福氏志贺菌血清型检测用引物和使用所述引物的多重扩增

摘要

本发明涉及福氏志贺菌血清型检测用引物和使用所述引物的多重扩增，所述引物包括序列：SEQ ID Nos.2和3、SEQ ID Nos.4和5、SEQ ID Nos.6和7、SEQ ID Nos.8和9、SEQ ID Nos.10和11、SEQ ID Nos.12和13、SEQ ID Nos.14和15、SEQ ID Nos.16和17、SEQ ID Nos.18和19。所述的引物具有特异性，退火温度一致。本发明还涉及利用所述引物进行多重扩增检测的方法。本发明进一步涉及所述福氏志贺菌血清型检测用引物在制备检测剂中的应用。本发明进一步涉及包含上述引物的福氏志贺菌血清型检测用试剂盒。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及福氏志贺菌检测用引物和使用所述引物的多重扩增。

背景技术

志贺菌(Shigella)是发展中国家细菌性腹泻的主要致病菌。每年全球有164.7百万人感 染，导致11万人死亡，大多是5岁以下的儿童(Kotloff，K.L.，J.P.Winickoff，B.Ivanoff，J.D. Clemens，D.L.Swerdlow，P.J.Sansonetti，G.K.Adak，and M.M.Levine.1999.Global burden of  Shigella infections：implications for vaccine development and implementation of control strategies. Bull World Health Organ 77：651-66)。在志贺菌的四群中，福氏是影响贫穷人群的主要流行群。

根据O抗结构的不同，福氏志贺菌分为不同的血清型。目前为止，至少16个血清型已 被报道，分别是1a，1b，1c，1d，2a，2b，3a，3b，4a，4b，5a，5b，X，Xv，Y和6(Simmons，D.A.，and E. Romanowska.1987.Structure and biology of Shigella flexneri O antigens.J Med Microbiol 23：289-302；Stagg，R.M.，S.S.Tang，N.I.Carlin，K.A.Talukder，P.D.Cam，and N.K.Verma. 2009.A novel glucosyltransferase involved in O-antigen modification of Shigella flexneri serotype 1c.J Bacteriol 191：6612-7；Ye，C.，R.Lan，S.Xia，J.Zhang，Q.Sun，S.Zhang，H.Jing，L.Wang，Z. Li，Z.Zhou，A.Zhao，Z.Cui，J.Cao，D.Jin，L.Huang，Y.Wang，X.Luo，X.Bai，P.Wang，Q.Xu， and J.Xu.2010.Emergence of a new multidrug-resistant serotype X variant in an epidemic clone of  Shigella flexneri.J Clin Microbiol 48：419-26)。

鉴定福氏痢疾杆菌及其它群痢疾杆菌的血清型主要采用免疫动物的抗血清与分离菌株进 行玻片凝集反应，根据免疫凝集结果进行判定(Edwards，P.R.，and W.H.Ewing.Identification  of Enterobacteriaceae.Burgess Publishing Company，Minneapolis，Minn，126-131(1972))。目前， 福氏痢疾杆菌血清型诊断系统已经建立(Ewing，W.H.Edwards and Ewing′s identification of  Enterobacteriaceae，.Elsevier Science Publishing Co，lnc，New York.4th ed.，135-172(1986))，多 种商业化诊断血清亦广泛应用。不同的血清型具有独特的血清凝集谱(表1)，根据现有的 诊断血清，大多数菌株能够归于目前已知的血清型。

最近，几种新血清型被不断报道。其中某些已经成为优势血清型(Talukder et al.，2003)。 2001年，在中国河南省出现一种新的血清型Xv，在随后的几年内(2002-2006)，它取代2a 成为河南省优势血清型，分别占分离福氏志贺菌的14％，35％，47％，48％，和27％(Ye et al.， 2010)。Xv血清型也在山西出现，分别占67％(2006)和33％(2007)。在甘肃、安徽和上海 2007年的分离率分别是67％、54％和35％(Ye et al.，2010)。

血清型Xv能够与单克隆抗体MASFIV-1和群7，8抗血清凝集(Ye et al.，2010)，因此它最 初被称为4c或4x(Carlin & Lindberg，1987；Pryamukhina & Khomenko，1988)。相对于X血清 型，Xv血清型菌株在它的LPS上含有MASF IV-1(或称为E1037)抗原位点(Ye C，Lan R，Xia  S，Zhang J，Sun Q，et al.(2010)Emergence of a new multidrug-resistant serotype X variant in an  epidemic clone of Shigella flexneri.J Clin Microbiol 48：419-426)。

