二苄基N,N-二异丙基亚磷酰胺、四唑、23℃、DMF；（c）mCPBA、0-23℃、DMF；（d）TFA、DCM；（e）含水M⁺OH^-或D²⁺（OH^-）₂；（f）含水H⁺；（g）含水M⁺OH^-。

式（IB）的化合物还可以如方案3中所示由化合物23制备。在步骤1中，在N,N-二甲氨基吡啶（DMAP）的存在下用二当量Boc₂O处理化合物23，以提供受双保护的苯并咪唑化合物28。在步骤2中，用二苄基N,N-二异丙基亚磷酰胺和四唑，随后为mCPBA处理化合物28，以提供受双保护的磷酸二苄酯29。在步骤3中，用TFA处理化合物29，以去除保护基团。用含水M⁺OH^-或D²⁺（OH^-）₂处理所得到的中间产物提供式（IB）的化合物的双阴离子形式（X=–PO（O^-）₂·2M⁺或–PO（O^-）₂·D²⁺）。式（IB）的化合物的游离酸形式（X=PO（OH）₂）可以通过用含水酸处理双阴离子形式获得。式（I）的化合物的单阴离子形式（X=PO（OH）O^-M⁺）可以通过用一当量M⁺OH^-处理游离酸形式获得。

实施例22

（R）-二苄基2-（5-（2-（3-乙基脲基）-6-氟-7-（四氢呋喃-2-基）-1H-苯并[d]咪唑-5-基）嘧啶-2-基）丙基-2-基磷酸酯（24）的制备。

向在1L圆底烧瓶中的1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲（23）（10.24g，23.66mmol）在N₂下在23℃加入DMF（200mL），随后为四唑溶液（105.2mL在MeCN中的0.45M，47.32mmol），随后为N-二苄氧膦酰基-N-异丙基-丙基-2-胺（12.26g，11.93mL，35.49mmol）。在4.5小时后，加入更多N-二苄氧膦酰基-N-异丙基-丙基-2-胺（4mL）。在搅拌进一步16小时后，将反应冷却至0℃（冰水浴），随后用mCPBA（15.17g，61.52mmol）处理。将混合物在0℃搅拌30分钟，随后在23℃搅拌30分钟，这之后使反应混合物在水（400mL）和EtOAc（700mL）之间分隔。分离有机层，用饱和含水碳酸氢钠（500mL）、10%含水亚硫酸氢钠（500mL）、饱和含水碳酸氢钠（500mL）和卤水（500mL）洗涤，随后干燥（硫酸镁），过滤且浓缩。使用ISCO COMBIFLASH品牌快速色谱法纯化系统（330g柱）通过MPLC纯化残渣，用在DCM线性梯度中的0-10%EtOH经过16.5柱体积以200mL/分钟流速洗脱。在真空中浓缩后，获得作为白色固体的（R）-二苄基2-（5-（2-（3-乙基脲基）-6-氟-7-（四氢呋喃-2-基）-1H-苯并[d]咪唑-5-基）嘧啶-2-基）丙基-2-基磷酸酯（24）（13.89g，20.17mmol，85.27%）。ESMS（M+1）=689.5；¹H NMR（300MHz，CD₃OD）δ8.88（d，J=1.6Hz，2H），7.37（d，J=6Hz，1H），7.30（m，10H），5.38-5.33（m，1H），5.12-5.01（m，4H），4.24（dd，J=6.8，14.9Hz，1H），3.98（dd，J=6.9，15.1Hz，1H），3.35-3.27（m，3H），2.52（q，J=5.9Hz，1H），2.14-2.05（m，2H），1.91（s，6H）和1.22-1.14（m，3H）ppm。

实施例23

（R）-2-（5-（2-（3-乙基脲基）-6-氟-7-（四氢呋喃-2-基）-1H-苯并[d]咪唑-5-基）嘧啶-2-基）丙基-2-基磷酸二钠（W）的制备。

将1LParr容器装入水（200mL）、Pd/C（4g，10重量%干重，湿润的，Degussa型）、（R）-二苄基2-（5-（2-（3-乙基脲基）-6-氟-7-（四氢呋喃-2-基）-1H-苯并[d]咪唑-5-基）嘧啶-2-基）丙基-2-基磷酸酯（24）（13.89g，20.17mmol）、EtOH（400mL）和含水1MNaOH（40.34mL，40.34mmol）。将所得到的混合物在50psi H₂下在Parr振荡仪器上氢化40分钟。将反应混合物通过0.22μm聚苯醚砜（PES）膜过滤，给出暗色滤液。水冲洗导致横越滤膜的更暗色的材料。将所得到的滤液经过硅藻土垫，并且暗色材料直到用水冲洗垫才洗脱。所得到的暗色溶液（约700mL）用三体积EtOH（2100mL）稀释，通过0.22μm PES膜（使用4个一次性Corning聚苯乙烯过滤系统，#431098）过滤，并且在真空中浓缩滤液。将所得到的残渣溶解于水（100mL）和EtOH（300mL）中，通过0.22μm PES膜过滤，以给出澄清的黄色溶液，随后经过硅藻土塞（26mm直径x60mm高度，用EtOH预湿润），用EtOH（50mL）冲洗，并且随后浓缩滤液。将所得到的残渣溶解于1L圆底烧瓶中的水（250mL）中，并且将1M含水HCl（40mL）经过15分钟伴随搅拌缓慢加入，以给出白色固体的浆。在HCl添加完全后二十分钟，经由过滤通过0.22μm PES膜收集固体。用水（100mL）洗涤收集的固体，随后转移（仍湿润的）至1L圆底烧瓶，并且在MeOH（150mL）中浆化30分钟。所得到的精细白色沉淀物经由过滤收集，随后在真空中干燥过夜。用水（80mL）随后为1.0N含水NaOH（36.0mL，2当量）处理所得到的游离酸（9.17g，18.0mmol）。将所得到的溶液冷冻且冻干，以给出作为苍白的奶油色固体的[1-[5-[2-（乙基氨甲酰基氨基）-6-氟-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-5-基]嘧啶-2-基]-1-甲基-乙基]磷酸二钠（W）（10.206g，18.08mmol，89.66%），具有一致的分析数据。ESMS（M+1）=509.4；¹H NMR（300MHz，D₂O）δ8.58（s，2H），6.92（d，J=6.3Hz，1H），5.13（t，J=7.5Hz，1H），3.98-3.81（m，2H），3.04（q，J=7.2Hz，2H），2.26（t，J=5.7Hz，1H），1.97-1.92（m，2H），1.67（s，6H）和1.01（t，J=7.2Hz，3H）ppm。

实施例24

Boc-1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲（25）的制备。

在23℃向1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲（23）（10.72g，25.02mmol）在DMF（250mL）中的溶液/悬浮液中加入Boc₂O（6.11g，28.00mmol）。在2小时后，加入2M在MeOH（2mL）中的氨，以猝灭任何过量Boc₂O。使猝灭的反应混合物在EtOAc和水（各400mL）之间分隔，分离有机层，用水（2x400mL）和卤水（400mL）洗涤，随后在MgSO₄上干燥，过滤且浓缩，以给出无需进一步纯化使用的Boc-1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲（25）（12.69g，23.58mmol，94.26%）。ESMS（M+1）=529.3；¹H NMR（300.0MHz，CDCl₃）δ9.50（s，1H），9.02（t，J=5.3Hz，1H），8.91（d，J=1.6Hz，2H），7.74（d，J=6.5Hz，1H），5.58（t，J=7.8Hz，1H），4.64（s，1H），4.22（q，J=7.4Hz，1H），4.05（td，J=7.8，4.3Hz，1H），3.47（td，J=7.2，4.3Hz，2H），2.42-2.35（m，2H），2.28-2.16（m，2H），1.75（s，9H），1.68（s，6H）和1.31（t，J=7.3Hz，3H）ppm。

实施例25

Boc-1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲二苄基磷酸酯（26）的制备。

在N₂下在23℃向Boc-1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲（25）（12.69g，23.58mmol）和四唑（3.304g，47.16mmol）中加入DCM（240mL），随后为N-二苄氧膦酰基-N-异丙基-丙基-2-胺（9.775g，9.509mL，28.30mmol）。在23℃3小时后，将反应冷却至0℃，随后加入mCPBA（6.977g，28.30mmol）。将反应溶液在0℃搅拌45分钟，随后在23℃搅拌20分钟。随后使反应混合物在DCM（50mL）和饱和含水碳酸氢钠（400mL）之间分隔。分离有机层，随后用含水亚硫酸氢钠（在350mL水中63g）和饱和含水碳酸氢钠（400mL）接连洗涤，随后在硫酸镁上干燥，过滤且在真空中浓缩。使用ISCOCOMBIFLASH品牌快速色谱法纯化系统（330g二氧化硅柱）通过MPLC纯化残渣，用在己烷线性梯度中的0-100%EtOAc经过16柱体积以200mL/分钟洗脱。在真空中蒸发含产物的馏分，以给出Boc-1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲二苄基磷酸酯（26）（11.92g，15.11mmol，64.09%）。ESMS（M+1）=789.2；¹H NMR（300.0MHz，CDCl₃）δ9.51（s，1H），9.03（t，J=5.4Hz，1H），8.91（d，J=1.6Hz，2H），7.73（d，J=6.5Hz，1H），7.37-7.28（m，10H），5.58（t，J=7.8Hz，1H），5.17-5.05（m，4H），4.23（t，J=7.5Hz，1H），4.05（td，J=7.8，4.3Hz，1H），3.53-3.44（m，2H），2.39（dd，J=7.9，14.5Hz，2H），2.28-2.15（m，2H），1.98（s，6H），1.72（m，9H）和1.31（t，J=7.2Hz，3H）ppm。

实施例26

（R）-二苄基2-（5-（2-（3-乙基脲基）-6-氟-7-（四氢呋喃-2-基）-1H-苯并[d]咪唑-5-基）嘧啶-2-基）丙基-2-基磷酸酯（24）的制备。

在23℃向在DCM（300mL）中的Boc-1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲二苄基磷酸酯（26）（11.9g，15.09mmol）溶液中加入水（2.325mL，129.1mmol），随后为TFA（3.441g，2.325mL，30.18mmol）。在1小时后，仅通过薄层色谱法（tlc）观察到部分转换，因此加入更多的TFA（3.441g，2.325mL，30.18mmol）。在进一步的2.5小时后，加入MeOH（2mL），并且将混合物搅拌进一步的18小时。用1:1卤水:饱和含水碳酸氢钠（200mL）洗涤反应混合物。用DCM（150mL）再次提取水层，合并有机层，随后干燥（在硫酸镁上），过滤且在真空中浓缩。将所得到的残渣再溶解于EtOAc（200mL）中，用水（150mL）和卤水（100mL）洗涤，随后干燥（在硫酸镁上），过滤且浓缩，以给出作为白色固体的（R）-二苄基2-（5-（2-（3-乙基脲基）-6-氟-7-（四氢呋喃-2-基）-1H-苯并[d]咪唑-5-基）嘧啶-2-基）丙基-2-基磷酸酯（24）（10.21g，14.83mmol，98.27%）。ESMS（M+1）=689.4；¹H NMR（300MHz，CD₃OD）δ8.88（d，J=1.6Hz，2H），7.37（d，J=6Hz，1H），7.30（m，10H），5.38-5.33（m，1H），5.12-5.01（m，4H），4.24（dd，J=6.8，14.9Hz，1H），3.98（dd，J=6.9，15.1Hz，1H），3.35-3.27（m，3H），2.52（q，J=5.9Hz，1H），2.14-2.05（m，2H），1.91（s，6H）和1.22-1.14（m，3H）ppm。

实施例27

（R）-2-（5-（2-（3-乙基脲基）-6-氟-7-（四氢呋喃-2-基）-1H-苯并[d]咪唑-5-基）嘧啶-2-基）丙基-2-基磷酸二钠（W）的制备。

将1L圆底烧瓶装入（R）-二苄基2-（5-（2-（3-乙基脲基）-6-氟-7-（四氢呋喃-2-基）-1H-苯并[d]咪唑-5-基）嘧啶-2-基）丙基-2-基磷酸酯（24）（9.37g，13.61mmol）、EtOH（300mL）、水（150mL）、Pd/C（10重量%干重，湿润的，Degussa型，3g）和1M含水NaOH（27.22mL，27.22mmol）。将悬浮液抽真空3分钟（针至泵），随后置于氢气（气球）大气下。在23℃搅拌2.5小时后，通过0.22μmPES膜（一次性Corning过滤系统，1L，聚苯乙烯，#431098）过滤反应，以去除催化剂，且用EtOH（50mL）洗涤。浓缩所得到的溶液，将残渣溶解于水（80mL）中，用MeCN（80mL）处理，随后冷冻且冻干，以给出作为白色固体的（R）-2-（5-（2-（3-乙基脲基）-6-氟-7-（四氢呋喃-2-基）-1H-苯并[d]咪唑-5-基）嘧啶-2-基）丙基-2-基磷酸二钠（W）（7.10g，12.81mmol，94.12%）。ESMS（M+1）=509.3；¹HNMR（300MHz，D₂O）δ8.58（s，2H），6.92（d，J=6.3Hz，1H），5.13（t，J=7.5Hz，1H），3.98-3.81（m，2H），3.04（q，J=7.2Hz，2H），2.26（t，J=5.7Hz，1H），1.97-1.92（m，2H），1.67（s，6H）和1.01（t，J=7.2Hz，3H）ppm。

