能同时响应水杨酸SA和茉莉酸JA诱导的诱导启动子及其应用

摘要

本发明提供一种能同时响应水杨酸SA和茉莉酸JA诱导的诱导启动子。该诱导启动子是以烟草PR-1a启动子为基本骨架，利用巢式PCR扩增方法将JA响应元件插入PR-1a启动子获得的一种新的融合启动子，命名为PR-1a-JA。诱导活性分析结果表明，PR-1a-JA不仅能够同时响应SA和JA的诱导，具有较高的SA诱导活性，而且能够对病原菌的诱导发生响应，响应部位主要集中在侵染部位。无本底表达，不受高温、低温、高盐、机械损伤等非生物胁迫的诱导。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种能同时响应水杨酸SA和茉莉酸JA诱导的诱 导启动子及其应用。

技术背景

自从人类开始栽培作物以来，植物病害便是作物生产的重要影响因素。作物病害不仅 影响作物的生长发育，导致产量降低，甚至绝收，而且还影响产品的品质，给人类的健康 带来无形的危害。我国是农业大国，植物病害一直是农作物减产的重要原因，平均每年因 病害造成的农作物损失占农作物产量的10%以上。目前病虫防治仍以化学农药控制为主， 这不仅对环境造成严重污染，还容易使病虫害产生抗性，严重威胁人类的健康与生存。实 践证明，推广种植抗病品种是防治病害唯一经济有效的措施，因此，如何提高植株自身抗 病性成为解决这一问题的关键。

基因工程技术的应用，为培育抗病植物品种开辟了一条有效的途径。即通过转基因技 术，将抗病基因转入到植物体内，表达抗菌蛋白或诱导植物产生抗病反应，从而提高植株 自身抗病性。利用组成型启动子控制抗病基因在植物体内的持续表达是植物抗病基因工程 研究的常用策略。但是，某些抗病基因在植株内高量持续表达后，产生的异源蛋白对植物 细胞具有一定的毒害作用，即使在无病原菌侵染时植物仍持续处于抗病反应状态，严重影 响植物的正常生长发育，虽然抗病性得到了有效提高，但是获得的转基因植物不能应用于 生产。

病原诱导型启动子是一类在受到病原菌侵染时才能激活的启动子，理论上这类启动子 可以调控目的基因在病原菌侵染时在侵染部位进行表达。因此，利用这类启动子控制抗病 相关基因，不仅能提高转基因植株的防御能力，而且可消除或削弱因抗病基因过高表达或 表达产物持续积累而对植株产生的毒副作用。

水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）是两大类植物免疫信号分子，病原诱导型启动子中普遍 含有能够响应这些信号分子的元件，通过相关元件对这些信号分子进行响应，启动下游抗 病基因表达，从而介导不同类型病原菌侵染植物后的抗病反应。水杨酸主要介导植物体对 活体营养型病原菌的免疫反应；茉莉酸主要介导植物体对死体营养型病原菌、物理和植食 昆虫伤害的免疫反应。目前已经报道获得的绝大多数天然病原诱导型启动子只能响应其中 一种信号，其响应的病原菌范围非常有限。已报道能同时响应水杨酸（SA）和茉莉酸（JA） 诱导的诱导型启动子主要是来自辣椒的CABPR1启动子，但是该启动子不仅能响应水杨酸 （SA）和茉莉酸（JA）诱导，同时也能对生物和非生物胁迫的诱导作出响应，未受胁迫也 存在调控基因的表达，即该启动子存在一定的本底。这种存在本底，且对多种生物和非生 物胁迫作出反应的启动子与组成型启动子类似，同样难以应用于植物抗病基因工程中。

植物抗病基因工程研究中，利用病原诱导启动子（Pathogen-inducible promote）调控基 因的表达更具优势，因为病原诱导启动子可以首先对多种病原菌的入侵做出反应，使目的 基因在受病原菌侵染时而诱导表达。利用病原诱导启动子调控相关基因的表达是介导植物 广谱抗性策略的创新之处。因此，病原诱导启动子在植物抗病基因工程中的应用越来越受 到重视。理想的病原诱导型启动子具有病原诱导因子广、本底活性低、启动表达快、不受 创伤和其他非生物胁迫诱导等特点。而天然存在的启动子均不兼具上述这些特性，这就一 定程度上限制了这些启动子在植物抗病基因工程中的广泛应用。实际上，目前抗病基因工 程中几乎没有理想可用的病原诱导型启动子。因此，获得具有前述特点的病原诱导型启动 子对植物抗病基因工程具有重要意义。

