一种抗寒香蕉种质的筛选方法

摘要

本发明属于香蕉愈伤组织辐射诱变育种领域，具体涉及一种抗寒香蕉种质的筛选方法，利用该方法能高效快速筛选香蕉抗寒突变种质。发明包括香蕉未成熟雄花愈伤组织的辐射处理、愈伤组织低温筛选、分化芽低温筛选、香蕉幼苗低温筛选、香蕉抗寒生根苗驯化及移栽等内容组成。本方法由于采用了三次低温筛选技术，尤其是在香蕉雄花诱导的愈伤组织时期就开始采用低温筛选技术，极大的提高了抗寒突变种质的筛选效率，缩短了培育香蕉抗寒品种的周期。

说明书

技术领域

本发明属于香蕉愈伤组织辐射诱变育种领域，具体涉及一种抗寒香蕉种质的筛选方法。

技术背景

香蕉是典型的热带亚热带果树，广泛分布于热带和南亚热带地区。我国是世界香蕉主产 国之一，种植区域分布于广东、海南、广西、福建、云南及台湾等省区。近年来由于气候 条件的变化，我国广东、广西、云南等省的香蕉种植经常遭受寒害威胁，造成大面积减产 和绝收，给广大香蕉果农造成严重经济损失。虽然生产上针对寒害建立了一些预防措施， 但是对于较严重的寒害，其预防效果还是不理想，因此选育香蕉抗寒品种是解决香蕉寒害问 题的根本出路。目前栽培的香蕉大部分是三倍体，单性结实，具有高度的不育性，无法通过 常规杂交选育抗寒新品种，因此利用⁶⁰Co-γ射线辐射诱变香蕉，培育香蕉突变体，从突变 体中筛选具有抗寒突变的新种质，再培育获得新品种是香蕉抗寒育种的重要途径之一。

目前国内外对香蕉辐射诱变进行抗寒育种研究报道文献较少，在辐射诱变材料的选择 上主要采用香蕉吸芽、香蕉组培芽或者香蕉幼苗，其方法主要缺点在于需要处理的突变材 料多，筛选周期长、效率低。本发明一种抗寒香蕉种质的筛选方法选取香蕉未成熟雄花愈 伤组织为辐射突变材料，采用愈伤组织低温筛选、分化芽低温筛选、香蕉幼苗低温筛选的 三次低温筛选技术，提高了抗寒突变种质的筛选效率，缩短了培育香蕉抗寒品种的周期。

发明内容

一种抗寒香蕉种质的筛选方法的发明内容包括香蕉未成熟雄花愈伤组织的辐射处理、 愈伤组织低温筛选、分化芽低温筛选、香蕉幼苗低温筛选、香蕉抗寒生根苗驯化及移栽等 内容组成。

(1)香蕉未成熟雄花愈伤组织的辐射处理

香蕉未成熟雄花诱导的愈伤组织经⁶⁰Co-γ射线辐射处理，愈伤组织辐射吸收剂量为 60-70Gy。

(2)愈伤组织低温筛选

经过辐射处理的愈伤组织转入人工气候箱进行黑暗培养，设置人工气候箱温度为 14℃、10℃二个温度梯度，采用先高温后低温的原则，每个温度处理时间周期为10天，进 行低温筛选。在10℃低温筛选阶段结束后逐步恢复温度至26℃，选择经过低温筛选后成活 的愈伤组织进行分化培养。愈伤组织继代培养基为MS+1.0mg/L生物素+100mg/L谷氨酰胺 +0.2mg/L TDZ+0.2mg/L Zeatin+40g/L蔗糖+5.5g/L琼脂pH＝5.3的固体培养基，每 10天更换一次培养基。

(3)愈伤组织的分化培养

经过低温筛选后成活的愈伤组织接种于MS+4.0mg/L BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗 糖+5.5g/L琼脂pH＝5.8的分化固体培养基上。在26℃，光强度为1500lx条件下培养，每 天光培养12小时，黑暗培养12小时。每10天更换一次分化固体培养基，连续培养20-30 天产生分化芽。

(4)分化芽低温筛选

分化芽转入人工气候箱，设置人工气候箱光强度为1500lx，每天光培养12小时，黑 暗培养12小时，设置人工气候箱温度为14℃、10℃、7℃三个温度梯度，采用先高温后低 温的原则，每个温度处理时间周期为14天，进行低温筛选。在7℃低温筛选阶段结束后逐 步恢复温度至26℃，选择经过低温筛选后成活的分化芽，在26℃培养21天，分化芽生长 成香蕉幼苗。

(5)香蕉幼苗低温筛选

将香蕉幼苗转入人工气候箱。设置人工气候箱光强度为1700lx，每天光培养18小时， 黑暗培养6小时，设置人工气候箱温度为14℃、10℃、7℃、4℃四个温度梯度，采用先高 温后低温的原则，每个温度处理时间周期为10天，进行香蕉幼苗低温筛选。在4℃低温筛 选阶段结束后逐步恢复温度至26℃，选择经过低温筛选后成活的香蕉幼苗，将香蕉幼苗接 种于MS+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼5.5g/L pH＝5.8的生根培养基上，连续培养30天， 诱导出较高质量的根系，成为香蕉抗寒生根苗。