此外，一些非典型血清型不断被分离到，如Yv(也称为4x，Y，或4s，本发明中命名为 Yv)(Talukder KA，Dutta DK，Safa A，Ansaruzzaman M，Hassan F，et al.(2001)Altering trends in  the dominance of Shigella flexneri serotypes and emergence of serologically atypical S.flexneri  strains in Dhaka，Bangladesn.J Clin Microbiol 39：3757-3759.Qiu S，Wang Z，Chen C，Liu N，Jia L， et al.(2011)Emergence of a novel Shigella flexneri serotype 4s strain that evolved from a serotype  X variant in China.J Clin Microbiol 49：1148-1150.Carlin NI，Rahman M，Sack DA，Zaman A， Kay B，et al.(1989)Use of monoclonal antibodies to type Shigella flexneri in Bangladesh.J Clin  Microbiol 27：1163-1166)，它能够特异地与MASFIV-1单克隆抗体凝集(表1)；4av(也称 为4或untypcal 4a，本发明中命名为4av)(Talukder KA，Dutta DK，Safa A，Ansaruzzaman M， Hassan F，et al.(2001)Altering trends in the dominance of Shigella flexneri serotypes and  emergence of serologically atypical S.flexneri strains in Dhaka，Bangladesn.J Clin Microbiol 39： 3757-3759.Carlin NI，Rahman M，Sack DA，Zaman A，Kay B，et al.(1989)Use of monoclonal  antibodies to type Shigella flexneri in Bangladesn.J Clin Microbiol 27：1163-1166)，除了能够与 血清4型特异的MASFIV-2凝集外，还能够与MASFIV-1单克隆抗体凝集(表1)。Foster 等人发现了一种非典型血清型(7b)，它能够与MASF 1C和6抗血清发生反应(Foster RA， Carlin NI，Majcher M，Tabor H，Ng LK，et al.(2011)Structural elucidation of the O-antigen of the  Shigella flexneri provisional serotype 88-893：structural and serological similarities with S.flexneri  provisional serotype Y394(1c).Carbohydr Res 346：872-876)(表1)，按照目前的血清型标准， 它不能归于目前已知的任何血清型。

表1福氏志贺菌已知和非典型血清型凝集谱

除了6外，所有的福氏志贺血清型LPS都具有相同的由四糖重复单位组成的多糖骨架， 血清型Y具有基本的四糖骨架(Simmons，D.A.，and E.Romanowska.1987.Structure and  biology of Shigella flexneri O antigens.J Med Microbiol 23：289-302.)，在骨架不同糖基上进行 糖基化和或乙酰化修饰，导致不同的型(例如I，II，III，IV，V VI)、群(例如3；4，6，7；8) 和1c抗原为点的出现(Stagg，R.M.，S.S.Tang，N.I.Carlin，K.A.Talukder，P.D.Cam，and N.K. Verma.2009.A novel glucosyltransferase involved in O-antigen modification of Shigella flexneri  serotype 1c.J Bacteriol 191：6612-7)。

三个基因(gtrA、gtrB和gtr(型))负责福氏志贺菌糖基化修饰。前两个基因高度同源， 可以互换，但是第三个基因gtr(型)是唯一的，编码血清型特异的糖基转移酶(Allison，G.E.，and  N.K.Verma.2000.Serotype-converting bacteriophages and O-antigen modification in Shigella  flexneri.Trends Microbiol 8：17-23；Stagg，R.M.，S.S.Tang，N.I.Carlin，K.A.Talukder，P.D. Cam，and N.K.Verma.2009.A novel glucosyltransferase involved in O-antigen modification of  Shigella flexneri serotype 1c.J Bacteriol 191：6612-7)。型抗原I，II，IV，V，群抗原7；8和1c特 异的gtr基因分别是gtrI，gtrII，gtrIV，gtrV，gtrX和gtrIC(Adams，M.M.，G.E.Allison，and N. K.Verma.2001.Type IV O antigen modification genes in the genome of Shigella flexneri NCTC 8296.Microbiology 147：851-60；Adhikari，P.，G.Allison，B.Whittle，and N.K.Verma.1999. Serotype 1a O-antigen modification ：molecular characterization of the genes involved and their  novel organization in the Shigella flexneri chromosome.J Bacteriol 181：4711-8；Guan，S.，D.A. Bastin，and N.K.Verma.1999.Functional analysis of the O antigen glucosylation gene cluster of  Shigella flexneri bacteriophage SfX.Microbiology 1451263-73；Huan，P.T.，D.A.Bastin，B.L. Whittle，A.A.Lindberg，and N.K.Verma.1997.Molecular characterization of the genes involved  in O-antigen modification，attachment，integration and excision in Shigella flexneri bacteriophage  SfV.Gene 195：217-27；Mavris，M.，P.A.Manning，and R.Morona.1997.Mechanism of  bacteriophage SfII-mediated serotype conversion in Shigella flexneri.Mol Microbiol 26：939-50； Stagg，R.M.，S.S.Tang，N.I.Carlin，K.A.Talukder，P.D.Cam，and N.K.Verma.2009.A novel  glucosyltransferase involved in O-antigen modification of Shigella flexneri serotype 1c.J Bacteriol 191：6612-7)。Gtr基因是由宿主菌基因组中整合的前噬菌体携带的。O-乙酰化，它导致群抗 原6和或型抗原III出现在1b，3a，3b和4b血清型菌株中，是由噬菌体sf6携带的oac基因介 导完成的(Clark，C.A.，J.Beltrame，and P.A.Manning.1991.The oac gene encoding a lipopolysaccharide O-antigen acetylase maps adjacent to the integrase-encoding gene on the genome  of Shigella flexneri bacteriophage Sf6.Gene 107：43-52；Verma，N.K.，J.M.Brandt，D.J.Verma， and A.A.Lindberg.1991.Molecular characterization of the O-acetyl transferase gene of converting  bacteriophage SF6 that adds group antigen 6 to Shigella flexneri.Mol Microbiol 5：71-5)。不同的 血清型菌株携带血清型特异的一个或多个前噬菌体，他们编码不同的O抗修饰特异基因(参 见图1所示)。