植物病原菌按其生活习性划分为活体营养型、死体营养型和兼性营养型三大类。植物 对活体营养型的免疫反应与SA信号途径有关，对死体营养型的免疫反应与JA信号途径有 关，而这两种信号途径相互拮抗，因此，除了植物自身具有的免疫功能外，通过基因工程 手段难以获得植物对活体营养和死体营养病原菌同时兼抗的特性，同时也难以达到对兼性 营养病原菌不同的营养生长阶段同时兼抗的目的。但是，如果一个启动子能同时应答SA 和JA的诱导，那么，理论上通过基因工程手段就可以在病原菌不同的营养生长阶段都能 有效诱导基因的表达，达到提高植物对更多病害的抗性的目的。

因此，人工构建能够同时响应水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）诱导的启动子，并筛选获 得无本底，活性高、反应快、仅受病原菌的诱导，而不受非生物胁迫诱导的病原诱导启动 子，不仅可以扩大病原诱导启动子对病原菌的响应范围，而且对于基因工程中选育广谱抗 病植株，以及实现对活体营养和死体营养兼性菌的有效防治均具有十分重要的意义。

发明内容

本发明是针对目前病原诱导启动子存在的不足，利用生物技术手段成功改造提供一种 能同时受水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）诱导的诱导型启动子。该启动子不仅能受水杨酸（SA） 或茉莉酸（JA）的诱导，也能受水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）的同时诱导，同时也能受 烟草赤星病菌的诱导，且诱导表达主要集中在侵染部位；此外，该启动子受SA诱导活性 高、无本底、不受如损伤、高盐、低温、高温等非生物胁迫的诱导。可以利用本发明的启 动子构建各种植物表达载体，用于通过基因工程技术改良作物的性状。

本发明首先提供了一种能同时响应水杨酸SA和茉莉酸JA诱导的诱导启动子，其特征 在于，该诱导启动子含有SEQ1所示的核苷酸序列，命名为PR-1a-JA。

进一步，所述诱导启动子，是以烟草PR-1a启动子为基本骨架，利用巢式PCR扩增方 法将JA响应元件插入PR-1a启动子获得的一种新的诱导启动子；

所述的JA响应元件，至少含有SEQ2所示的核苷酸序列。

本发明还提供所述能同时响应水杨酸SA和茉莉酸JA诱导的诱导启动子的制备方法， 其特征在于，包括如下步骤：

1）设计SEQ2所示的核苷酸序列，它包含2个G-box、2个GCC-box及来自烟草NtPMT 启动子G-box元件及GCC基序的中间连接序列；

2）以烟草DNA为模板，以SEQ7和SEQ8为引物进行PCR扩增，扩增产物克隆入 pGEMT载体，经筛选验证获得pGEMT-PR-1a载体；

3）以pGEMT-PR-1a质粒为模板，SEQ3和SEQ4为引物对，SEQ5和SEQ6为引物对， 分别进行扩增得到两个片段，并利用这两个片段的重叠部分进行退火延伸，得到重叠延伸 片段；

4）利用步骤3）获得的重叠延伸片段为模板，以SEQ3和SEQ6为引物对，扩增获得 新的诱导启动子PR-1a-JA的序列。

本发明还提及所述诱导启动子的应用，其为扩增诱导启动子序列的引物。

该诱导启动子的应用，在遗传育种或基因表达中的应用。

该诱导启动子序列应用于重组载体、表达盒、转化细胞系或重组菌。

该诱导启动子序列插入pBI121等植物表达载体而获得重组载体。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明首次提供了一种诱导启动子PR-1a-JA，利用转基因烟草研究证明，该启动子不 仅能对SA的诱导作出反应，而且能响应JA的诱导；还能对SA和JA的同时诱导作出应 答。进一步的研究证明，该启动子无本底，受病原菌诱导后，诱导活性高，该启动子能对 病原菌的诱导快速作出反应，且诱导反应主要集中在侵染部位。而且不受如损伤、高温、 低温、高盐等非生物胁迫的诱导。符合植物抗病基因工程研究需要的理想启动子的特点， 可为植物抗病基因工程提供可应用的启动子。