实施例28

二Boc-1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲（28）的制备。

向在DMF（30mL）中的1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲（23）（1.333g，3.111mmol）溶液/悬浮液中加入DMAP（38.01mg，0.3111mmol），随后为Boc₂O（1.426g，1.501mL，6.533mmol）。在30分钟后，用水和EtOAc（各300mL）稀释反应混合物，分离有机层，用水和卤水（各300mL）洗涤，随后在硫酸镁上干燥，过滤且浓缩。使用ISCO COMBIFLASH品牌快速色谱法纯化系统（80g二氧化硅柱）通过MPLC纯化残渣，用在己烷线性梯度中的0-60%EtOAc经过20柱体积以60mL/分钟流速洗脱。合并所需产物馏分且蒸发，以给出作为澄清泡沫的二Boc-1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲（28）（1.43g，2.275mmol，73.11%）。ESMS（M+1）=629.3；¹H NMR（300.0MHz，CDCl₃）δ8.95（d，J=1.6Hz，2H），8.31-8.27（m，1H），8.05（d，J=6.5Hz，1H），5.80-5.68（m，1H），4.70（s，1H），4.21-4.09（m，1H），3.98（d，J=6.4Hz，1H），3.42-3.37（m，2H），2.45-2.00（m，4H），1.65（s，6H），1.62（s，9H），1.37（s，9H）和1.28-1.21（m，3H）ppm。

实施例29

二Boc-1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲二苄基磷酸酯（29）的制备。

在N₂下在23℃向二Boc-1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲（28）（1.13g，1.797mmol）和四唑（251.8mg，3.594mmol）中加入DCM（30mL），随后为N-二苄氧膦酰基-N-异丙基-丙基-2-胺（744.7mg，724.4μL，2.156mmol）。在搅拌18小时后，将反应冷却至0℃，随后用mCPBA（531.5mg，2.156mmol）处理。将反应在0℃搅拌15分钟，随后在23℃搅拌30分钟。随后使所得到的溶液在EtOAc和饱和含水碳酸氢钠（各300mL）之间分隔，分离有机层，随后用10%含水亚硫酸氢钠、饱和含水碳酸氢钠和卤水（各300mL）洗涤，随后在硫酸镁上干燥，过滤且浓缩。使用ISCO COMBIFLASH品牌快速色谱法纯化系统（80g二氧化硅柱）通过MPLC纯化残渣，用在己烷线性梯度中的0-80%EtOAc经过20柱体积以60mL/分钟流速洗脱。合并所需产物馏分且蒸发，以给出作为澄清、玻璃状油的二Boc-1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲二苄基磷酸酯（29）（1.03g，1.159mmol，64.50%）。ESMS（M+1）=889.2；¹H NMR（300.0MHz，CDCl₃）δ8.93（d，J=1.5Hz，2H），8.31（s，1H），8.04（d，J=6.4Hz，1H），7.36-7.26（m，10H），5.83-5.70（m，1H），5.16–5.05（m，4H），4.24-4.18（m，1H），4.03-3.97（m，1H），3.42-3.36（m，2H），2.43– 2.05（m，4H），1.98（s，6H），1.64（m，9H），1.40（s，9H）和1.26（t，J=7.2Hz，3H）ppm。

实施例30

（R）-2-（5-（2-（3-乙基脲基）-6-氟-7-（四氢呋喃-2-基）-1H-苯并[d]咪唑-5-基）嘧啶-2-基）丙基-2-基磷酸钠（W）的制备。

在23℃向在DCM（10mL）中的二Boc-1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲二苄基磷酸酯（29）（121mg，0.1361mmol）溶液中加入TFA（5mL）。在2小时后，在真空中浓缩反应混合物。将残渣溶解于MeOH（6mL）中，并且用在MeOH中的约0.5mL2MNH₃处理（以完全溶解材料）。反应溶液在制备型HPLC、反相、Sunfire prep C18OBD 5μM柱19×100mm上在6次注射中纯化；用10-90%含水MeCNw/0.1%TFA缓冲液线性梯度经过15分钟以20mL/分钟流速洗脱。合并含产物的馏分且冻干。将所得到的材料悬浮于MeOH（3mL）中，在23℃搅拌30分钟，随后经由过滤通过塑料玻璃料过滤收集沉淀物。对所得到的白色固体再实施MeOH浆（3mL），随后经由过滤收集，以在干燥后给出68mg白色固体。用0.10M含水NaOH（2.68mL，2当量NaOH）处理白色固体，以给出随后经过具有0.45μmPTFE膜的Acrodisc CR 13mm注射器式滤器的溶液，用水（2mL）冲洗。用MeCN（3mL）处理所得到的溶液，冷冻且冻干，以给出作为白色粉末的（R）-2-（5-（2-（3-乙基脲基）-6-氟-7-（四氢呋喃-2-基）-1H-苯并[d]咪唑-5-基）嘧啶-2-基）丙基-2-基磷酸钠盐（W）。ESMS（M+1）=509.2；¹H NMR（300MHz，D₂O）δ8.58（s，2H），6.92（d，J=6.3Hz，1H），5.13（t，J=7.5Hz，1H），3.98-3.81（m，2H），3.04（q，J=7.2Hz，2H），2.26（t，J=5.7Hz，1H），1.97-1.92（m，2H），1.67（s，6H）和1.01（t，J=7.2Hz，3H）ppm。

实施例31

在液体培养基中的敏感性测试

通过在液体培养基中的敏感性测试来测试本发明的化合物的抗微生物活性。此类测定法在管理此类实践的最新CLSI文件的指导内执行：″M07-A8Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests forBacteria that Grow Aerobically；批准标准—第八版（2009）″。其他出版物例如″Antibiotics in Laboratory Medicine″（由V.Lorian编辑，出版商Williams和Wilkins，1996）提供了在实验室抗生素测试中的基本实践技术。使用的特定方案如下：

方案#1：使用微量稀释肉汤法的化合物的促旋酶MIC的测定

材料：

圆底96孔微量滴定板（Costar3788）

Mueller Hinton II琼脂平板（MHII；BBL预混合）

Mueller Hinton II液体肉汤（MHII；BBL预混合）

BBL Prompt Inoculation System（Fisher B26306）

测试读数镜（Fisher）

划线培养至单个菌落的细菌的琼脂平板，新鲜制备的

无菌DMSO

人血清（U.S.Biologicals S1010-51）

裂解马血（Quad Five270-100）

刃天青0.01%

Sprague Dawley大鼠血清（U.S.Biologicals1011-90B或ValleyBioMedical AS3061SD）

合并的小鼠血清（Valley BioMedical AS3054）

菌株（培养基，肉汤和琼脂）：

1.金黄色葡萄球菌ATCC#29213

a.MHII

b.MHII+50%人血清

c.MHII+50%大鼠血清

d.MHII+50%小鼠血清

2.金黄色葡萄球菌ATCC#29213GyrB T173I（MHII）

3.金黄色葡萄球菌，JMI收集菌株；参见表5（MHII）

4.表皮葡萄球菌，JMI收集菌株；参见表5（MHII）

5.粪肠球菌ATCC#29212（MHII+3%裂解马血）

6.屎肠球菌ATCC#49624（MHII+3%裂解马血）

7.粪肠球菌，JMI收集菌株；参见表5（MHII+3%裂解马血）

8.屎肠球菌，JMI收集菌株；参见表5（MHII+3%裂解马血）

9.肺炎链球菌ATCC#10015（MHII+3%裂解马血）

10.肺炎链球菌，JMI收集菌株；参见表5（MHII+3%裂解马血）

11.β-溶血链球菌，群A、B、C、G）JMI收集菌株；参见表5（MHII+3%裂解马血）

12.蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）ATCC10987（MHII）

13.蜡状芽孢杆菌ATCC14579（MHII）

14.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC6638（MHII）

15.枯草芽孢杆菌（168）ATCC6051（MHII）

接种物制备（对于除金黄色葡萄球菌+50%血清之外的所有菌株）：

1.使用BBL Prompt试剂盒，在如上所示合适的琼脂培养基上生长的培养物中挑选5个大的或10个小的充分分离的菌落，并且接种在试剂盒中提供的1mL无菌盐水。

2.将孔涡旋～30秒，以提供～10⁸细胞/mL的悬浮液。实际密度可以通过将这种悬浮液的稀释物铺平板加以证实。

3.对于测试的化合物的每块平板，通过将0.15mL细胞转移到15mL（～10⁶细胞/mL）无菌肉汤（或参见下文）内，将悬浮液1/100稀释，随后涡旋混合。如果测试化合物（>8种化合物）的超过1块平板，那么体积可以相应增加。

a.对于粪肠球菌、屎肠球菌和肺炎链球菌：使用14.1mL MHII+0.9mL裂解马血。

4.使用50μl细胞（～5x10⁴细胞），以接种含有50μl在肉汤中稀释的药物的每个微量滴定孔（参见下文）。

药物稀释、接种、MIC测定：

1.所有药物/化合物原液通常在100%DMSO中以12.8mg/mL浓度制备。

2.将药物/化合物原液稀释成在50μL DMSO中的200x所需终浓度。如果MICs的起始浓度是8μg/mL终浓度，那么需要6.25μL原液+43.75μL DMSO。将每个200x原液置于新96孔微量滴定板的第1列的分开行中。

3.将25μL DMSO加入含有200x化合物原液的微量滴定板的所有行的第2-12列中，并且从第1列直到第11列连续稀释25μL，在每列后更换枪头。即，25μL化合物+25μL DMSO=2x稀释度。在系列结束处留下“无化合物”DMSO孔用于对照。

4.对于被测试的每种菌株（除了金黄色葡萄球菌+50%人血清外），使用Matrix移液管用50μL MHII肉汤制备两块微量滴定板。

5.在加入50μl细胞前，将0.5μL每个稀释度（w/Matrix自动移液器）转移至50μL培养基/微量滴定孔中。在1/200稀释到培养基+细胞内后，化合物的通常起始浓度是8μg/mL-化合物浓度跨越微量滴定板的行以2x步长降低。所有MICs一式两份完成。

6.所有孔用50μl稀释的细胞悬液（参见上文）接种至100μl的终体积。

7.在加入接种物后，用手动多道移液器充分混合每个孔；在同一块微量滴定板上药物浓度从低到高使用相同枪头。

8.平板在37℃孵育至少18小时。

9.在18小时后用测试读数镜查看平板，并且当未观察到生长时（在孔中的光学澄清），将MIC记录为药物的最低浓度。

金黄色葡萄球菌+50%人血清、金黄色葡萄球菌+50%大鼠血清或金黄色葡萄球菌+50%小鼠血清的制备。

1.通过组合15mL MHII+15mL人血清–总共30mL，制备50%血清培养基。当测试超过1种化合物平板时，以30mL增量增加体积。

2.使用如上所述的金黄色葡萄球菌ATCC#29213的相同BBLPrompt接种物，通过将0.15mL细胞转移到30mL（～5x10⁵细胞/mL）上文制备的50%人血清培养基内1/200稀释，并且涡旋混合。

3.用在50%血清培养基中的100μL细胞装入所需数目的微量滴定板的所有测试孔。

4.将0.5μL每个化合物稀释度（w/Matrix自动移液器）转移至100μL细胞/培养基。在1/200稀释到培养基+细胞内后，化合物的通常起始浓度是8μg/mL-化合物浓度以跨越微量滴定板的行2x步长降低。所有MICs一式两份完成。