血清型是目前福氏志贺菌研究的主要内容，对于痢疾感染的治疗、预防、流行控制及疫 苗研制等方面具有重要的意义。

传统的血清型玻片凝集法鉴定血清型存在诸多不足(Evins，G.M.，Gheesling，L.L.& Tauxe，R.V.Quality of commercially produced Shigella serogrouping and serotyping antisera.J  Clin Microbiol 26，438-442(1988))，如：样品需要进行预培养和分离单菌落，延长了诊断周 期；血清反应受细菌培养条件和生长状态影响；部分血清型间存在交叉反应，导致错误判读； 结果判定通过肉眼观察，具有个体主观性。因此，寻找福氏痢疾杆菌血清型的分子标识，发 展基于PCR等分子生物学技术的鉴定方法，对于及时、准确鉴定病原菌血清型具有重要意义。

CN102329861A公开了一种福氏志贺菌血清型检测用引物和使用所述引物的多重扩增。 其中是根据gtrI、gtrII、oac、gtrIV、gtrV、gtrX、wzx_1-5和gtrIC基因，设计提供了一套(8 对)特定性、退火温度一致的引物对待测样品进行多重扩增，定性检测福氏志贺菌血清型。 然而，该多重扩增检测方法并不能区分Xv与X血清型。该现有技术在区分Xv与X血清型 时，仍需进一步采用传统的IV抗血清玻片凝集反应，而玻片凝集法费时，所用抗血清试剂昂 贵，且通过目测判断结果会导致错误的结果。此外，该CN102329861A公开的方法也不能有 效区分新近发现的Yv与Y血清型、以及4a与4av血清型。

因此，发展一种涵盖目前已知所有血清型的、基于PCR等分子生物学技术的快速且特异 的鉴定方法，对于及时、准确鉴定福氏志贺菌血清型具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的在于基于福氏志贺菌O抗修饰基因的研究，提供一套福氏志贺菌血清 型检测用引物，用于多重扩增鉴定福氏志贺菌血清型，及时、准确地鉴定目前已知所有福氏 志贺菌血清型。

本发明的另一目的在于提供所述引物的应用，具体包括其在检测福氏志贺菌血清型中的 应用，以及在制备福氏志贺菌血清型检测用制剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述引物多重扩增检测福氏志贺菌血清型的方法。

本发明的另一目的在于提供一种福氏志贺菌血清型检测用制剂如试剂盒。

本案发明人经过研究发现，一个质粒携带的基因lpt-O(其在基因库中的登记号为 SFxv_5135，具体序列见SEQ ID No.1)介导了在福氏志贺菌O抗上添加PEtN基团导致了 MASF IV-1表型的出现，并经实验验证了lpt-O基因是鉴别福氏志贺菌Xv血清型和X血清 型的一个分子标识，且lpt-O基因不但是Xv血清型MASF IV-1表型所必需的，也是其它MASF IV-1+表型菌株(4av，Yv)所必需的。这样，目前福氏志贺菌的所有O抗结构、修饰及对应 的基因已经明确(参见图1)。据此，本发明提供了一种区分福氏志贺菌血清型Xv与X的 分子标识，或者检测福氏志贺菌MASF IV-1表型的分子标识：lpt-O基因。该lpt-O基因同时 也可作为区分福氏志贺菌4av血清型与4a血清型、或者区分福氏志贺菌Yv血清型与Y血清 型的分子标识。

在此基础上，一方面，本发明根据gtrI、gtrII、oac、gtrIV、gtrV、gtrX、wzx_1-5、gtrIC 以及lpt-O基因，设计提供了一套新的具特异性的、退火温度一致的福氏志贺菌血清型检测 用多重扩增引物。其中包括分别为检测以下目标基因：gtrI、gtrII、oac、gtrIV、gtrV、gtrX、 wzx_1-5、gtrIC以及lpt-O基因的扩增引物。在本发明的一具体实施方案中，所述多重扩增引物 具体为本发明的以下扩增引物：SEQ ID No.2和3，用于扩增gtrI基因片段；SEQ ID No.4 和5，用于扩增gtrII基因片段；SEQ ID No.6和7，用于扩增oac基因片段；SEQ ID No.8 和9，用于扩增gtrIV基因片段；SEQ ID No.10和11，用于扩增gtrV基因片段；SEQ ID No. 12和13，用于扩增gtrX基因片段；SEQ ID No.14和15，用于扩增wzx_1-5基因片段；SEQ ID  No.16和17，用于扩增gtrIC基因片段；以及SEQ ID No.18和19，用于扩增lpt-O基因片段。