附图说明

图1是JA反应模块插入PR-1a的示意图。

图2是PR-1a-JA::GUS转基因烟草PCR检测结果；

M：DNA Marker（DL2000）；1：野生型烟草；2：阳性对照，pBI121-PR-1a-JA::GUS 质粒；3-16：PR-1a-JA::GUS转基因烟草植株；17：水对照。

图3是PR-1a-JA::GUS转基因烟草受SA诱导后的GUS染色结果。

图4是PR-1a-JA::GUS转基因烟草受MeJA诱导后的GUS染色结果。

图5是PR-1a-JA::GUS转基因烟草受SA和MeJA同时诱导后的GUS染色结果。

图6是PR-1a-JA::GUS转基因烟草接种赤星病菌后GUS组织化学染色结果；

赤星病菌指接种赤星病菌的PR-1a-JA::GUS转基因烟草叶片；对照指接种PDA培养 基块的PR-1a-JA::GUS转基因烟草；12hr，1d……7d指PR-1a-JA::GUS转基因烟草叶片接 种赤星病菌的时间。

图7PR-1a-JA::GUS转基因烟草受非生物胁迫后GUS组织化学染色结果；

CK指野生型烟草植株叶片。

具体实施实例

以下的实施实例进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施实例，本领域的技术 人员可以确定本发明的基本特征。除特殊说明，本发明所采用的均为本发领域的现有技术。 实施实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买获得。

1、PR-1a启动序列的获得：

1.1 烟草DNA的提取：

取野生型烟草叶片约100mg，利用新型植物基因组DNA快速提取试剂盒（Aidlab）， 按说明书步骤提取烟草基因组DNA。

1.2 PR-1a启动子的获得：

在5’端添加HindⅢ，3’端添加BamHI酶切位点，分别设计引物SEQ7和SEQ8，然 后以步骤1.1获得的烟草基因组DNA为模板，利用Ex Taq DNA聚合酶（TaKaRa公司产 品）扩增目标片段。扩增产物1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并用回收试剂盒（BioSpin Plasmid  DNA Extraction Kit）进行目的片段的回收。然后利用T4连接酶（Promega），将回收片段 连接入pGEM-T easy载体，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，获得pGEMT-Pr-1a载体， 经测序验证后获得PR-1a启动子序列。

2、PR-1a-JA启动子序列的获得：

2.1 设计72bp的JA反应模块（反应元件及中间连接序列）：

根据应答JA的诱导启动子的特点，JA的主要反应元件是G-box和GCC-box。为了提 高JA诱导反应的强度，分别将这两个反应元件增加一倍，同时用一段来自烟草NtPMT启 动子G-box元件及GCC基序的中间连接序列连接两个加倍的JA反应主要元件，得到72bp 的JA反应模块，具体序列见SEQ2。

2.2 PR-1a启动子片段的获得：

通过http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html和http://bioinformatics.Psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html网站，利用植物启动子数据库对PR-1a启动子进行元件预测分析。 为了成功构建PR-1a-JA启动子，其JA反应元件插入PR-1a启动子时不能破坏该启动子自 身的SA响应元件及其他相关作用元件，同时要避开其TATA框和CAAT盒等核心启动元 件。根据该启动子的特点，选择在其-604bp的位置插入设计的72bp的JA反应模块，示意 图见图1。

根据上述设计思路和PR-1a启动子的特点，按照PCR反应要求，分别设计并合成两对 引物SEQ3和SEQ4，SEQ5和SEQ6，然后以pGEMT-Pr-1a质粒为模板，进行巢式PCR扩 增，分别获得PR-1a启动子的两个片段，并利用这两个片段的重叠部分进行退火延伸，得 到重叠延伸片段。

所述SEQ3、SEQ4、SEQ5和SEQ6由上海英俊生物技术有限公司合成。

2.3 PR-1a-JA启动子的获得：

以上述步骤2.2获得的重叠延伸片段为模板，以SEQ3和SEQ6为引物，进行PCR扩 增，扩增产物1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并用回收试剂盒（BioSpin Plasmid DNA Extraction  Kit）进行扩增片段的回收。然后利用T4连接酶（Promega），将回收片段连接到pGEM-T easy 载体，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，获得pGEMT-PR-1a-JA载体，经测序验证后 获得PR-1a-JA启动子序列，该启动子含有SEQ1所示的核苷酸序列。