(6)香蕉抗寒生根苗驯化及移栽

香蕉抗寒生根苗经2-3天的自然光炼苗后，洗净根部培养基，移栽于营养袋中，在大 棚育苗2-3个月，再移栽入大田定植，做为抗寒香蕉种质保存。

具体实施方式

本发明将结合下面的实例做进一步详述。

1材料

中国热带农业科学院热带生物技术研究所香蕉生物技术研究组提供香蕉未成熟雄花愈 伤组织。

2香蕉未成熟雄花愈伤组织辐射诱变处理

香蕉未成熟雄花愈伤组织经⁶⁰Co-γ射线辐射处理，愈伤组织辐射吸收剂量为60-70Gy， 辐射处理由四川省农业科学院生物技术核技术研究所完成。

3愈伤组织低温筛选

经过辐射处理的愈伤组织转入人工气候箱进行黑暗培养。设置人工气候箱温度为14℃、 10℃二个温度梯度，采用先高温后低温的原则，每个温度处理时间周期为10天，进行低温 筛选。在10℃低温筛选阶段结束后逐步恢复温度至26℃，选择经低温筛选成活的愈伤组织 进行分化培养。愈伤组织继代培养基为MS+1.0mg/L生物素+100mg/L谷氨酰胺+0.2mg/L TDZ +0.2mg/L Zeatin+40g/L蔗糖+5.5g/L琼脂pH＝5.3的固体培养基，每10天更换一次培 养基。

4愈伤组织的分化培养

经过低温筛选成活的愈伤组织接种于MS+4.0mg/L BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+ 5.5g/L琼脂pH＝5.8的固体培养基上。在温度26℃，光强度1500lx条件下培养，每天光培 养12小时，黑暗培养12小时。每10天更换一次培养基，连续培养20-30天，至产生分 化芽。

5分化芽低温筛选

分化芽转入人工气候箱。设置人工气候箱光强度为1500lx，每天光培养12小时，黑暗 培养12小时，设置人工气候箱温度为14℃、10℃、7℃三个温度梯度，采用先高温后低温 的原则，每个温度处理时间周期为14天，进行低温筛选。在7℃低温筛选阶段结束后逐步 恢复温度至26℃，选择经低温筛选后成活的分化芽，在26℃培养21天，分化芽生长成香 蕉幼苗。

6香蕉幼苗低温筛选

将香蕉幼苗转入人工气候箱。设置人工气候箱光强度为1700lx，每天光培养18小时， 黑暗培养6小时，设置人工气候箱温度为14℃、10℃、7℃、4℃四个温度梯度，采用先高 温后低温的原则，每个温度处理时间周期为10天，进行香蕉幼苗低温筛选处理。在4℃低 温筛选阶段结束后逐步恢复温度至26℃，选择经低温筛选后成活的香蕉幼苗，将香蕉幼苗 苗接种于MS+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L pH＝5.8的培养基上，连续培养30天 至诱导出较高质量的根系，成为香蕉抗寒生根苗。

7香蕉抗寒生根苗驯化及移栽

香蕉抗寒生根苗经2-3天的自然光炼苗后，洗净根部培养基，移栽于营养袋中，在大 棚育苗2-3个月。

8香蕉抗寒生根苗移栽后性状观察和生理生化指标测定

①移栽成活率统计

香蕉抗寒生根苗移栽于营养袋中2个月后统计移栽成活率为51.47％，没经历低温筛选 的对照香蕉苗移栽成活率为98.67％，说明经过低温筛选的植株较难适应常温介质并恢复生 长。

②株高与叶片数测定

株高与叶片数是描述香蕉幼苗生长速度快慢的重要指标。香蕉抗寒苗移栽2个月后测 量平均株高为9.60厘米，平均叶片数为7.83片。没经历低温筛选的对照香蕉苗移栽2个 月后测量平均株高为20.10厘米，平均叶片数为9.33片，说明筛选出的抗寒苗生长速度较 慢。

③抗寒苗低温胁迫生理生化指标的测定

香蕉抗寒生根苗移栽于营养袋中3个月后，放置于人工气候箱，设置人工气候箱光强 度为1700lx，每天光培养18小时，黑暗培养6小时，设置人工气候箱温度为7℃，低温胁 迫2天。测定过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)以及丙二醛(MDA)含量。结果表明 香蕉抗寒苗植株过氧化物酶(POD)酶活力是对照组1.4倍；香蕉抗寒苗植株过氧化氢酶(CAT) 酶活力是对照组1.78倍；香蕉抗寒苗植株丙二醛(MDA)含量仅为对照组32.3％，表明香蕉 抗寒苗植株具有较强的抗寒能力。