本发明的引物，可用于定性检测福氏志贺菌血清型，通过一次多重扩增检测，目前已知 的所有血清型都能够成功地鉴定。各引物对的扩增结果与血清型的对应关系可参见下表2。

表2

根据本发明的一具体实施方案，本发明提供的一套福氏志贺菌血清型检测用引物，其还 可进一步包括：针对血清型6的特异引物对SEQ ID No.29和30，用于扩增wzx₆基因片段。 如CN102329861A中所述，在血清型6流行的国家，添加该特异的单重PCR是必要的。

另一方面，本发明还提供了所述引物的应用，所述的应用具体包括所述引物在检测福氏 志贺菌血清型中的应用，以及所述引物在制备福氏志贺菌血清型检测用制剂中的应用。

根据本发明提供的所述引物在检测福氏志贺菌血清型中的应用，本发明还建立起一套快 速、灵敏、易于推广使用的扩增检测福氏志贺菌血清型的方法，其具体为多重扩增检测方法， 该方法包括利用本发明的引物进行多重扩增检测，优选所述扩增为聚合酶链式反应(PCR)。 与常规扩增技术相比，多重扩增技术涉及多对引物和多对模板，随着引物对数的增加，影响 因素也更多，增加了得到错配扩增产物的机会，因此引物的设计至关重要。本发明的引物， 在CN102329861A公开的8对多重扩增引物的基础上，针对所发现的MASF IV-1抗原的决定 因子lpt-O基因再专门设计了一对引物(SEQ ID No.18和19)。如CN102329861A中所述， 通常在多对引物的基础上再添加一对引物会增加多重PCR优化的困难性，如引物间的干扰 等。而本发明中，所设计的9对引物具有一致的退火温度，互不干扰，并具有扩增特异性。 本发明在所设计的多对引物基础上，优选还对反应体系和条件特别是对退火温度进行了优化。 在PCR中，PCR系统是由耐热DNA聚合酶、引物、脱氧核苷酸、待扩增的DNA模板和缓 冲液组成。本发明提供一种优选的PCR反应，其条件为：95℃预变性15min；94℃变性 30s，50～60℃退火90s，72℃延伸60s，共30个循环；最后72℃延伸10min。

对于本发明所述的多重扩增检测方法，优选进一步包括在所述扩增之后进行定性分析分 析。定性分析方法可以是本领域普通技术人员已知的，例如包括利用凝胶电泳显示所述扩增 产物，本领域技术人员可根据扩增产物的大小，确定所用的凝胶和浓度。

为了判断本发明的方法的有效性，本发明在具体实施例中利用本发明的引物，多重PCR 扩增分析了390株各种血清型福氏菌株，所检测菌株多重PCR结果与玻片凝集法符合率为 91％。为了评价本发明的引物的特异性，本发明还在具体实施例中检测了38株非福氏菌株， 包括其它志贺群和肠道病原菌。这些菌扩增均为阴性，证明本发明的方法的特异性是100％。 表明应用本发明的引物与扩增检测方法，可以及时、准确鉴定福氏志贺菌的血清型。

根据本发明提供的所述引物在制备福氏志贺菌血清型检测用制剂中的应用，本发明中所 述检测用制剂优选用于对分离的福氏志贺菌菌株进行检测。根据本发明的具体实施方案，所 述的检测用制剂可以是试剂盒。所述检测剂可用于检测福氏志贺菌或包含福氏志贺菌的鉴别 诊断用样品。在本发明中，检测剂优选用于对排泄物、肠积液、呕吐物进行检测。本发明的 多重扩增引物以及多重扩增方法具有较高的特异性，可单独作为一种快速检测方法应用于离 体病人样品(例如排泄物、肠积液、呕吐物等)、可能混有福氏志贺菌的水样、土壤、食品、 化妆品等样品的检测，这些样品可以经过或不经过任何富集，可快速完成福氏志贺菌血清型 的诊断和鉴别诊断。

本发明还提供了一种福氏志贺菌血清型检测用试剂盒，该试剂盒包括本发明的所述引物。 所述试剂盒还可以包括用于检测目标基因的目标检测探针，所述的目标检测探针如SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID  No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28。进一步地，所述的目标检测探针还可选择性地包括 SEQ IDNo.31。本发明的试剂盒可用于定性检测福氏志贺菌血清型。

综上所述，本发明设计了特异、退火温度一致的福氏志贺菌血清型检测用引物，建立了 基于福氏志贺菌O抗原修饰酶基因的多重PCR检测方法。本发明的多重PCR方法可用于对 福氏志贺菌血清型进行分子生物学鉴定，只需要一个反应，目前已知的各种血清型能够被容 易和特异地鉴定(表2)。本发明的扩增引物以及多重扩增方法，用于福氏志贺菌血清型的 鉴定，对于及时、准确鉴定临床分离病原菌的血清型及细菌性痢疾的防治具有重要的实际意 义和应用价值。

附图说明

图1福氏志贺菌18个血清型(6除外)O抗结构及修饰基因。

图2显示福氏志贺菌X(a)、Xv(b)和lpt-O基因转化株51580-Xv(c)的O抗结构的¹³C NMR 图谱。数字显示糖基上的质子数G，Glc；GN，GlcNAc；RI，Rha^I；RII，Rha^II；RIII，Rha^III。