5.用手动多道移液器充分混合每个孔；在同一块微量滴定板上药物浓度从低到高使用相同枪头。

6.平板在37℃孵育至少18小时。在孵育后，将25μL0.01%刃天青加入每个孔，并且在37℃继续孵育至少另外1小时或直至刃天青变色。

7.用测试读数镜查看平板，并且记录MIC。当使用刃天青时，在无生长的孔中染料的颜色从深蓝色变成亮粉色。将染料转变为粉色的药物的最低浓度是MIC。

方案#2：使用微量稀释肉汤法的化合物针对革兰氏阴性的促旋酶MIC测定

材料：

圆底96孔微量滴定板（Costar3788）

Mueller Hinton II琼脂平板（MHII；BBL预混合）

Mueller Hinton II液体肉汤（MHII；BBL预混合）

BBL Prompt Inoculation System（Fisher b26306）

测试读数镜（Fisher）

划线培养至单个菌落的细菌的琼脂平板，新鲜制备的

无菌DMSO

菌株（MHII培养基用于全部；肉汤和琼脂）：

1.大肠杆菌ATCC#25922

2.大肠杆菌，JMI收集菌株，参见表5

3.大肠杆菌AG100WT

4.大肠杆菌AG100tolC

5.鲍氏不动杆菌（Acinetobacter baumannii）ATCC#BAA-1710

6.鲍氏不动杆菌ATCC#19606

7.鲍氏不动杆菌，JMI收集菌株，参见表5

8.肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）ATCC#BAA-1705

9.肺炎克雷伯氏菌ATCC#700603

10.肺炎克雷伯氏菌，JMI收集菌株，参见表5

11.卡他莫拉菌ATCC#25238

12.卡他莫拉菌ATCC#49143

13.卡他莫拉菌，JMI收集菌株，参见表5

14.流感嗜血杆菌ATCC49247

15.流感嗜血杆菌（Rd1KW20）ATCC51907

16.流感嗜血杆菌Rd0894（AcrA-）

17.流感嗜血杆菌，JMI收集菌株，参见表5

18.绿脓假单胞菌PAO1

19.绿脓假单胞菌，JMI收集菌株，参见表5

20.奇异变形杆菌（Proteus mirabilis），JMI收集菌株，参见表5

21.阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae），JMI收集菌株，参见表5

22.嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）ATCC BAA-84

23.嗜麦芽窄食单胞菌ATCC13637

接种物制备：

1.使用BBL Prompt试剂盒，从在琼脂培养基上生长的培养物中挑选5个大的或10个小的充分分离的菌落，并且接种到随试剂盒来的1mL无菌盐水。

2.将孔涡旋～30秒，以给出～10⁸细胞/mL的悬浮液。实际密度可以通过将这种悬浮液的稀释物铺平板加以证实。

3.对于测试的化合物的每块平板，通过将0.15mL细胞转移到15mL（～10⁶细胞/mL）无菌肉汤（参见下文）内，将悬浮液1/100稀释，涡旋混合。如果测试化合物（>8种化合物）的超过1块平板，那么相应增加体积。

4.使用50μl细胞（～5x10⁴细胞），以接种含有50μl在肉汤中稀释的药物的每个微量滴定孔（参见下文）。

药物稀释、接种、MIC测定：

1.所有药物/化合物原液通常在100%DMSO中以12.8mg/mL浓度制备。

2.将药物/化合物原液在50μL DMSO中稀释至200x所需终浓度。如果MICs的起始浓度是8μg/mL终浓度，那么需要6.25μL原液+43.75μL DMSO。将每个200x原液置于新96孔微量滴定板的第1列的分开行中。

3.将25μL DMSO加入含有200x化合物原液的微量滴定板的所有行的第2-12列中，并且从第1列直到第11列连续稀释25μL，在每列后更换尖端。即，25μL化合物+25μL DMSO=2x稀释度。在系列结束时留下“无化合物”DMSO孔用于对照。

4.对于测试的每种菌株，使用Matrix移液管用50μL MHII肉汤制备两块微量滴定板。

5.在加入50μl细胞前，将0.5μL每个稀释度（w/Matrix自动移液器）转移至50μL培养基/微量滴定孔。在1/200稀释到培养基+细胞内后，化合物的通常起始浓度是8μg/mL-化合物浓度以2x步跨越微量滴定板的行降低。所有MICs一式两份完成。

6.所有孔用50μl稀释的细胞悬液（参见上文）接种至100μl的终体积。

7.在加入接种物后，用手动多道移液器充分混合每个孔；在相同微量滴定板中从药物的低到高浓度使用相同尖端。

8.平板在37℃温育至少18小时。

9.在18小时后用测试读数反射镜显现平板，并且当未观察到生长时（在孔中的光学澄清度），将MIC记录为药物的最低浓度。

方案#3：化合物使用琼脂稀释法的促旋酶MIC测定

材料：

培养皿60x15mm（Thermo Scientific目录#12567100）

离心管，15mL（Costar）

BBL Prompt Inoculation System（Fisher B26306）

具有细菌划线培养至单个菌落的琼脂平板，新鲜制备的

无菌DMSO

GasPak^TM温育容器（BD目录#260672）

GasPak^TMEZAnaerobe容器系统小袋（BD目录#260678）

GasPak^TMEZC02容器系统小袋（BD目录#260679）

GasPak^TMEZCampy容器系统小袋（BD目录#260680）

菌株：

1.难辨梭菌ATCC BAA-1382；

2.难辨梭菌，CMI收集菌株，参见表4

3.产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens），CMI收集菌株，参见表4

4.脆弱类杆菌（Bacteroides fragilis）和类杆菌属物种（Bacteroidesspp.），CMI收集菌株，参见表4

5.梭杆菌属物种（Fusobacterium spp.），CMI收集菌株，参见表4

6.消化链球菌属物种（Peptostreptococcus，spp.），CMI收集菌株，参见表4

7.普雷沃菌属物种（Prevotella spp.），CMI收集菌株，参见表4

8.淋病奈瑟球菌ATCC35541

9.淋病奈瑟球菌ATCC49226

10.淋病奈瑟球菌，JMI收集菌株，参见表4

11.脑膜炎奈瑟球菌，JMI收集菌株，参见表4

培养基制备和生长条件：

根据CLSI出版物‘M11-A7Methods for AntimicrobialSusceptibility Testing of Anaerobic Bacteria；批准标准—第七版（2007）’制备对于每个微生物物种推荐的生长培养基，除了淋病奈瑟球菌和脑膜炎奈瑟球菌外，关于其的培养基根据″M07-A8Methods forDilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that GrowAerobically；批准标准—第八版（2009）″进行制备。

平板倾倒：

1.制备如表1中所述的每种测试化合物的100x药物原液。使用15mL离心管，将100uL每种药物原液加入10mL熔化琼脂（在水浴中冷却至～55℃）。通过将管颠倒2-3x混合，随后倾入个别标记的60X15mm培养皿内。

2.常规测试浓度是：0.002ug/mL–16ug/mL（14块平板）。

3.倾倒4块无药物平板：2块作为阳性对照，2块作为需氧对照。

4.允许平板干燥。相同天使用或在RT贮存过夜或在4℃贮存最高达3天。

5.对于药物浓度和菌株放置相应标记平板。

需要维持厌氧环境的细胞的生长：

1.用厌氧菌执行的所有工作都尽可能快速地完成；在生物安全柜（即厌氧环境）中执行的工作在细胞回到厌氧培养室前小于30分钟内完成。

2.使用GasPak^TM培养室实现厌氧菌的温育。大型箱式培养室（VWR90003-636）需要2个厌氧小袋（VWR90003-642），而高圆柱体式培养室（VWR90003-602）仅需要1个小袋。

平板接种（在生物安全柜中执行）：

1.如上所述将每种菌株划线培养到个别琼脂平板上。温育所需时间和环境条件（即厌氧、微量需氧等）。

2.直接使用菌落悬浮法，以将菌环量的新鲜划线培养的细胞悬浮到～4mL0.9%NaCl₂内且涡旋。

3.将悬浮液调整至O.D.₆₀₀0.05（5x10e7cfu/mL）。涡旋混合。

4.将～0.2mL调整的混合培养物转移到96孔平板。当测试≤5种菌株时，所有菌株在单行中排列在一起。当测试>5种菌株时，将菌株转移到平板内，在单行中具有不超过5种菌株。这是对小平板拟合所必需的。

5.使用多道移液器，将来自制备的96孔平板的0.002mL每种菌株点在每块MIC测试平板上。这导致～1x10e5cfu/点。当测试难辨梭菌时，在生长时菌株群游，然而，在多道移液器点之间的距离足够远，使得游动细胞不损害测定法结果。

a.首先接种2块无药物平板，而另外2块无药物平板在MIC测试平板后最后接种。前者和后者充当生长和接种对照。在对于MIC平板所需的大气条件下温育来自每组无药物对照的一块平板，并且一组需氧以测试由需氧菌的污染。当与严格厌氧菌或微量需氧菌株一起工作时，需氧培养对于生长是阴性的。对于淋病奈瑟球菌可见一些生长。

6.允许接种物干燥（短至需要的时间），随后以合适数目的小袋倒置放置在GasPak中且温育。

7.奈瑟球菌属物种在37℃在5%CO₂环境中温育24小时。

MIC测定：

在正确温育时间后检查测试平板，并且与在阳性对照平板上生长的那种相比较，在其中在测试平板上的生长外观中出现显著减少的浓度阅读MIC终点。

表1：使用琼脂稀释法用于MIC测定的化合物稀释度

^*1,600ug/ml=64ul（10mg/ml原液）+336ul DMSO；400ul总体积以起始

^**将化合物在100%DMSO中溶解且稀释

方案4.用于分枝杆菌属物种的MIC测定程序

材料

圆底96孔微量滴定板（Costar3788）或相似的

薄膜平板密封（PerkinElmer，TopSeal-A#6005250或相似的）

具有0.2%甘油的Middlebrook7H10肉汤

具有0.2%甘油的Middlebrook7H10琼脂

Middlebrook OADC Enrichment

用于结核分枝杆菌的接种物制备：

1.使用贮存于-70℃制备的冷冻结核分枝杆菌原种。结核分枝杆菌在7H10肉汤+10%OADC中生长，随后以100Klett或5x10⁷cfu/ml的浓度冷冻，

2.通过取出1ml冷冻原种且将其加入19ml7H10肉汤+10%OADC（终浓度2.5x10⁶cfu/ml），制备1:20稀释度。

3.由这个稀释度，制备第二个1:20稀释度，取出1ml且将其加入19ml新鲜肉汤。这是加入96孔平板中的最终接种物。

用于堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和诺卡氏菌属物种的接种物制备：

1.使用制备的冷冻原种培养物或以10Klett或5x10⁷/ml浓度在7H10肉汤中生长的新鲜培养物。

2.通过取出1.0ml培养原种且将其加入19ml7H10肉汤（终浓度2.5x10⁶cfu/ml），制备1:20稀释度。

3.由这个稀释度，制备1:20稀释度，取出1ml且将其加入19ml新鲜肉汤（最终悬浮液）。

平板制备：

1.标记平板。

2.使用多道电动移液管，将50μl7H10肉汤+10%OADC加入用于MIC测定的所有孔。

3.制备待测试的药物的母液（例如1mg/ml浓度）。

4.将冷冻母液解冻且使用7H10肉汤+10%OADC稀释，以获得工作溶液4x测试的最大浓度（例如终浓度32μg/ml，测试的最高浓度是8μg/ml）。稀释度由母液制备。为了以1μg/ml的浓度起始，以4μg/ml制备药物，因此起始浓度是1μg/ml。取出25μl1mg/ml原液，且加入6.2ml肉汤。药物的所有稀释都在肉汤中完成。

5.将50μl4x工作溶液加入指定行的第一个孔中。对于待测试的所有化合物继续。使用多道电动移液管，混合4X且系列稀释化合物通过第11个孔。弃去剩余50μl。使用第12个孔作为阳性对照。

6.在37℃温育平板，结核分枝杆菌共～18天；鸟分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌共～7天；诺卡氏菌属和脓肿分枝杆菌共～4天；使用薄膜密封。

7.目测读数且记录结果。MIC记录为其中未观察到生长的药物的最低浓度（在孔中的光学澄清度）。

方案5.用于结核分枝杆菌血清转变MIC测定法的方案

材料与试剂：

Costar#3904黑色侧面、平底96孔微量滴定板

具有0.2%甘油的Middlebrook7H9肉汤（BD271310）

Middlebrook OADC Enrichment

胎牛血清

过氧化氢酶（Sigma C1345）

右旋糖

NaCl₂

BBL Prompt Inoculation System（Fisher b26306）

具有细菌划线培养至单个菌落的琼脂平板（具有0.2%甘油和OADC富集的Middlebrook7H11）

无菌DMSO

培养基制备：

1.对于血清转变的MICs，需要都具有7H9+0.2%甘油的基础的三种不同培养基。所有培养基和补充物都在MICs前进行灭菌是重要的。

2.制备下文所有培养基且如下一个部分中所述接种。使用每种培养基针对Mtb测试所有化合物。

a.7H9+0.2%甘油+10%OADC（“标准”MIC培养基）

b.7H9+0.2%甘油+2g/L右旋糖+0.85g/L NaCl+0.003g/L过氧化氢酶（0%FBS）。

c.与等体积的胎牛血清（50%FBS）组合的2x7H9+0.2%甘油+2g/L右旋糖+0.85g/L NaCl+0.003g/L过氧化氢酶。

接种物制备：

1.使用BBL Prompt，挑选5-10个充分分离的菌落，并且接种在试剂盒中到来的1ml无菌盐水。一般地，由于这种生物体在培养中的缓慢生长，平板当用于这种测定法时具有二到三周龄。