3、pBI121-PR-1a-JA::GUS植物表达载体的构建及农杆菌转化子的获得：

3.1 pBI121-PR-1a-JA::GUS植物表达载体的构建：

将步骤2.3获得的pGEMT-PR-1a-JA质粒和pBI121质粒分别用HindⅢ和BamHI进行双酶 切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，前者回收约1600bp的小片段，后者回收大片段， 然后利用T4DNA连接酶连接回收的片段，并转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，提取质 粒再利用HindⅢ和BamHI进行双酶切验证，获得pBI121-PR-1a-JA::GUS植物表达载体。

所述pBI121质粒为由日本信州大学小岛峰雄教授赠送。

3.2 含有pBI121-PR-1a-JA::GUS植物表达载体的重组农杆菌的获得：

利用电转化法，将步骤3.1获得的pBI121-PR-1a-JA::GUS植物表达载体转入农杆菌 LBA4404感受态细胞，利用抗生素筛选标记基因进行抗性筛选，获得阳性克隆，再提取农 杆菌质粒并用HindⅢ和BamHI进行双酶切验证，获得含有pBI121-PR-1a-JA::GUS植物表达 载体的重组农杆菌。

4、转基因烟草的获得：

4.1 烟草的遗传转化：

将含pBI121-PR-1a-JA::GUS植物表达载体的重组农杆菌接种入液体YEB培养基，28℃、 200rpm振荡培养过夜至OD6001.0～1.2。菌液离心后收集菌体，并用等体积MSB液体培养 基重悬菌体，重悬液即为转化用浸染液。

培养约10d的烟草无菌苗叶片，切成3-5mm介方的叶盘，于浸染液内浸染1hr，去除菌 液，然后将叶盘接种于共培养基（叶片阳面朝上），24℃暗培养48hr。共培养完成后，外植 体继代入附加100mg/L卡那霉素和200mg/L头孢霉素的筛选脱菌培养基，25℃、16hr光照/8hr 暗培养的光周期培养2周继代一次，至叶盘边缘产生幼芽，将幼芽切下继代入MSB培养基 生根成苗，幼苗生长至3-4叶移栽入花盆做进一步的分析。

4.2 烟草的PCR验证：

以再生烟草植株幼嫩叶片为材料，利用新型植物基因组DNA快速提取试剂盒（Aidlab）， 按说明书步骤提取再生烟草基因组DNA。

以SEQ9（5’-TCAGGAAGTGATGGAGC-3’）和SEQ10（5′-GGTATCGGTGTGAGCGT-3′） 为引物，扩增PR-1a-JA::GUS的部分序列，产物1063bp。20μL PCR扩增体系包括：2×Taq Plus  Master Mix10μL，模板DNA1μL（约10ng），上下游引物各1μL（5μmol/L），双蒸水7μL。 PCR扩增程序为：95℃5min；95℃30S，56℃30S，72℃30S，30个循环；72℃10min。

PCR检测结果显示（图2），PR-1a-JA::GUS序列已经整合入烟草植株。凡PCR扩增能获 得约1063bp特异带的烟草植株均用于PR-1a-JA启动子的特性分析。

5、PR-1a-JA启动子受SA和JA诱导的反应特性分析：

5.1 GUS组织化学染色

GUS组织化学染色参照Jefferson和Bevan（1987）的方法进行，具体方法如下：将需要 染色的植物组织材料放入配制的GUS染色液中，37℃避光染色12hr，以充分染色，然后用 95%的乙醇脱色3～5次，直至材料完全没有绿色为止。最后用体视镜观察并拍照，或用相机 拍照。

5.2 PR-1a-JA启动子受SA和JA诱导的反应特性分析：

以转基因烟草离体叶片为材料，分别用1mM水杨酸（SA）、0.01%的茉莉酸甲酯 （MeJA）、以及1mM SA+0.01%MeJA分别浸泡叶片8hr，然后用自来水漂洗干净，再用湿 润的脱脂棉包裹叶柄进行保湿培养，以同期水处理作对照。自处理开始，间隔12hr分别用 约6mm直径的打孔器切取叶圆片，按上述步骤5.1的方法进行GUS组织化学染色。GUS染色 结果表明，时程试验中，水处理对照样品均未染成蓝色；1mM SA诱导处理后8hr转基因烟 草叶片便能蓝色，直至处理后的132hr，且染色较深（图3）；0.01%MeJA诱导处理后24hr 转基因烟草叶片开始染成蓝色，直至处理后的120hr（图4）；1mM SA和0.01%MeJA同时进 行处理8hr，转基因烟草叶片开始染成较深的蓝色，直到处理后144hr仍然能染成蓝色（图5）。 结果说明，PR-1a-JA启动子既能分别对SA或JA的诱导作出反应，也能对SA和JA的同时诱 导作出应答，且不存在本底反应。