图3显示福氏志贺菌血清型X(A)、Xv(B)、Yv(C)和4av(D)的O抗结构。

图4显示PCR检测血清型Xv和X菌株中lpt-O基因的扩增结果。其中，泳道1：血清 型Xv菌株2002017作为对照；泳道2-5、11-15：血清型Xv菌株；泳道6-10：血清型X菌 株。

图5显示lpt-O基因介导的血清型转化。图片A，使用MASFIV-1单克隆抗体(Reagensia  AB)和单价抗体IV(Denka Seiken)鉴定转化子的血清型。图片B，脂多糖(LPS)谱分析转化 子；脂多糖在15％胶上进行TSDS-PAGE电泳，银染后判断结果；多头指示不同血清型(Xv 和X)LPS谱差异的位置。

图6显示质粒pSFxv_2的基因组结构及在Xv和X血清型菌株中的存在情况。图片A， 质粒pSFxv_2的基因组结构，粗箭头显示ORFs，编码蛋白根据基因库中的基因组注释 (accession No.CP001385)，特殊的lpt-O基因以深色标识，扩增用引物以细箭头显示。图片B， 不同血清型中质粒谱；2002017的质粒(1道)作为阳性对照；HindIII酶切的Lambda DNA (TaKaRa，Japan)作为marker。图片C，lpt-O基因的Southern杂交检测，从2002017扩增得 到的lpt-O基因作为探针；血清型Xv(1-5道)，血清型X菌株(6-10道)。

图7显示杂交分析lpt-O基因在4av和Yv血清型菌株中的分布结果，其中，泳道1：菌 株2002017，泳道2：X血清型菌株；泳道3-5：4av菌株；泳道6-21为Yv菌株。

图8显示18株Yv，19株Xv，21株X和2株Y lpt-O基因PCR扩增结果。其中4株 PCR扩增阳性的X分别为HN059，HN060，HN066和HN378。

图9显示不同血清型菌株的lpt-O基因PCR扩增结果。

图10显示不同退火温度(50℃，52℃，55℃，57℃，60℃)的多重PCR扩增效果。

图11为利用本发明的方法对不同血清型参考菌株进行多重PCR扩增结果。

图12部分血清型临床分离株多重PCR检测结果。

图13为对38株非福氏菌株特异性检测结果。其中，2002017阳性对照；1-38分别为 B1-B18，D1-D12，SS，SR，MG1655，气单，单增，HB101，CF073，EDL933。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于 解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常 规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。

实施例1、MASF IV-1抗原的决定因子lpt-O基因的确定及特异性检测引物的设计

本实施例中，采用二维(two-dimensional)¹H，¹H和¹H，¹³C NMR技术(Duus et al.，2000)， 对Xv血清型菌株2002017的LPS结构进行了解析，它的¹H NMR和¹³C NMR谱见图2中 b，其具有典型的X血清型O抗结构(Kenne et al.，1977)(图3中B)，另外，在Xv菌株的NMR 谱中发现一个PEtN基团的信号(表3)，该PEtN基团添加在Rha^II(图3中B)，而且这是 与X血清型(图3中A)的唯一区别。考虑到两者之间的血清型差异，可以判断PEtN修饰 是MASF IV-1+表型出现的原因。

表3¹H and¹³C NMR化学位移s(δ，ppm)

本实施例中，进一步通过基因组比较，在菌株2002017的一个质粒中(pSFxv_2，accession  No.CP001385)，发现一个基因SFxv_5135与PEtN转移酶蛋白Lpt3(N.meningitides)， LptA(N.meningitides)，Lpt6(N.meningitides)，CptA(S.Typhimurium)，PmrC(S.Typhimurium)和 EptB(E.coli)(Reynolds，C.M.，S.R.Kalb，R.J.Cotter，and C.R.Raetz.2005.A  phosphoethanolamine transferase specific for the outer 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid residue  of Escherichia coli lipopolysaccharide.Identification of the eptB gene and Ca2+hypersensitivity of an eptB deletion mutant.J Biol Chem 280：21202-21211；Tamayo，R.，B.Choudhury，A.Septer， M.Merighi，R.Carlson，and J.S.Gunn.2005.Identification of cptA，a PmrA-regulated locus  required for phosphoethanolamine modification of the Salmonella enterica serovar typhimurium  lipopolysaccharide core.J Bacteriol 187：3391-3399；Wenzel，C.Q.，F.St Michael，J.Stupak，J. Li，A.D.Cox，and J.C.Richards.2009.Functional characterization of Lpt3 and Lpt6，the  inner-core lipooligosaccharide phosphoethanolamine transferases from Neisseria meningitidis.J  Bacteriol 192：208-216)有一定的同源性(22-99％一致性，39-99％相似性)。此种蛋白负责在LPS 或LOS上添加PEtN基团。而且SFxv_5135只是出现在Xv血清型测序菌株2002017基因组 中，而在其它测序的MASFI V-1-福氏志贺菌sf301、2457t和8401中没有被发现，提示这个 基因可能与Xv血清型菌株中的PEtN修饰有关。