2.充分涡旋，随后在水浴中超声处理30秒，提供～10⁸细胞/ml的悬浮液。实际密度可以通过将这种悬浮液的稀释物铺平板加以证实。

3.通过1/200稀释BBL Prompt悬浮液（例如：将0.2ml细胞转移至40ml培养基）制备在三种培养基制剂各自中的培养物，以获得～10⁶细胞/ml的起始细胞密度。

4.使用100μl细胞（～5x10⁴细胞），以接种含有1μl在DMSO中的药物的每个微量滴定孔（参见下文）。

药物稀释、接种、MIC测定：

1.对照药物原液异烟肼和新生霉素在100%DMSO中以10mM制备，而环丙沙星和利福平分别在50%DMSO和100%DMSO中以1mM制备。制备的稀释度–将100μL母液分配到96孔平板的第一列内。通过将50μl从第1列转移到第2列中的50μl DMSO内，对于每种化合物跨越行制备11步、2倍连续稀释。继续将50μl从第2列转移直到第11列，同时在每列时混合且更换尖端。留下仅具有DMSO的第12列作为对照。

2.在加入100μl细胞前，将1μl每个稀释度转移到空的微量滴定孔内。在稀释到培养基+细胞内后，异烟肼和新生霉素的起始浓度是100μM；在稀释到培养基+细胞内后，环丙沙星和利福平的起始浓度是10μM。化合物浓度以2x步移动跨越微量滴定板的行降低。在三个培养基浓度各自时，所有MICs一式两份完成。

3.化合物的测试组一般以10mM和50μL体积。

4.使用多道移液管，取出来自主平板的每列的所有体积且转移到新96孔微量滴定板的第一列内。对于主平板上的每列化合物重复，转移到新96孔平板的第1列内。

5.如上文对于对照化合物所述的，使用DMSO作为稀释剂生成每种化合物的2倍、11点稀释度。在所有情况下，留下仅DMSO的第12列用于对照。一旦所有稀释都完成，就再次如对于对照化合物完成的，在加入100μl细胞前，将1μl每个稀释度转移到空的微量滴定孔内。

6.所有孔都用100μl稀释的细胞悬液（参见上文）接种。

7.在接种物加入后，通过轻轻拍打平板的侧面混合平板。

8.将平板在加湿的37℃培养室中温育9天。

9.在9天时，将25μl0.01%无菌刃天青加入每个孔中。在激发492nm、发射595nm处测量本底荧光，并且将平板送回培养箱另外24小时。

在24小时后，在激发492nm、发射595nm处测量每个孔的荧光。

通过给定化合物的抑制百分比如下计算：抑制百分比=100-（[孔荧光-平均本底荧光]/[DMSO对照-平均本底荧光]x100）。对于所有三个培养基条件，MICs评分为在给定培养基条件时抑制刃天青减少（‘%-抑制）信号≥70%的最低化合物浓度。

表2显示关于本发明的所选化合物的MIC测定法结果。

在表2以及后续表和实施例中，“化合物12”对应于1-乙基-3-[5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲，并且“化合物13”涉及化合物12的甲磺酸盐。类似地，“化合物23”对应于1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲，并且“化合物23A”涉及化合物23的甲磺酸盐。这些是与上文实施例中使用的用于鉴定所述化合物和盐相同的编号。

表2–所选化合物的MIC值

表3显示关于本发明的所选化合物的MIC90测定法结果。

表3–所选化合物对于革兰氏阳性、革兰氏阴性和厌氧病原体的实验对象组的MIC90值

表3A还显示关于本发明的所选化合物的MIC测定法结果。在表3A中，“化合物23A”对应于1-乙基-3-[6-氟-5-[2-（1-羟基-1-甲基-乙基）嘧啶-5-基]-7-[（2R）-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基]脲（23A）的甲磺酸盐。类似地，“化合物W”对应于（R）-2-（5-（2-（3-乙基脲基）-6-氟-7-（四氢呋喃-2-基）-1H-苯并[d]咪唑-5-基）嘧啶-2-基）丙基-2-基磷酸二钠（W）。这些是上文合成实施例中用于鉴定所述化合物的相同编号。

表3A–所选化合物的MIC值

¹美国典型培养物中心

²通过涡旋构建的

³Coli Genetic Stock Center

⁴所有tolC构建体是衍生自CAG12184（Coli Genetic Stock Center）的tolC::Tn10

在下表4中，术语“CMI”代表位于Wilsonville，Oregon的ClinicalMicrobiology Institute。

表4用于生成MIC90数据的厌氧生物体的实验对象组

CMI#生物体A2380脆弱类杆菌A2381脆弱类杆菌A2382脆弱类杆菌A2486脆弱类杆菌A2487脆弱类杆菌A2489脆弱类杆菌A2527脆弱类杆菌A2529脆弱类杆菌A2562脆弱类杆菌A2627脆弱类杆菌A2802脆弱类杆菌A2803脆弱类杆菌A2804脆弱类杆菌A2805脆弱类杆菌A2806脆弱类杆菌A2807脆弱类杆菌A2808脆弱类杆菌A2809脆弱类杆菌A2810脆弱类杆菌A2811脆弱类杆菌A2812脆弱类杆菌A2813脆弱类杆菌

CMI#生物体A2814脆弱类杆菌A2460多形类杆菌（B.thetaiotaomicron）A2462多形类杆菌A2463多形类杆菌A2464多形类杆菌A2536多形类杆菌A2591单形类杆菌（B.uniformis）A2604普通类杆菌（B.vulgatus）A2606普通类杆菌A2613卵圆类杆菌（B.ovatus）A2616卵圆类杆菌A2815隐蔽类杆菌（Bacteroides tectum）A2816解脲类杆菌（B.ureolyticus）A2817多毛类杆菌（Bacteroides capillosus）A2818解脲类杆菌A2824Parabacter distasonisA2825卵圆类杆菌A2826单形类杆菌A2827单形类杆菌A2828普通类杆菌A2829普通类杆菌A2830卵圆类杆菌A2831多形类杆菌A2832Parabacter distasonisA2833多形类杆菌A2767难辨梭菌A2768难辨梭菌A2769难辨梭菌A2770难辨梭菌A2771难辨梭菌A2772难辨梭菌A2773难辨梭菌A2774难辨梭菌A2775难辨梭菌A2776难辨梭菌A2777难辨梭菌A2778难辨梭菌

CMI#生物体A2779难辨梭菌A2780难辨梭菌A2140产气荚膜梭菌A2203产气荚膜梭菌A2204产气荚膜梭菌A2227产气荚膜梭菌A2228产气荚膜梭菌A2229产气荚膜梭菌A2315产气荚膜梭菌A2332产气荚膜梭菌A2333产气荚膜梭菌A2334产气荚膜梭菌A2389产气荚膜梭菌A2390产气荚膜梭菌A864坏死梭杆菌（F.necrophorum）A871核梭杆菌（F.nucleatum）A1667坏死梭杆菌A1666坏死梭杆菌A2249核梭杆菌A2716梭杆菌属物种A2717梭杆菌属物种A2719梭杆菌属物种A2721梭杆菌属物种A2722梭杆菌属物种A2710梭杆菌属物种A2711梭杆菌属物种A2712梭杆菌属物种A2713梭杆菌属物种A2714梭杆菌属物种A2715梭杆菌属物种A1594厌氧消化链球菌（Peptostreptococcus anaerobius）A2158大消化链球菌（Peptostreptococcus magnus）A2168厌氧消化链球菌A2170大消化链球菌A2171大消化链球菌A2575消化链球菌属物种A2579不解糖消化链球菌（Peptostreptococcus asaccharolyticus）

CMI#生物体A2580不解糖消化链球菌A2614不解糖消化链球菌A2620不解糖消化链球菌A2629消化链球菌属物种A2739栖牙普雷沃菌（Prevotella denticola）A2752二路普雷沃菌（Prevotella bivia）A2753中间普雷沃菌（Prevotella intermedia）A2754中间普雷沃菌A2756二路普雷沃菌A2759二路普雷沃菌A2760栖牙普雷沃菌A2761中间普雷沃菌A2762产黑普雷沃菌（Prevotella melaninogenica）A2765产黑普雷沃菌A2766产黑普雷沃菌A2821二路普雷沃菌A2822二路普雷沃菌QCBF脆弱类杆菌QCBT多形类杆菌QCCD难辨梭菌QCBF脆弱类杆菌QCBT多形类杆菌QCCD难辨梭菌

在下表5中，术语“JMI”代表位于North Liberty，Iowa的JonesMicrobiology Institute。

表5：用于生成MIC90数据的革兰氏阳性和革兰氏阴性生物体的实验对象组

JMI分离物#JMI生物体编码生物体394ACB鲍氏不动杆菌2166ACB鲍氏不动杆菌3060ACB鲍氏不动杆菌3170ACB鲍氏不动杆菌9328ACB鲍氏不动杆菌9922ACB鲍氏不动杆菌13618ACB鲍氏不动杆菌14308ACB鲍氏不动杆菌

JMI分离物#JMI生物体编码生物体17086ACB鲍氏不动杆菌17176ACB鲍氏不动杆菌30554ACB鲍氏不动杆菌32007ACB鲍氏不动杆菌1192ECL阴沟肠杆菌3096ECL阴沟肠杆菌5534ECL阴沟肠杆菌6487ECL阴沟肠杆菌9592ECL阴沟肠杆菌11680ECL阴沟肠杆菌12573ECL阴沟肠杆菌12735ECL阴沟肠杆菌13057ECL阴沟肠杆菌18048ECL阴沟肠杆菌25173ECL阴沟肠杆菌29443ECL阴沟肠杆菌44EF粪肠球菌355EF粪肠球菌886EF粪肠球菌955EF粪肠球菌1000EF粪肠球菌1053EF粪肠球菌1142EF粪肠球菌1325EF粪肠球菌1446EF粪肠球菌2014EF粪肠球菌2103EF粪肠球菌2255EF粪肠球菌2978EF粪肠球菌2986EF粪肠球菌5027EF粪肠球菌5270EF粪肠球菌5874EF粪肠球菌7430EF粪肠球菌7904EF粪肠球菌8092EF粪肠球菌8691EF粪肠球菌

JMI分离物#JMI生物体编码生物体9090EF粪肠球菌10795EF粪肠球菌14104EF粪肠球菌16481EF粪肠球菌18217EF粪肠球菌22442EF粪肠球菌25726EF粪肠球菌26143EF粪肠球菌28131EF粪肠球菌29765EF粪肠球菌30279EF粪肠球菌31234EF粪肠球菌31673EF粪肠球菌115EFM屎肠球菌227EFM屎肠球菌414EFM屎肠球菌712EFM屎肠球菌870EFM屎肠球菌911EFM屎肠球菌2356EFM屎肠球菌2364EFM屎肠球菌2762EFM屎肠球菌3062EFM屎肠球菌4464EFM屎肠球菌4473EFM屎肠球菌4653EFM屎肠球菌4679EFM屎肠球菌6803EFM屎肠球菌6836EFM屎肠球菌8280EFM屎肠球菌8702EFM屎肠球菌9855EFM屎肠球菌10766EFM屎肠球菌12799EFM屎肠球菌13556EFM屎肠球菌13783EFM屎肠球菌14687EFM屎肠球菌

JMI分离物#JMI生物体编码生物体15268EFM屎肠球菌15525EFM屎肠球菌15538EFM屎肠球菌18102EFM屎肠球菌18306EFM屎肠球菌19967EFM屎肠球菌22428EFM屎肠球菌23482EFM屎肠球菌29658EFM屎肠球菌597EC大肠杆菌847EC大肠杆菌1451EC大肠杆菌8682EC大肠杆菌11199EC大肠杆菌12583EC大肠杆菌12792EC大肠杆菌13265EC大肠杆菌14594EC大肠杆菌22148EC大肠杆菌29743EC大肠杆菌30426EC大肠杆菌470BSAA群链球菌2965BSAA群链球菌3112BSAA群链球菌3637BSAA群链球菌4393BSAA群链球菌4546BSAA群链球菌4615BSAA群链球菌5848BSAA群链球菌6194BSAA群链球菌8816BSAA群链球菌11814BSAA群链球菌16977BSAA群链球菌18083BSAA群链球菌18821BSAA群链球菌25178BSAA群链球菌30704BSAA群链球菌