6、PR-1a-JA启动子受病原菌诱导的反应特性分析：

6.1 接种致病菌的获得：

保存的烟草赤星病菌首先于90mm PDA平板上活化培养，约1周，用6mm直径的打孔器 切取菌苔，然后接种入新的90mm PDA平板中央，26℃培养箱暗培养至菌苔直径约80mm， 然后再用6mm打孔器于菌苔边缘切取菌块，作为接种用致病菌。

6.2 PR-1a-JA启动子受病原菌诱导的反应特性分析：

随机选取10株能同时响应SA和JA的转基因烟草植株，取其幼嫩叶片，采用离体叶片接 种法，接种烟草赤星病菌。首先于叶片的主叶脉中部，人为损伤叶片，然后将上述获得的 接种菌块接种到损伤处，促进病原菌的侵染，以同期接种同样大小PDA培养基块作为接种 对照。所有接种材料于湿度75%，26℃光照培养箱，光照16hr，暗培养8hr的光周期条件下 培养，并间隔12hr取完整叶片进行GUS组织化学染色，以明确PR-1a-JA启动子受病原菌诱 导的特性。结果表明，接种12hr，转基因烟草便能染成蓝色，直至接种后7d蓝色渐渐褪去 （图6，赤星病菌），而同期接种PDA培养基块的对照却没有染成蓝色（图6，对照）。

7、PR-1a-JA启动子受非生物胁迫诱导的反应特性分析：

7.1 PR-1a-JA启动子对损伤诱导的反应

随机选取同时应答SA和JA的转基因烟草株系10个，取生长完全的幼嫩叶片，用9mm 孔径的打孔器切取叶圆片，并将叶圆片漂浮于水面进行光照保湿培养，间隔12hr，每个株 系取5个叶圆片进行GUS组织化学染色，以检测PR-1a-JA启动子对损伤的诱导反应。

连续染色检测1周，所有用于检测的株系均未获得染成蓝色的组织（图7）。3次重复试 验获得的结果完全相同。结果表明，PR-1a-JA启动子不受损伤的诱导。

7.2 PR-1a-JA启动子受NaCl诱导的反应：

随机选取同时应答SA和JA的转基因烟草株系10个，取生长完全的幼嫩叶片，用9mm 孔径的打孔器切取叶圆片，叶圆片和完整叶片同时漂浮于1%NaCl溶液进行培养，间隔12hr 取叶圆片，完整叶片则用打孔器切取叶圆片进行GUS组织化学染色，以检测PR-1a-JA启动 子对盐胁迫诱导的反应。

连续染色检测1周，所有用于检测的株系均未获得染成蓝色的组织（图7）。3次重复试 验获得的结果完全相同。结果表明，PR-1a-JA启动子不受盐胁迫的诱导。

7.3 PR-1a-JA启动子受高温和低温胁迫的反应：

随机选取同时应答SA和JA的转基因烟草株系10个，取生长完全的幼嫩叶片，用湿纱布 包裹叶柄，同时辅以保鲜膜覆盖进行保湿，然后将转基因烟草叶片的一组置4℃冻库内， 辅以光照进行培养，另一组则置40℃光照培养箱内培养，所有材料每天光照16hr，暗培养 8hr。自处理开始间隔12hr用9mm打孔器切取叶圆片进行GUS组织化学染色，以检测 PR-1a-JA启动子对高温和低温诱导的反应。

连续1周GUS组织化学染色检测结果显示，所有用于检测的株系均未获得染成蓝色的 组织（图7）。3次重复试验获得的结果完全相同。结果表明，PR-1a-JA启动子不受高温和低 温的诱导。

综上，本发明所提供的诱导启动子，不仅能应答SA的诱导，而且能应答JA的诱导，还 能应答SA和JA的同时诱导。本发明所提供的启动子不受如损伤、低温、高温、高盐等非生 物胁迫的诱导。能对病原菌的诱导快速作出反应，且诱导表达部位主要集中在病原菌的侵 染部位。

含有上述任一序列的重组载体、表达盒、转化细胞系或重组菌都是本发明的保护范围。