本实施例中，还克隆了lpt-O基因的全序列(1521bp，参见SEQ ID No.1)和其上下游的 533bp片段(上游252bp，下游281bp，包含可能的启动子和终止子序列)到pMD20T(TaKaRa， Japan)构建质粒pSQZ，转化到X血清型菌株51580中，其转化子51580-Xv血清型为Xv； 其血清型特征与野生Xv血清型菌株2002017完全一致(图5中A)。LPS谱分析发现，转化子 51580-Xv的LPS谱与2002017的完全相同(图5中B)。¹H，¹H和¹H，¹³C NMR分析转化子 51580-Xv发现，转化子具有与野生Xv血清型菌株2002017一样的谱(图2中c)。本实施 例中进一步将pSQZ转化到4a血清型菌株NCTC9725中，转化子9725-4av能够与MASF IV-1 发生凝集，血清型与现有技术中报道的4a血清型菌株G1668(在Rha^II结合了PEtN基团，图 3中D)完全一致(图5中A)(Perepelov，A.V.，L.L′Vov V，B.Liu，S.N.Senchenkova，M.E. Shekht，A.S.Shashkov，L.Feng，P.G.Aparin，L.Wang，and Y.A.Knirel.2009.A new  ethanolamine phosphate-containing variant of the O-antigen of Shigella flexneri type 4a.Carbohydr  Res 344：1588-1591)(关于现有技术中报道的4a血清型菌株G1668，为非典型性4a血清型 菌株，其与其他典型性4a血清型菌株的差异在于能够与MASF IV-1发生凝集，本发明中将 该菌株G1668的血清型鉴定为4av)。模块分析发现SFxv_5135基因编码蛋白的羧基端含有 一个硫酯酶(sulfaase)功能域。而已知的具有PEtN转移酶活性的蛋白中(Lpt3，Lpt6，LptA， CptA，EptC，EptB，PmrC，Hp0022)(Cullen，T.W.，J.A.Madsen，P.L.Ivanov，J.S.Brodbelt， and M.S.Trent.2011.Characterization of unique modification of flagellar rod protein FlgG by  Campylobacter jejuni lipid A phosphoethanolamine transferase，linking bacterial locomotion and  antimicrobial peptide resistance.J Biol Chem 287：3326-3336；Kanipes，M.I.，S.Lin，R.J.Cotter， and C.R.Raetz.2001.Ca2+-induced phosphoethanolamine transfer to the outer 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid moiety of Escherichia coli lipopolysaccharide.A novel  membrane enzyme dependent upon phosphatidylethanolamine.J Biol Chem 276：1156-1163； Mackinnon，F.G.，A.D.Cox，J.S.Plested，C.M.Tang，K.Makepeace，P.A.Coull，J.C. Wright，R.Chalmers，D.W.Hood，J.C.Richards，and E.R.Moxon.2002.Identification of a gene(lpt-3)required for the addition of phosphoethanolamine to the lipopolysaccharide inner core  of Neisseria meningitidis and its role in mediating susceptibility to bactericidal killing and  opsonophagocytosis.Mol Microbiol 43：931-943；Reynolds，C.M.，S.R.Kalb，R.J.Cotter，and C. R.Raetz.2005.A phosphoethanolamine transferase specific for the outer 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid residue of Escherichia coli lipopolysaccharide.Identification of  the eptB gene and Ca2+ hypersensitivity of an eptB deletion mutant.J Biol Chem 280：21202-21211；Tamayo，R.，B.Choudhury，A.Septer，M.Merighi，R.Carlson，and J.S. Gunn.2005.Identification of cptA，a PmrA-regulated locus required for phosphoethanolamine  modification of the Salmonella enterica serovar typhimurium lipopolysaccharide core.J Bacteriol 187：3391-3399；Tran，A.X.，M.J.Karbarz，X.Wang，C.R.Raetz，S.C.McGrath，R.J.Cotter， and M.S.Trent.2004.Periplasmic cleavage and modification of the 1-phosphate group of  Helicobacter pylori lipid A.J Biol Chem 279：55780-55791；Wenzel，C.Q.，F.St Michael，J. Stupak，J.Li，A.D.Cox，and J.C.Richards.2009.Functional characterization of Lpt3 and Lpt6， the inner-core lipooligosaccharide phosphoethanolamine transferases from Neisseria meningitidis.J  Bacteriol 192：208-216；Wright，J.C.，D.W.Hood，G.A.Randle，K.Makepeace，A.D.Cox，J. Li，R.Chalmers，J.C.Richards，and E.R.Moxon.2004.1pt6，a gene required for addition of  phosphoethanolamine to inner-core lipopolysaccharide of Neisseria meningitidis and Haemophilus  influenzae.J Bacteriol 186：6970-6982)，均含有硫酯酶功能域，因此，SFxv_5135基因编码蛋 白可能具有PEtN转移酶活性，因此，本发明中将其命名为lpt-O(LPS phosphoethenolamine  transferase for O-antigen)。

质粒图谱分析发现，同标准菌株2002017一样，所有的Xv都含有一个特殊的pSFxv_2样 的质粒(图6中A)，而杂交显示lpt-O基因都在这个质粒上(图6中B)。