JMI分离物#JMI生物体编码生物体12BSBB群链球菌10366BSBB群链球菌10611BSBB群链球菌16786BSBB群链球菌18833BSBB群链球菌30225BSBB群链球菌10422BSCC群链球菌14209BSCC群链球菌29732BSCC群链球菌8544BSGG群链球菌18086BSGG群链球菌29815BSGG群链球菌147HI流感嗜血杆菌180HI流感嗜血杆菌934HI流感嗜血杆菌970HI流感嗜血杆菌1298HI流感嗜血杆菌1819HI流感嗜血杆菌1915HI流感嗜血杆菌2000HI流感嗜血杆菌2562HI流感嗜血杆菌2821HI流感嗜血杆菌3133HI流感嗜血杆菌3140HI流感嗜血杆菌3497HI流感嗜血杆菌3508HI流感嗜血杆菌3535HI流感嗜血杆菌4082HI流感嗜血杆菌4108HI流感嗜血杆菌4422HI流感嗜血杆菌4868HI流感嗜血杆菌4872HI流感嗜血杆菌5858HI流感嗜血杆菌6258HI流感嗜血杆菌6875HI流感嗜血杆菌7063HI流感嗜血杆菌7600HI流感嗜血杆菌

JMI分离物#JMI生物体编码生物体8465HI流感嗜血杆菌10280HI流感嗜血杆菌10732HI流感嗜血杆菌10850HI流感嗜血杆菌11366HI流感嗜血杆菌11716HI流感嗜血杆菌11724HI流感嗜血杆菌11908HI流感嗜血杆菌12093HI流感嗜血杆菌12107HI流感嗜血杆菌13424HI流感嗜血杆菌13439HI流感嗜血杆菌13672HI流感嗜血杆菌13687HI流感嗜血杆菌13792HI流感嗜血杆菌13793HI流感嗜血杆菌14440HI流感嗜血杆菌15351HI流感嗜血杆菌15356HI流感嗜血杆菌15678HI流感嗜血杆菌15800HI流感嗜血杆菌17841HI流感嗜血杆菌18614HI流感嗜血杆菌25195HI流感嗜血杆菌27021HI流感嗜血杆菌28326HI流感嗜血杆菌28332HI流感嗜血杆菌29918HI流感嗜血杆菌29923HI流感嗜血杆菌31911HI流感嗜血杆菌428KPN肺炎克雷伯氏菌791KPN肺炎克雷伯氏菌836KPN肺炎克雷伯氏菌1422KPN肺炎克雷伯氏菌1674KPN肺炎克雷伯氏菌1883KPN肺炎克雷伯氏菌6486KPN肺炎克雷伯氏菌

JMI分离物#JMI生物体编码生物体8789KPN肺炎克雷伯氏菌10705KPN肺炎克雷伯氏菌11123KPN肺炎克雷伯氏菌28148KPN肺炎克雷伯氏菌29432KPN肺炎克雷伯氏菌937MCAT粘膜炎莫拉菌1290MCAT粘膜炎莫拉菌1830MCAT粘膜炎莫拉菌1903MCAT粘膜炎莫拉菌4346MCAT粘膜炎莫拉菌4880MCAT粘膜炎莫拉菌6241MCAT粘膜炎莫拉菌6551MCAT粘膜炎莫拉菌7074MCAT粘膜炎莫拉菌7259MCAT粘膜炎莫拉菌7544MCAT粘膜炎莫拉菌8142MCAT粘膜炎莫拉菌8451MCAT粘膜炎莫拉菌9246MCAT粘膜炎莫拉菌9996MCAT粘膜炎莫拉菌12158MCAT粘膜炎莫拉菌13443MCAT粘膜炎莫拉菌13692MCAT粘膜炎莫拉菌13817MCAT粘膜炎莫拉菌14431MCAT粘膜炎莫拉菌14762MCAT粘膜炎莫拉菌14842MCAT粘膜炎莫拉菌15361MCAT粘膜炎莫拉菌15741MCAT粘膜炎莫拉菌17843MCAT粘膜炎莫拉菌18639MCAT粘膜炎莫拉菌241GC淋病奈瑟球菌291GC淋病奈瑟球菌293GC淋病奈瑟球菌344GC淋病奈瑟球菌451GC淋病奈瑟球菌474GC淋病奈瑟球菌

JMI分离物#JMI生物体编码生物体491GC淋病奈瑟球菌493GC淋病奈瑟球菌503GC淋病奈瑟球菌521GC淋病奈瑟球菌552GC淋病奈瑟球菌573GC淋病奈瑟球菌592GC淋病奈瑟球菌25NM脑膜炎奈瑟球菌813NM脑膜炎奈瑟球菌1725NM脑膜炎奈瑟球菌2747NM脑膜炎奈瑟球菌3201NM脑膜炎奈瑟球菌3335NM脑膜炎奈瑟球菌7053NM脑膜炎奈瑟球菌9407NM脑膜炎奈瑟球菌10447NM脑膜炎奈瑟球菌12685NM脑膜炎奈瑟球菌12841NM脑膜炎奈瑟球菌14038NM脑膜炎奈瑟球菌1127PM奇异变形杆菌3049PM奇异变形杆菌4471PM奇异变形杆菌8793PM奇异变形杆菌10702PM奇异变形杆菌11218PM奇异变形杆菌14662PM奇异变形杆菌17072PM奇异变形杆菌19059PM奇异变形杆菌23367PM奇异变形杆菌29819PM奇异变形杆菌31419PM奇异变形杆菌1881PSA铜绿假单胞菌5061PSA铜绿假单胞菌7909PSA铜绿假单胞菌8713PSA铜绿假单胞菌14318PSA铜绿假单胞菌14772PSA铜绿假单胞菌

JMI分离物#JMI生物体编码生物体15512PSA铜绿假单胞菌17093PSA铜绿假单胞菌17802PSA铜绿假单胞菌19661PSA铜绿假单胞菌29967PSA铜绿假单胞菌31539PSA铜绿假单胞菌82SA金黄色葡萄球菌99SA金黄色葡萄球菌138SA金黄色葡萄球菌139SA金黄色葡萄球菌140SA金黄色葡萄球菌141SA金黄色葡萄球菌142SA金黄色葡萄球菌272SA金黄色葡萄球菌287SA金黄色葡萄球菌354SA金黄色葡萄球菌382SA金黄色葡萄球菌1112SA金黄色葡萄球菌1687SA金黄色葡萄球菌1848SA金黄色葡萄球菌2031SA金黄色葡萄球菌2159SA金黄色葡萄球菌2645SA金黄色葡萄球菌3256SA金黄色葡萄球菌3276SA金黄色葡萄球菌4044SA金黄色葡萄球菌4214SA金黄色葡萄球菌4217SA金黄色葡萄球菌4220SA金黄色葡萄球菌4231SA金黄色葡萄球菌4240SA金黄色葡萄球菌4262SA金黄色葡萄球菌4370SA金黄色葡萄球菌4665SA金黄色葡萄球菌4666SA金黄色葡萄球菌4667SA金黄色葡萄球菌5026SA金黄色葡萄球菌

JMI分离物#JMI生物体编码生物体5666SA金黄色葡萄球菌6792SA金黄色葡萄球菌7023SA金黄色葡萄球菌7461SA金黄色葡萄球菌7899SA金黄色葡萄球菌7901SA金黄色葡萄球菌8714SA金黄色葡萄球菌9374SA金黄色葡萄球菌9437SA金黄色葡萄球菌10056SA金黄色葡萄球菌10110SA金黄色葡萄球菌11379SA金黄色葡萄球菌11629SA金黄色葡萄球菌11659SA金黄色葡萄球菌12788SA金黄色葡萄球菌12789SA金黄色葡萄球菌13043SA金黄色葡萄球菌13086SA金黄色葡萄球菌13721SA金黄色葡萄球菌13742SA金黄色葡萄球菌13932SA金黄色葡萄球菌14210SA金黄色葡萄球菌14384SA金黄色葡萄球菌15428SA金黄色葡萄球菌15430SA金黄色葡萄球菌17721SA金黄色葡萄球菌18688SA金黄色葡萄球菌19095SA金黄色葡萄球菌20195SA金黄色葡萄球菌22141SA金黄色葡萄球菌22689SA金黄色葡萄球菌27398SA金黄色葡萄球菌29048SA金黄色葡萄球菌29051SA金黄色葡萄球菌30491SA金黄色葡萄球菌30538SA金黄色葡萄球菌25SEPI表皮葡萄球菌

JMI分离物#JMI生物体编码生物体53SEPI表皮葡萄球菌385SEPI表皮葡萄球菌398SEPI表皮葡萄球菌701SEPI表皮葡萄球菌713SEPI表皮葡萄球菌1381SEPI表皮葡萄球菌2174SEPI表皮葡萄球菌2286SEPI表皮葡萄球菌2969SEPI表皮葡萄球菌3417SEPI表皮葡萄球菌3447SEPI表皮葡萄球菌4753SEPI表皮葡萄球菌7241SEPI表皮葡萄球菌9366SEPI表皮葡萄球菌10665SEPI表皮葡萄球菌11792SEPI表皮葡萄球菌12311SEPI表皮葡萄球菌13036SEPI表皮葡萄球菌13227SEPI表皮葡萄球菌13243SEPI表皮葡萄球菌13621SEPI表皮葡萄球菌13638SEPI表皮葡萄球菌13800SEPI表皮葡萄球菌14078SEPI表皮葡萄球菌14392SEPI表皮葡萄球菌15007SEPI表皮葡萄球菌16733SEPI表皮葡萄球菌18871SEPI表皮葡萄球菌23285SEPI表皮葡萄球菌27805SEPI表皮葡萄球菌29679SEPI表皮葡萄球菌29985SEPI表皮葡萄球菌30259SEPI表皮葡萄球菌31444SEPI表皮葡萄球菌268SPN肺炎链球菌1264SPN肺炎链球菌2482SPN肺炎链球菌

JMI分离物#JMI生物体编码生物体2653SPN肺炎链球菌2994SPN肺炎链球菌3123SPN肺炎链球菌3124SPN肺炎链球菌4336SPN肺炎链球菌4858SPN肺炎链球菌5606SPN肺炎链球菌5881SPN肺炎链球菌5897SPN肺炎链球菌5900SPN肺炎链球菌6051SPN肺炎链球菌6216SPN肺炎链球菌6556SPN肺炎链球菌7270SPN肺炎链球菌7584SPN肺炎链球菌8479SPN肺炎链球菌8501SPN肺炎链球菌9256SPN肺炎链球菌9257SPN肺炎链球菌10246SPN肺炎链球菌10467SPN肺炎链球菌10886SPN肺炎链球菌11217SPN肺炎链球菌11228SPN肺炎链球菌11238SPN肺炎链球菌11757SPN肺炎链球菌11768SPN肺炎链球菌12121SPN肺炎链球菌12124SPN肺炎链球菌12149SPN肺炎链球菌12767SPN肺炎链球菌12988SPN肺炎链球菌13321SPN肺炎链球菌13393SPN肺炎链球菌13521SPN肺炎链球菌13544SPN肺炎链球菌13700SPN肺炎链球菌

JMI分离物#JMI生物体编码生物体13704SPN肺炎链球菌13822SPN肺炎链球菌13838SPN肺炎链球菌14131SPN肺炎链球菌14413SPN肺炎链球菌14744SPN肺炎链球菌14808SPN肺炎链球菌14827SPN肺炎链球菌14835SPN肺炎链球菌14836SPN肺炎链球菌15832SPN肺炎链球菌17336SPN肺炎链球菌17343SPN肺炎链球菌17349SPN肺炎链球菌17735SPN肺炎链球菌18060SPN肺炎链球菌18567SPN肺炎链球菌18595SPN肺炎链球菌19082SPN肺炎链球菌19826SPN肺炎链球菌22174SPN肺炎链球菌22175SPN肺炎链球菌27003SPN肺炎链球菌28310SPN肺炎链球菌28312SPN肺炎链球菌29890SPN肺炎链球菌29910SPN肺炎链球菌

实施例32

小鼠金黄色葡萄球菌肾感染模型

动物：雌性CD-1小鼠（8–10周龄；6/组）得自Charles RiverLaboratories，并且依照实验动物护理与使用指南（Guide to the Careand Use of Experimental Animals）进行饲养且维持。

细菌菌株和原种

甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA）菌株ATCC29213得自美国典型培养物中心。为了制备原种用于动物研究，将金黄色葡萄球菌在Mueller Hinton琼脂平板上铺平板，并且在37℃温育过夜。来自平板的3-4个菌落用于接种5mL Mueller Hinton Broth（MHB），其伴随以300RPM的振荡在37℃温育8小时。将5mL8小时培养物20倍稀释到100mL内且温育过夜（12-14小时）。以3000x使细菌形成团块20分钟，并且用含有0.5%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次。将在PBS/20%甘油中含有～1x10¹⁰cfu的等分试样（1mL）冷冻且贮存于-80℃直至使用当天。通过系列稀释且在MuellerHinton琼脂平板上铺平板证实原种滴度。