以前的研究证实血清型4av菌株G1668在O抗的Rha^III位置含有一个PEtN基团 (Perepelov，A.V.，L.L′Vov V，B.Liu，S.N.Senchenkova，M.E.Shekht，A.S.Shashkov，L. Feng，P.G.Aparin，L.Wang，and Y.A.Knirel.2009.A new ethanolamine phosphate-containing  variant of the O-antigen of Shigella flexneri type 4a.Carbohydr Res 344：1588-1591.)。本发明对 一株Yv菌株(MASF IV-1+)O抗结构分析发现，在O抗的Rha^III位置同样含有一个PEtN 基团(图3中C)。本发明还进一步对其他MASF IV-1+表型的临床分离株如Yv和4av等的 质粒图谱和杂交分析发现，这些菌株都含有这样的质粒和基因(图7)，证实lpt-O基因不但 是Xv血清型MASF IV-1表型所必需的，也是其它MASF IV-1+表型菌株所必需的。

针对lpt-O基因，本发明设计了特异性的检测用引物对lpt-O-2：

lpt-O-2U(SEQ ID No.18)：ATCTAGTATTGTTGGCGTTA(nt 1721-1740，complementary  to pSFxv-2序列)

lpt-O-2L(SEQ ID No.19)：CCTTTTCTTGTGTTCTTATC(nt 2799-2818)。

进一步，本实施例中用所设计的引物对lpt-O-2PCR扩增检测了10株福氏志贺菌Xv血 清型菌株和5株X血清型菌株。

PCR扩增：引物对委托Sangon Biotech(Shanghai)合成。PCR扩增采用TaKaRa公司的 PCR扩增试剂盒(KakaRa，Japan)。每个PCR反应混合物包含：1×PCR缓冲液，0.2μM of引 物，3μl of模板DNA，2.5U DNA聚合酶和0.4mM dNTP，总量50μl。PCR扩增利用PCR 仪SensoQuest LabCycler(Germany)进行，具体条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃ 退火50s，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃延伸5min。

扩增产物经电泳，结果参见图4，其中，泳道1：血清型Xv菌株2002017作为对照；泳 道2-5、11-15：血清型Xv菌株；泳道6-10：血清型X菌株。结果显示，只有Xv菌株中检 测到相应的扩增产物，而在5个X血清型菌株中没有发现。

本实施例中，更进一步按照上述扩增方法，对表3中所列333株包含15个血清型菌株进 行PCR扩增检测，结果只在MASF IV-1阳性菌株(26Xv，1株4av和25株Yv)和4株X、 1株4b中出现，经测序证实，在这4株X和1株4b中的lpt-O基因发生单个碱基缺失突变 (表4)(图8，图9)。

表4lpt-O基因在福氏志贺菌中的携带情况

¹+和-/+指示lpt-O基因存在情况。阳性菌株数显示在括号内。

²4av血清型菌株(2002091和NCTC 8296)与4a血清型菌株差异在MASF IV-1凝集。

³Yv血清型菌株与Y血清型菌株的血清型差异在于MASF IV-1和单价抗血清IV凝集。

实施例2、福氏志贺菌血清型检测用多重扩增引物的涉及及多重扩增

材料和方法

菌株：本实施例中采用18个已知的和非典型血清型(参见表5)福氏志贺菌用于多重 PCR方法条件的建立。总共390福氏志贺菌(表6)用于本发明多重PCR方法有效性的评价。 为检测本研究中引物的交叉反应(cross-reaction)，检测了38株不同菌属的菌株(S.Sonnei (n＝2)，S.dysenteriae(n＝12，包括全部12种血清型)、S.boydii(n＝18，包括全部18血清型)、 EHEC(EDL933)、大肠杆菌(HB101)、大肠杆菌K12(MG1655)、单增李斯特菌(54003)等。 所有福氏菌株的血清型经过多价抗血清(购自Denka Seiken，Japan)和单克隆抗体(购自 Reagensia AB，Sweden)的验证。本实施例中的所用的所有中国菌株分离自中国的腹泻病人， 保存于中国疾病预防控制中心传染病预防控制所微生物实验室；其它菌株购自National  Collection of Type Cultures(NCTC)，UK。

DNA模板的制备：DNA模板通过煮沸法，直接从细菌克隆中得到。首先在LB平板上 过夜培养的一个单克隆放于30μl蒸馏水中，100℃煮沸10min，冰浴5min，4℃13000g离 心10min。上清用于PCR扩增的模板。

PCR引物：本实施例中所用的PCR引物列于表7，用于扩增Wzx基因的引物参考Yayue  Li et al(Li，Y.，B.Cao，B.Liu，D.Liu，Q.Gao，X.Peng，J.Wu，D.A.Bastin，L.Feng，and L. Wang.2009.Molecular detection of all 34 distinct O-antigen forms of Shigella.J Med Microbiol 58：69-81)的设计，其它引物根据福氏志贺菌血清型特异基因gtrI，gtrIC，gtrII，oac，gtrIV，gtrV， gtrX和lpt-O序列设计。