小鼠金黄色葡萄球菌肾感染模型

在接种前，将细菌原种解冻且用PBS/BSA洗涤一次。随后用PBS/BSA稀释原种至1x10⁹cfu/mL的终浓度，以给出在100uL体积中约1-2x10⁸cfu/小鼠的接种物。发现这种接种物在预实验中是最佳的，所述预实验利用10⁶–10⁹金黄色葡萄球菌生物体/小鼠的攻击剂量，以在感染后26小时建立～10⁶cfu/肾负荷而无死亡率（数据未显示）。在这些初步研究中，用以小于10⁷cfu/小鼠的金黄色葡萄球菌的攻击诱导不相容感染或无慢性感染，而10⁹cfu/小鼠的剂量导致在高百分比的小鼠中的快速病和死亡率。注射使用无菌30计量针经由尾静脉静脉内给予。在小鼠感染完成后，将用于攻击小鼠的细菌原种铺平板且计数，以验证接种物的浓度。

为了评价在感染后所示时间（最通常2–26小时）的细菌负荷，对小鼠实施安乐死且无菌收获肾，并且置于无菌PBS/BSA（5mL/对肾）内。使用手提式匀浆器（Powergen125；Fisher Scientific），将肾在无菌条件下匀浆化。在收集和匀浆化过程中，所有样品都保持在冰上，并且匀浆器在每个样品之间充分洗涤且灭菌。匀浆物在无菌PBS/BSA中系列稀释且在MH琼脂上铺平板，以测定细菌计数/对肾。

CD-1小鼠（6只/组）用金黄色葡萄球菌（ATCC29213）以2x10⁸cfu/小鼠IV攻击。攻击后两小时，经由经口管饲法用以10ml/kg的媒介物（10%VitE TPGS）或以10、30、100mg/kg的化合物23A处理小鼠。30分钟和6小时处理组处理一次，而24小时组在第一个给药后10小时接受第二次处理。在处理后增加量的时间后（30分钟、6小时或24小时），对小鼠实施安乐死，并且收获肾，匀浆化且铺平板，以定量金黄色葡萄球菌负荷。计算来自每只小鼠的肾对的负荷和关于每组小鼠的中值。

结果：经口施用的化合物23A显示出针对实验诱导的肾MSSA（SA29213）感染的体内功效。在最初处理后30分钟时，在化合物和媒介物处理的小鼠之间的肾负荷中不存在差异。30分钟媒介物处理的组充当用于比较在以后时间点的化合物效应的早期对照。在第一个给药后6小时，所有化合物处理与时间匹配的媒介物对照相比较使肾中的细菌负荷减少0.4-0.6对数。另外，以30和100mg/kg施用的化合物23A提供与30分钟早期对照相比较的0.3-0.4对数减少。

在24小时处理期（其包括在10小时施用的第二个处理剂量）后，对于所有处理组观察到与时间匹配的媒介物对照比较的细菌密度中的降低。以30和100mg/kg BID施用的化合物23A提供2.8-2.9对数减少，而10mg/kg化合物23A BID更可变且提供与24小时媒介物处理的对照相比较的1.8对数减少。此外，以30和100mg/kg施用的化合物23A显示与30分钟早期对照相比较的1.5对数减少，指示细菌活性。

总之和如上表6中所示，在6小时和24小时评价时间，与30分钟对照组相比较，30和100mg/kg化合物23A的BID给药减少甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA）菌株ATCC29213的细菌生长，而用10mg/kg化合物23A处理限制在6小时的细菌生长，但比在24小时的其他处理组更不有效。

CD-1小鼠（6只/组）用金黄色葡萄球菌（ATCC29213）以2x10⁸cfu/小鼠IV攻击。在2小时后，对单组小鼠（早期对照（EC））实施安乐死，并且收获肾，匀浆化且铺平板，以定量金黄色葡萄球菌负荷。经由经口管饲法用以10ml/kg的媒介物（10%VitE TPGS；晚期对照，LC），以10、30、60、100mg/kg的化合物23A处理另外组的受感染小鼠。在24小时后，对处理小鼠组实施安乐死，并且收获肾，匀浆化且铺平板，以定量金黄色葡萄球菌负荷。概括来自每只小鼠的肾对的负荷和关于每组小鼠的中值。

结果：总之和如上表7中所示，单个经口剂量的化合物23A显示出针对实验诱导的肾MSSA（SA29213）感染的体内功效。在24小时后，所有处理都显示与时间匹配的媒介物对照比较的细菌密度中的降低。当以10、30、60或100mg/kg施用时，化合物23A证实与媒介物对照相比较的1.9、2.3、3.1和3.3对数减少的剂量依赖性减少。此外，60和100mg/kg化合物23A的剂量与早期对照相比较使细菌负荷减少1.2-1.4对数，暗示化合物23A具有细菌活性。

CD-1小鼠（8只/组）用金黄色葡萄球菌（ATCC29213）以2x10⁸cfu/小鼠IV攻击。在2小时后，对单组小鼠（早期对照（EC））实施安乐死，并且收获肾，匀浆化且铺平板，以定量金黄色葡萄球菌负荷。经由经口管饲法用以10ml/kg的媒介物（水；晚期对照，LC）处理另外组的受感染小鼠，化合物W以16、49、99或166mg/kg额定剂量水平施用，其预期递送10、30、60、100mg/kg的化合物23A，在完全转换后以10、30、60、100mg/kg的活性部分剂量当量。在24小时后，对处理小鼠组实施安乐死，并且收获肾，匀浆化且铺平板，以定量金黄色葡萄球菌负荷。概括来自每只小鼠的肾对的负荷和关于每组小鼠的中值。

结果：总之和如上表8中所示，单个经口剂量的化合物W显示出针对实验诱导的肾MSSA（SA29213）感染的体内功效。在24小时后，所有处理都显示与时间匹配的媒介物对照比较的细菌密度中的降低。当以16、49、99和166mg/kg施用（其提供10、30、60或100mg/kg化合物24的等价暴露）时，化合物W证实与媒介物对照相比较的1.9、2.3、2.7、2.6和3.0对数减少的剂量依赖性减少。此外，16、49、99和166mg/kg化合物W的剂量与早期对照相比较使细菌负荷减少0.7-1.5对数，暗示化合物23A具有细菌活性。

实施例33

嗜中性粒细胞减少症大鼠大腿感染模型

动物：称重在76-100克之间的特定无热原、雄性Sprague Dawley大鼠得自Charles River Laboratories，Inc.（Wilmington，MA）且用于这个实验中。在研究开始前允许动物适应最少七（7）天。

细菌：甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA）ATCC菌株29213用于体内实验。将测试分离物两次传代培养到标准微生物琼脂培养基（具有5%绵羊血液的胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂）上。第二次转移在大腿感染模型接种物制备中使用前小于24小时进行。

嗜中性粒细胞减少症大鼠大腿感染模型：为了诱导嗜中性粒细胞减少症，在感染前三天，用通过腹膜内注射（IP）在1ml中施用的以150mg/kg的免疫抑制剂环磷酰胺处理大鼠。用在生理盐水中的10⁷cfu/甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌29213悬浮液通过肌内（IM）0.2ml注射到两只后大腿内感染大鼠。在增加量的时间后（2-26小时），收获每只动物的两只后大腿，用无菌盐水冲洗，称重，随后置于50ml无菌生理盐水中并且置于湿冰上直至匀浆化时。约一半总匀浆化的样品体积经过大孔滤器（以去除软骨和大的成群组织片），在盐水中稀释且在琼脂培养基平板（具有5%绵羊血液的胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂）上培养。所有培养平板在约37℃温育18-24小时。计数菌落形成单位（以cfu/ml匀浆物），并且计数关于每个处理和对照组的中值。一般地，每个组具有n=6；每只大腿视为不连续数。中值cfu/ml/组与在2小时（早期对照）的最初细菌密度或同时收获的时间匹配的媒介物对照组（晚期对照；LC）组的那种比较。

表8.化合物23A证实在嗜中性粒细胞减少症大鼠中金黄色葡萄球菌大腿负荷中的剂量相关和时间依赖性减

少

嗜中性粒细胞减少症大鼠（3只/组）用金黄色葡萄球菌（ATCC29213）以～2x10⁶cfu/大腿通过肌内（IM）攻击进行感染。在2小时后，对单组大鼠（早期对照（EC）实施安乐死，并且收获大腿，匀浆化且铺平板，以定量金黄色葡萄球菌负荷。经由经口管饲法用以10ml/kg的媒介物（20%Cavitron/1%HPMCAS-MG；晚期对照，LC）或以10、30、60mg/kg的化合物23A处理另外的受感染大鼠。8小时处理组接受单次处理（QD），并且实施安乐死，且在处理（QD）后8小时收获大腿用于cfu测定，而24小时处理组接受相隔12小时的2个剂量（q12h），并且实施安乐死，且在处理后24小时收获大腿。测定来自每只个别大腿的负荷并且概括来自3只大鼠组的cfu/ml和中值。

结果：如上表8中所示，经口施用的化合物23A显示出针对MSSA（SA29213）的体内功效。在第一个给药后8小时，所有组与时间匹配的对照比较都具有负荷中的减少，关于以10mg/kg的化合物23A的～1.3对数减少，以及关于以30和60mg/kg的化合物23A的～2对数减少。与早期对照比较，以10mg/kg的化合物23A使SA29213的细菌生长保持至至少停滞点，而以60和100mg/kg的化合物23A使细菌负荷轻微降低～0.5-0.6对数。

在24小时和在12小时施用的第二个处理给药后，对于所有处理组观察到与晚期对照比较的细菌密度中～2.4-2.8对数的降低。与早期对照比较，对于以10mg/kg的化合物23A观察到约0.8对数减少，而以30和60mg/kg的化合物23A提供～1.1-1.2对数减少。

嗜中性粒细胞减少症大鼠（3只/组）用金黄色葡萄球菌（ATCC29213）以～2x10⁶cfu/大腿通过肌内（IM）攻击进行感染。在2小时后，对单组大鼠（早期对照（EC））实施安乐死，并且收获大腿，匀浆化且铺平板，以定量金黄色葡萄球菌负荷。经由经口管饲法用以10ml/kg的媒介物（10%维生素E/TPGS；晚期对照，LC）或以30、60、100mg/kg的化合物13处理另外的受感染大鼠。8小时处理组接受单次处理（QD），并且实施安乐死，且在处理（QD）后8小时收获大腿用于cfu测定，而24小时处理组接受相隔12小时的2个剂量（q12h），并且实施安乐死，且在处理后24小时收获大腿。测定来自每只个别大腿的负荷，并且对于每个组概括来自3只大鼠组的cfu/个别大腿和中值。

结果：如上表9中所示，经口施用的化合物13显示出针对MSSA（SA29213）的体内功效。在三个处理组之间可见抗菌活性程度中的差异。在第一个给药后8小时，所有组与时间匹配的对照比较都具有负荷中的减少，关于以10mg/kg的化合物13的～1.5对数减少，以及关于以60和100mg/kg的化合物13的～1.7和1.8对数减少。在第一个给药后8小时，以10mg/kg的化合物13使SA29213的细菌生长保持至至少停滞点，而以60和100mg/kg的化合物13与早期对照相比较使细菌负荷分别轻微降低～0.4和～0.5对数。在24小时和在12小时施用的第二个处理给药后，通过以60和100mg/kg的化合物13显示出与早期对照比较细菌密度中约1对数的降低。相比之下，以30mg/kg施用的化合物13看起来不是有效的，其中可变cfu水平平均大于早期对照0.3对数。然而，所有剂量水平与晚期对照比较降低细菌密度。对于10mg/kg处理组观察到约～1.1对数的减少，而对于60和100mg/kg剂量水平观察到2.85和～3对数的减少。

总之，在8小时和24小时评价时间，与最初对照组相比较，60和100mg/kg化合物13的q12h剂量减少SA29213的细菌生长，而用30mg/kg处理限制在8小时的细菌生长，但比在24小时的其他处理组更不有效。

实施例34

在大鼠中的七天经口（管饲法）毒性和毒理动力学

这个研究的目的是：1）评估当通过管饲法经口施用于雄性大鼠连续7天时，化合物13和化合物23A的潜在毒性，和2）评价在第一个和第七个给药后化合物13和化合物23A的毒理动力学。

动物

物种、来源、历史和论证

Crl:CD（SD）大鼠得自Charles River Laboratories of StoneRidge，NY。动物进行实验室育种且在实验上是首次用于实验的。选择大鼠是因为它们是通常用于非临床毒性评估的物种。

数目、性别、年龄和体重范围

定购四十只大鼠（20只未插套管的雄性和20只具有颈静脉插管的雄性）。从这些动物中，使用15只未插套管的雄性和15只插套管的雄性）。动物在年龄中是尽可能一致的。大鼠是青春期前至年幼成体，在给药开始时约9周龄。它们的供应商计算的出生日期保留在研究记录中。在分配至组时动物的重量范围是218.5-306.3g。

研究设计

大鼠如下表10中所示指定。动物通过经口管饲法接受测试物品或媒介物连续7天，并且在给药完成后当天终止。给药第一天指定为研究第1天。动物如下所述评估临床体征、体重和其他参数中的变化。

表10–组分配和剂量水平

途径/剂量

对于组A和组B-D，媒介物和测试物品分别通过经口管饲法以10mL/kg体重的剂量体积每天施用一次，连续7天。对于组E和组F，测试物品和媒介物分别通过经口管饲法以10mL/kg体重的剂量体积每天施用两次，相隔约8小时，连续7天。计算施用于每只动物的实际体积并且基于每只动物的最近体重进行调整。

生活（In-Life）观察和测量

观察

研究自始至终，就活力观察动物至少早上一次和中午一次，相隔至少4小时。在处理期过程中，作出每天笼边观察且在给药前和给药后（仅在第一个给药后）记录。基于对于来自先前研究的两种化合物的C_max/T_max，在下述时间发生的处理过程中作出给药后观察：

对于组A-F给药后1小时。

在尸检当天时作出一次笼边观察。

未排定的观察

在未排定的观察上或在Provantis中记录在除了已排定的观察时间外的时间观察到的任何发现；然而，研究自始至终未观察到异常。Provantis是本领域通常使用的电子数据收集、管理和报告系统。

体重

在给药开始前，在第1天时对于随机化测量体重。在处理过程中，在第1天和第7天时测量体重。此外，在尸检前测量空腹体重用于计算器官/体重比。

食物消耗

研究自始至终，在给药开始前3天开始每天测量食物消耗。

临床病理学评估

在尸检前从眼窝丛（在CO₂/O₂麻醉下，对于主研究动物）或颈静脉插管（对于毒理动力学动物）中从所有动物中收集血液样品，用于评估血液学、凝固和血清化学参数。由于用于保持插管对于毒理动力学动物开放的残留肝素，不能分析来自这些大鼠的凝固样品。动物在血液收集前禁食过夜。在用于临床病理学分析的血液收集当天时，动物直到血液收集后并且样品通过临床病理学组判断为可接受的才进行尸检。

血液学

将合适量的血液收集到含EDTA管中。对于下表11中所示的参数分析全血样品。

表11–全血参数

凝固

将合适量的血液收集到含有柠檬酸钠的管中，并且随后离心以获得血浆用于测定凝血酶原时间（PT）和部分活化凝血酶原时间（APTT）。

血清化学

将合适量的血液收集到不含抗凝剂的管中。允许样品凝固且随后离心，以获得血清。对于下表12中所示的参数分析血清。

表12–血清参数

毒理动力学

在给药第1和7天时，在下文列出的时间点对于所有毒理动力学动物，将血液样品（约0.5mL/样品）从颈静脉插管收集到含K₃EDTA管内。来自对照组（组F）的毒理动力学动物仅具有在1小时时间点（在当天的第一个剂量施用后）来自每个收集日的单次血液收集取样。在每次收集前，从插管中取出小血液样品（具有肝素封闭溶液）且弃去。将新注射器置于插管上，并且获得方案要求的样品。去除具有血液样品的注射器，并且将具有盐水的新注射器附着至插管。将血液体积替换为等体积的盐水且随后将封闭溶液置于插管中。每只动物送回其笼直到下一个收集时间点。

在这个研究过程中收集的所有样品都置于标记的容器中。每个标签含有下述信息：1）研究编号，2）动物编号，3）收集间隔，4）组和性别，和5）收集日期。

血液样品通过倒转立即混合，随后置于湿冰上且冷离心（～1500g，～10分钟，～5℃），以获得血浆。将血浆作为2个等分试样分到96孔1.4-mL具有可穿透的TPE capcluster经检验的RNA酶、无DNA酶盖的聚丙烯管内且冷冻贮存（≤-70℃）。

表–13–样品收集时间点

时间点窗¹给药前给药后1小时± 4分钟2小时²± 5分钟4小时± 5分钟8小时³± 5分钟12小时± 10分钟24小时± 20分钟48小时⁴± 40分钟

¹所有样品都在收集窗内收集。

²仅在第1天给药后。

³在PM剂量施用前得自组E和F。

⁴仅在第7天给药后。

终止

在研究过程中没有动物视为垂死的。在方案规定的处理天数后，对所有研究动物实施安乐死且实施尸检。所有动物都通过放血（在深度CO₂/O₂麻醉下切断腹主动脉）得到终止。

尸检

对在研究过程中终止的所有动物进行尸检与组织收集。尸检包括下述的检查：

尸体和肌肉/骨骼系统；所有外表面和孔口；

脑的颅腔和外表面；

具有相关器官和组织的颈；和

具有其相关器官和组织的胸、腹和骨盆腔。

描述且记录所有异常。

器官重量

对于在已排定的尸检时实施安乐死的所有动物，称重肾、肝和前列腺。在称重后，称重约1克肝和肾样品，转移至Precellys 7 mL CK28组织匀浆化管（目录号0904-01），速冻且分析。

使用在尸检前获得的终末空腹体重计算器官/身体比。

组织保存和骨髓收集

从所有动物中收集下表14中所示的组织和器官，并且保存在10%中性缓冲的福尔马林中，除了睾丸、附睾和眼外。睾丸、附睾和具有视神经附着的眼在改良的Davidson’s溶液中固定～24-48小时，用水冲洗，并且随后转移至10%中性缓冲的福尔马林用于贮存。

表14–组织收集

^a甲状腺与附着的甲状旁腺一起称重。

组织病理学

对于已排定用于终末尸检的所有动物，将肾、肝和前列腺包埋在石蜡中，切片且用苏木精和伊红染色用于通过光学显微镜术的进一步检查。仅对于组A、D、E和F，将上文列出的剩余组织包埋在石蜡中，切片且用苏木精和伊红染色用于通过光学显微镜术的进一步检查。

统计分析

在合适时，统计学评估众多动物数据。

对于比较统计学，组A（对照组）与组B和C（处理组，QD给药）比较，并且组F（对照组，BID给药）与组E（处理组，BID给药）比较。使用Levene检验就方差齐性和Shapiro-Wilks检验就正态性分布评估数据，其中显著性在p≤0.05。测定为均匀且具有正态分布的数据通过方差分析（ANOVA）进行评估。如果ANOVA验证在p≤0.05的显著性，则使用参数检验（Dunnett检验）作出每个处理组与各自对照组的配对比较，以鉴定统计差异（p≤0.05）。对于群体因素显著性使用Kruskal-Wallis检验评估测定为非均匀或非正态分布的数据。如果在组间存在显著性（p≤0.05），则非参数检验（WilcoxonwithBonferroni-Holm）用于比较处理组与对照组。来自发生溢出的动物的食物消耗数据从可应用的时间期限中排除。食物消耗数据的比较统计学限制于Dunnett检验（参数）。不对测试前食物消耗（第4天到第1天）执行统计学。

结果

关于化合物23A和化合物13的不同剂量水平的暴露是剂量相关的。在用化合物13或化合物23A处理的动物中未观察到对平均体重的不利观察或作用。对于用化合物13（100或200mg/kg）每天处理一次和用化合物23A（300mg/kg）每天处理两次的动物，在研究的不同间隔过程中减少平均食物消耗。然而，因为减少的食物消耗与化合物13和化合物23A组中的体重变化无关，所以这些效应不视为不利的或生物学显著的。当与每天处理两次的对照比较时，平均钙离子浓度（CA）是统计上更低的，而关于每天施用300mg/kg化合物23A两次的大鼠组的平均ALT和AST是统计上更高的。对于接受以任何剂量方案的化合物13或化合物23A的动物，未注意到测试物品相关的组织病理学发现。

在这个研究的范围内且基于体重、临床病理学和组织病理学中的变化的不存在，关于经由管饲法经口施用于雄性大鼠每天一次共7天的化合物13的NOEL（无观察到的效应水平）是200mg/kg（844μg*hr/mlDay 7 AUC），而关于每天施用一次的化合物23A的NOEL是100mg/kg（82μg*hr/mlAUC）。关于经由管饲法经口施用于雄性大鼠每天两次共7天的化合物23A的NOAEL（无观察到的效应水平）是300mg/kg（291μg*hr/mlAUC）。

因此，分别在高达200mg/kg/天和600mg/kg/天的剂量水平时，化合物13和23A未证实在研究范围内的不利毒性。

实施例35

在雄性食蟹猴中的经口范围发现毒性和毒理动力学研究

这个研究的目的是：1）评估当通过管饲法经口施用于雄性食蟹猴连续7天时，化合物23的潜在毒性，和2）评价在第一个和第七个给药后化合物23的毒理动力学。

动物

物种、来源、历史和论证

食蟹猴（Macaca Fascicularis）得自Primus Bio-Resources Inc. ofPinCourt，Quebec，加拿大。选择食蟹猴是因为它们是通常用于非临床毒性评估的非啮齿类物种。

数目、性别、年龄和体重范围

八只（2只首次用于实验和6只非首次用于实验的）雄性用于该研究中。动物是年幼成体并且在给药开始前称重在2–4kg之间。

研究设计

动物如下表15中所示指定。动物通过经口管饲法接受化合物23或媒介物每天一次连续7天，并且在给药完成后当天终止。给药第一天指定为研究第1天。计算施用于每只动物的实际体积并且基于每只动物的最近体重进行调整。

表15–组分配和剂量水平

^*对照动物接受单独的对照/媒介物（在0.01M KCl/HCL缓冲液中的20%captisol/1%HPMCAS/1%PVP）

生活观察和测量

观察

在研究过程中每天至少一次记录笼边临床体征（不健康、行为变化等）。

体重

在组分配前和在第1（在给药前）、3和7天时以及终末在尸检前（空腹），对于所有动物记录体重。

心电描记术（ECG）

在处理前期过程中一次和在第7天时（给药后）再次对于所有猴获得心电图（双极肢体导联I、II和III，以及增强单极导联aVR、aVL和aVF）。

对于指示心电功能障碍的肉眼变化评价描记。测定涉及心率（导联II）、窦和房室节律或传导性的异常的潜在存在。测量心率、PR间隔、QRS持续时间、QT和QTc间隔值。

毒理动力学

在下述时间点在第1和7天时从每只猴中收集一系列7个血液样品（各约0.5mL）：给药前，给药后30分钟以及2、3、6、12和24小时。对于这个目的，每只猴通过静脉穿刺流血且将样品收集到含有抗凝剂K2EDTA的管内。将管置于湿冰上直至准备用于加工时。

临床病理学

在处理开始前和在第8天时终止前，对所有动物执行实验室检查（血液学、凝固、临床化学和尿分析）。

在由至少12小时但不超过20小时的食物剥夺过夜期后，通过静脉穿刺收集血液样品。从剥夺食物和水过夜（至少12小时但不超过20小时）的动物中收集尿。

血液学

对收集到EDTA抗凝剂内的血液样品测量下述参数：红血细胞计数、平均红细胞血红蛋白（计算的）、血细胞比容（计算的）、平均红细胞容积、血红蛋白、细胞形态、白血细胞计数、血小板计数、白血细胞分类（绝对的）、网状细胞（绝对的和百分比）和平均红细胞血红蛋白浓度（计算的）。

凝固

对收集到柠檬酸盐抗凝剂内的血液样品测量部分活化凝血酶原时间和凝血酶原时间。

临床化学

对收集到含有凝固激活物的管内的血液样品测量下述参数：a/g比（计算的）、肌酸酐、丙氨酸氨基转移酶、球蛋白（计算的）、白蛋白、葡萄糖、碱性磷酸酶、磷（无机的）、天冬氨酸氨基转移酶、钾、胆红素（总）、钠、钙、总蛋白质、氯化物、甘油三酯、胆固醇（总）、尿素、γ谷氨酰转移酶和山梨糖醇脱氢酶。

尿分析

对尿样品测量下述参数：胆红素、蛋白质、血液、沉渣显微镜检查、颜色和外观、比重、葡萄糖、尿胆素原、酮、体积和pH。

终止

在没有食物的过夜期后的第8天时处理期完成后，对所有动物实施安乐死。将猴用氯胺酮预麻醉且随后通过静脉内过剂量的戊巴比妥钠实施安乐死，随后为通过横切主要血管的放血。

尸检

对在研究过程中终止的所有动物进行尸检与组织收集。尸检包括下述的检查：

尸体和肌肉/骨骼系统；

所有外表面和孔口；

脑的颅腔和外表面；

具有相关器官和组织的颈；和

具有其相关器官和组织的胸、腹和骨盆腔。

描述且记录所有异常。

组织保存

在肉眼检查和所选器官称重完成后，如下表16中所示保留组织和器官。中性缓冲的10%福尔马林用于固定和保存，除非另有说明。

表16.组织和器官保留

组织病理学

对于所有动物，上文指示的所有组织都包埋在石蜡中，切片且用苏木精和伊红染色用于通过光学显微镜术检查。

结果

关于化合物23的不同剂量水平的暴露是剂量相关的。

不存在临床体征，或者体重、心电描记术参数、临床病理学参数或器官重量中的变化，其可以归于以高达200mg/kg/天的剂量的化合物23施用。类似地，不存在肉眼或显微镜发现，其可以明确地归于以高达200mg/kg/天的剂量的化合物23施用。在雄性食蟹猴中关于化合物23的无观察到的效应水平（NOEL）测定为200mg/kg/天。