各引物委托Sangon Biotech(上海)合成，溶于TE缓冲液(10mM Tris-Cl，1mM EDTA， pH 8.0)中，最终浓度为50μM。

PCR扩增和检测

多重PCR采用QIAGEN Multiplex PCR Kit(QIAGEN)进行。每个PCR反应混合物包含1× PCR Master Mix(containing HotStarTaq DNA polymerase，Multiplex PCR buffer，和dNTP  Mix)，每个引物0.2μM，3μl DNA模板，总量50μl。PCR扩增根据试剂盒说明书提供的 PCR条件，对本实施例所采用的多重PCR循环参数进行了优化：95℃预变性15min；94℃ 变性30s，50～60℃退火90s，72℃延伸60s，共30个循环；最后72℃延伸10min。扩增 在SENSO(German)扩增仪上进行。5微升扩增产物与上样缓冲液混合，在1.5％琼脂糖胶 上电泳分离，采用EB染观测结果。如果需要，PCR产物直接进行测序或克隆入pMD20-T TA  cloning vector(TaKaRa，Japan)进行克隆测序。

实验结果

本实施例中，首先用引物对参考菌株进行单重PCR，结果每对引物都能扩增得到预期的 片段，分别是783bp(wzx_1-5)，1122bp(gtrl)，518bp(gtrIC)，1268bp(gtrII)，604bp(oac)， 378bp(gtrIV)，905bp(gtrV)，425bp(gtrX)和1098bp(lpt-O)。对PCR扩增产物测序也证实了 扩增片段的正确。接着，按照前述材料与方法中的方案进行多重PCR，本发明尝试了退火温 度从50℃到60℃，在55℃产量最高(图10)。结果显示不同的血清型具有不同的扩增谱 (参见图11和表5)。每种血清型扩增得到预期的特异PCR产物。扩增片段的大小能够在 1.5％胶上很好分离，当使用两种DNA marker 2时，每个PCR产物都能正确判断大小。对参 考菌株的扩增谱如下：1a(wzx_1-5，gtrI)，1b(wzx_1-5，gtrI，oac)，7b(wzx_1-5，gtrI，gtrIC，oac)，1d(wzx_1-5， gtrI，gtrX)，2a(wzx_1-5，gtrII)，2b(wzx_1-5，gtrII，gtrX)，3a(wzx_1-5，oac，gtrX)，3b(wzx_1-5，oac)，4a (wzx_1-5，gtrIV)，4av(wzx_1-5，gtrIV，lpt-O)，4b(wzx_1-5，gtrIV，oac)，5a(wzx_1-5，gtrV)，X(wzx_1-5，gtrX)， Xv(wzx_1-5，gtrX，lpt-O)，Y(wzx_1-5)，Yv(wzx_1-5，lpt-O)。wzx_1-5也可用于PCR反应的内对照，因 为它出现在除6血清型以外的所有福氏志贺菌血清型中。血清型6扩增为阴性，因为它的O 抗合成基因完全不同于其它血清型，也没有修饰基因(Cheah，K.C.，D.W.Beger，and P.A. Manning.1991.Molecular cloning and genetic analysis of the rfb region from Shigella flexneri type 6 in Escherichia coli K-12.FEMS Microbiol Lett 67：213-8；Simmons，D.A.，and E.Romanowska. 1987.Structure and biology of Shigella flexneri O antigens.J Med Microbiol 23：289-302)。

本实施例的方法中没有包括1c和5b(没有标准菌株)，但是，可以根据O抗修饰特征 推测它们的PCR扩增谱分别是：1c(wzx_1-5，gtrI，gtr1C)，和5b(wzx_1-5，gtrV，gtrX)，这样，本 发明的方法能鉴别目前发现的所有血清型，特别是以前不能命名的4av、Yv、Xv和7b。

为了判断本发明的方法是否可以应用于所有的福氏菌株，并评价本发明方法的有效性， 本实施例分析了390株各种血清型福氏菌株(参见表6，部分血清型临床分离株多重PCR检 测结果见图12)，除了18株携带突变的lpt-O基因外，所有的检测菌株多重PCR结果与玻 片凝集法吻合，符合率为91％。

表5福氏志贺菌菌株血清型及多重PCR鉴定结果

表6 390株福氏菌株血清型多重PCR与玻片凝集法一致性检测结果

¹，含有突变的lpt-O基因，因为移码突变，此基因功能失活；

²，含有突变的gtr-X基因，因为移码突变，此基因功能失活；

³，含有突变的gtrII基因，因为移码突变，此基因功能失活；

⁴，含有突变的lpt-O基因，因为移码突变，此基因功能失活。

表7

^$如需要，引物对wzx₆单独使用，用于进一步确认6血清型。

实施例3、特异性检测

为评价引物的特异性，本实施例参照实施例2中记载的方法，利用所述9对引物进行多 重扩增(其中退火温度55℃)，检测了38株非福氏菌株，包括其它志贺群和肠道病原菌。 这些菌扩增均为阴性(请参见图13、表8)。证明本发明的方法的特异性是100％。

表8用于特异性分析的菌株及PCR扩增结果

  菌株/血清型   菌株数  特异基因PCR反应结果   S.Sonnie(S)   1  -   S.Sonnie(R)   1  -   S.dysenteriae(1-18)   各1  -   S. boydii(1-12)   各1  -   EHEC(EDL933)   1  -   UPEC(CFT073)   1  -   大肠杆菌K12(HB101)   1  -   大肠杆菌K12(MG1655)   1  -   单增李斯特菌(54003)   1  -   嗜水气单胞菌   1  -