实施例36

药物代谢动力学研究

在下文描述的实验中测定本发明的所选化合物的药物代谢动力学参数。如下采用一般分析程序和特定实验方案：

一般分析程序

下述一般分析程序用于下文描述的药物代谢动力学实验中：

样品分析。使用高效液相色谱法/串联质谱法（HPLC/MS/MS）方法测定在血浆中的化合物23和化合物W浓度。在提取前，取决于剂量水平或制剂，根据需要使用空白血浆将血浆样品稀释2、4、5或10倍。通过用乙腈（血浆/乙腈的1:4比）的直接蛋白质沉淀，从（稀释的）血浆中提取化合物23和化合物W连同内部标准（IS），各100μL。在离心后，将上清液提取物（10μL）注射到LC/MS/MS系统内。HPLC系统包括用由在水或乙腈中的0.1%甲酸组成的梯度移动相洗脱的、Waters Xterra MS C18柱、5微米、2.1mm直径x50mm长。

在多重反应监控（MRM）模式中用大气压化学电离（APCI）通过MS/MS检测分析物。取决于样品稀释因子，定量下限（LLOQ）是1、2、4、5、10或20ng/mL。测定法的线性范围是1-5000ng/mL。日内和日间测定法精确度在额定值的2%内。日内和日间测定法变异性是<10%。

取决于剂量水平或制剂，在用DMSO:乙腈:水（33:33:33）稀释10倍至500或1000倍后，用HPLC/UV方法测定化合物W的给药悬浮液制剂的样品。取决于剂量水平或制剂，在用DMSO:水（50:50）稀释10、50、100或500倍后，用HPLC/UV方法测定化合物W的给药悬浮液制剂的样品。

药物代谢动力学数据分析。使用专业版软件，版本5.1.1（Pharsight Corporation，Mountain View，CA），通过非区室药物代谢动力学方法分析化合物23和化合物W的血浆浓度时间概况。

测定关键药物代谢动力学参数，包括AUC_all、AUC_extrap、C_max、t_max、Cl_obs、Vss_obs和t_1/2。

统计数据分析。使用WinNonlin软件，版本5.1.1或MicrosoftExcel2000，计算血浆浓度和药物代谢动力学参数估计值的描述性统计数据，包括平均值、标准差（SD）和变异系数（%CV）。

猴经口研究

雄性食蟹猴（n=3只/剂量组）通过管饲法施用单个额定PO剂量的3、30和300mg/kg的化合物W。化合物W在0.5%MC（微晶纤维素）中配制。动物在给药前和后可自由进食和进水。

在给药前以及在给药后0（给药前）、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48小时，经由颈动脉插管收集血液样品（各约0.25mL）。将每个血液样品收集到管内，所述管保持在湿冰上且含有钾EDTA作为抗凝剂。将血浆分离且贮存于-70℃直至分析时。

使用液相色谱法/串联质谱法（LC/MS/MS）方法分析血浆样品，以测定化合物23和化合物W的浓度，取决于样品稀释因子，具有1–20ng/mL的定量下限（LLOQ）。对血浆浓度与时间数据相比较实施非区室药物代谢动力学（PK）分析。这个分析的结果在表17中提供。

表17.来自猴经口研究的药物代谢动力学数据

猴IV研究

雄性食蟹猴（n=3只/剂量组）经由颈静脉插管施用单个额定IV推注剂量的1mg/kg的化合物W。化合物W在D5W（5%右旋糖水溶液）中配制。动物在给药前和后可自由进食和进水。

在给药前以及在给药后0（给药前）、5分钟、10分钟、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48小时，经由颈动脉插管收集血液样品（各约0.25mL）。将每个血液样品收集到管内，所述管保持在湿冰上且含有钾EDTA作为抗凝剂。将血浆分离且贮存于-70℃直至分析时。

使用液相色谱法/串联质谱法（LC/MS/MS）方法分析血浆样品，以测定化合物23和化合物W的浓度，取决于样品稀释因子，具有1–20ng/mL的定量下限（LLOQ）。对血浆浓度与时间数据相比较实施非区室药物代谢动力学（PK）分析。这个分析的结果在表18中提供。

表18.来自猴IV研究的药物代谢动力学数据

大鼠经口研究

雄性Sprague Dawley大鼠组（n=3只/剂量组）通过管饲法施用单个额定经口剂量的3、10、30、300mg/kg的化合物W。化合物W在0.5%MC（微晶纤维素）或20% Captisol、1% HPMC-AS（乙酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯）、1% PVP（聚乙烯吡咯烷酮）中配制。动物在给药前和后可自由进食和进水。在给药前以及在给药后0（给药前）、0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、24小时，经由颈动脉插管收集血液样品（各约0.25 mL）。将每个血液样品收集到管内，所述管保持在湿冰上且含有钾EDTA作为抗凝剂。将血浆分离且贮存于-70℃直至分析时。

使用液相色谱法/串联质谱法（LC/MS/MS）方法分析血浆样品，以测定化合物23和化合物W的浓度，取决于样品稀释因子，具有1–20ng/mL的定量下限（LLOQ）。对血浆浓度与时间数据相比较实施非区室药物代谢动力学（PK）分析。这个分析的结果在表19中提供。

表19.来自大鼠经口研究的药物代谢动力学数据

大鼠IV研究

雄性Sprague Dawley大鼠组（n=3只/剂量组）经由颈静脉插管施用单个额定IV推注剂量的1和5mg/kg的化合物W。化合物W在D5W中配制。动物在给药前和后可自由进食和进水。在给药前以及在给药后0（给药前）、5分钟、10分钟、0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、24小时，经由颈动脉插管收集血液样品（各约0.25mL）。将每个血液样品收集到管内，所述管保持在湿冰上且含有钾EDTA作为抗凝剂。将血浆分离且贮存于-70℃直至分析时。

使用液相色谱法/串联质谱法（LC/MS/MS）方法分析血浆样品，以测定化合物23和化合物W的浓度，取决于样品稀释因子，具有1–20ng/mL的定量下限（LLOQ）。对血浆浓度与时间数据相比较实施非区室药物代谢动力学（PK）分析。这个分析的结果在表20中提供。表20.来自大鼠IV研究的药物代谢动力学数据

小鼠经口研究

雌性CD-1小鼠组（n=3只/剂量组）通过管饲法施用单个额定经口剂量的10、30、100mg/kg的化合物W。化合物W在0.5%MC中配制。动物在给药前和后可自由进食和进水。在给药前以及在给药后0（给药前）、0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、24小时，从下颌骨下静脉收集血液样品（各约0.025mL）。将每个血液样品收集到管内，所述管保持在湿冰上且含有钾EDTA作为抗凝剂。将血浆分离且贮存于-70℃直至分析时。

使用液相色谱法/串联质谱法（LC/MS/MS）方法分析血浆样品，取决于样品稀释因子，具有1–20ng/mL的定量下限（LLOQ）。对血浆浓度与时间数据相比较实施非区室药物代谢动力学（PK）分析。这个分析的结果在表21中提供。

表21.来自小鼠经口研究的药物代谢动力学数据

上文描述的研究证实化合物W在至少大鼠、犬和猴中在体内转换成化合物23。

实施例37

酶学研究

本申请的所选化合物的酶抑制活性可以在下文描述的实验中进行测定：

DNA促旋酶ATP酶测定法

通过将经由丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶的ADP生产与NADH的氧化偶联来测量金黄色葡萄球菌DNA促旋酶的ATP水解活性。这种方法先前已得到描述（Tamura和Gellert，1990，J.Biol.Chem.，265，21342）。

ATP酶测定法在30℃在含有100mM TRIS pH 7.6、1.5mMMgCl₂、150mMKCl的缓冲溶液中执行。偶联系统含有终浓度2.5mM磷酸烯醇丙酮酸、200μM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、1mMDTT、30ug/ml丙酮酸激酶、和10ug/ml乳酸脱氢酶。加入酶（90nM终浓度）和所选化合物的DMSO溶液（3%终浓度）。允许反应混合物在30℃温育10分钟。通过加入ATP至0.9mM的终浓度起始反应，并且经过10分钟过程在340纳米处监控NADH消失速率。由速率与浓度分布曲线相比较测定K_i和IC₅₀值。

发现本发明的所选化合物抑制金黄色葡萄球菌DNA促旋酶。表22显示在金黄色葡萄球菌DNA促旋酶抑制测定法中这些化合物的抑制活性。

表22.金黄色葡萄球菌DNA促旋酶的抑制

所选化合物K_i（nM）IC₅₀（nM）化合物239化合物W< 954

DNA Topo IV ATP酶测定法

通过金黄色葡萄球菌TopoIV酶的ATP至ADP转换与NADH至NAD+的转换偶联，并且通过在340nm处的吸光度变化测量反应的进展。使TopoIV（64nM）与所选化合物（最终3%DMSO）一起在缓冲液中在30℃温育10分钟。缓冲液由100mMTris7.5、1.5mMMgCl2、200mMK·谷氨酸盐、2.5mM磷酸烯醇丙酮酸、0.2mMNADH、1mMDTT、5μg/mL线性化DNA、50μg/mLBSA、30μg/mL丙酮酸激酶和10μg/mL乳酸脱氢酶（LDH）组成。用ATP起始反应，并且在Molecular Devices SpectraMAX平板阅读器上在30℃上连续监控速率20分钟。由拟合至用于紧密结合抑制剂的莫里森方程的速率与所选化合物的浓度相比较的曲线图测定抑制常数，Ki和IC₅₀。

发现本发明的所选化合物抑制金黄色葡萄球菌DNA Topo IV。表23显示在金黄色葡萄球菌DNA促旋酶抑制测定法中这些化合物的抑制活性。

表23.金黄色葡萄球菌DNA Topo IV的抑制

所选化合物K_i（nM）IC₅₀（nM）化合物2312化合物W30150

实施例38

水溶解度研究

根据下述程序测定化合物23和化合物W的水溶解度。

样品的制备。如下制备每种化合物的含水样品。在加入水（0.5mL）且通过磁搅拌器搅拌前，在4ml干净小瓶中称重化合物（20–30mg化合物）。将1.0NHCl加入悬浮液中，以将pH调整至所需范围。在室温搅拌96小时后，通过0.22微米滤器（Millipore，Ultrafree离心式滤器，Durapore PVDF 0.22μm，目录#UFC30GVNB）过滤悬浮液。收集滤液且用pH计测量pH。将含有化合物W的滤液稀释10倍，以提供用于HPLC分析的合适浓度。含有化合物23的滤液不需要稀释。

标准溶液的制备。根据下述程序制备每种化合物的标准溶液。将1-2mg每种化合物精确称重到10mL容量瓶内，并且加入水（对于化合物W）或1:1甲醇:0.1NHCl（对于化合物23）以完全溶解化合物。对于化合物23执行超声处理，以帮助在1:1甲醇:0.1NHCl中溶解。当所有固体溶解时，加入另外的溶剂，以将每种溶液的体积调整至10ml。将所得到的溶液充分混合，以给出每种化合物的标准溶液。随后用溶剂将每种标准溶液稀释2倍、10倍和100倍。

溶解度分析。通过HPLC分析（Agilent 1100，注射体积10μL，波长271nm，柱XTerraPhenyl 5μm，4.6x50mm，部分号186001144，移动相A：在水中的0.1%TFA，在AcN中的0.1%TFA）分析每种样品和每种标准溶液的等分试样。每种标准溶液注射三次，并且每种样品注射两次。通过标绘来自HPLC的峰面积平均值与标准溶液的浓度相比较获得标准曲线（如通过元素分析测定的，基于固体的总含水量合适校正标准的重量）。由来自HPLC结果的含水样品的峰面积以及标准曲线的斜率和截距计算每种样品的浓度。下表24中列出的溶解度值衍生自样品浓度和样品稀释因子的乘积。

表24.化合物23和W的水溶解度

化合物固体形式pH溶解度（mg/mL）化合物23晶状>3.0<0.001化合物W晶状4.390.25

实施例39

在肝脏和肝S9细胞中的体内代谢研究

在来自大鼠、犬、猴和人的肝和肠S9馏分中研究化合物W至化合物23的转换。化合物W在肝S9馏分中以0.1、0.3、1、3、10、20、40、100、200、300μM和在肠S9馏分中以1、3、10、20、100、300、500、1000μM温育。对于0、5、10、15、30、45或60分钟完成温育。通过LC/MS-MS定量化合物23的形成，并且数据拟合至米-门二氏（Michaelis Menten）方程式。下表25中的数据指示化合物W在这些肝脏和肠S9馏分中快速转换为化合物23。

表25.在肝和肠S9中化合物23由化合物W的形成速度（V_MAX）

^*ND：参数未测定，形成速率未饱和