一种可有效降低山葵多倍体植物回复突变率的培养方法

摘要

本发明公开了一种可有效降低山葵多倍体植物回复突变率的培养方法，该方法采用将山葵种子消毒后，依次用5-氨基尿嘧啶和丙二醇、胺磺灵和戊炔草胺、秋水仙素和富民隆的混合溶液进行培养，可使所得到的多倍体种子培育的多倍体幼苗的回复突变率有效降低，本发明为山葵优良品种的快速培育提供了一条新途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一种山葵植物的组织培养方法，特别是涉及一种可有效降 低山葵多倍体植物回复突变率的培养方法。

背景技术

山葵(Wasabi japonica Matsum)又名山嵛菜，为十字花科多年生草本半 阴生植物。

山葵植物的繁殖多采用分株繁殖和种子繁殖。分株繁殖不仅存在多代 营养繁殖后品种退化严重的问题，而且还存在繁殖系数低、种苗带菌严重 等问题，极易导致病害大面积发生。目前山葵资源十分稀少，远远不能满 足市场需求，所以有必要培育出优质的山葵新品种。多倍体植物具有器官 巨大性的特点，并且由于细胞染色体加倍，染色体上基因调控有效化学成 分含量也往往较正常二倍体高，因此开展山葵植物多倍体诱导对于提高其 产量和质量具有重要的作用。

从现有多倍体诱导研究中发现，多倍体诱导过程中易出现嵌合体，嵌 合体植物主要是由二倍体和多倍体细胞组成，由于嵌合体植物随着培养时 间的增长，其植物多倍体“巨大性”特征极不稳定，常表现出不同程度的 回复突变情况。这主要是由于未加倍的二倍体细胞分裂速度比诱导后的多 倍体细胞分裂速度快，因此在嵌合体植物生长过程中，二倍体细胞最终可 能会把多倍体细胞“淹没”，从而出现诱导的多倍体植物又回复变成二倍 体，最终导致植物多倍体诱导的失败。

针对上述问题，有必要提出一种能有效降低山葵多倍体植物回复突变 率的培养方法，由此引出了本发明方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可有效降低山葵多倍体植物回复突变率的 培养方法。

本发明提供的可有效降低山葵多倍体植物回复突变率的培养方法包括 如下步骤：

（1）取山葵种子，先用0.01%～0.07%的过氧乙酸消毒10～30min，再 用无菌水清洗后，置于3～10℃的条件下保存10～15天；

（2）将经低温保存的山葵种子，放在浸有5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合 溶液的滤纸上培养10～24h，培养温度为5～9℃，所述5-氨基尿嘧啶和丙 二醇混合溶液由浓度为0.5～2.5mmol.L^-1的5-氨基尿嘧啶溶液和浓度为 0.3～0.7mol.L^-1的丙二醇溶液按体积比1:（0.95～1.05）配制；

（3）将培养后的山葵种子用无菌水清洗后，置于12～18℃的条件下培 养5～9h,再转放在浸有胺磺灵和戊炔草胺混合溶液的滤纸上培养3～10h， 培养温度为4～10℃，光照强度为2000～3000lx，所述胺磺灵和戊炔草胺 混合溶液由浓度为50～100umol.L^-1的胺磺灵溶液和浓度为20～50umol.L^-1的戊炔草胺溶液按体积比1:（0.95～1.05）配制；

（4）将步骤（3）培养的种子用无菌水清洗后，转放在浸有秋水仙素和 富民隆混合溶液的滤纸上，在无光照和4～15℃的条件下进行诱导培养，所 述秋水仙素和富民隆混合溶液由浓度为0.2～0.8%的秋水仙素溶液和浓度 为0.03～0.08%的富民隆溶液按体积比1:（0.95～1.05）配制；

（5）将诱导培养2～5天的种子转放在只有无菌水的滤纸上，在温度 为8～18℃、光照强度为2500lx～3000lx、光照8～12h的条件下使其萌发 生长；

（6）选取已萌发出胚根的多倍体种子，将其置于育苗盘中进行25～35 天的多倍体幼苗的培育生长，统计山葵多倍体幼苗的回复突变率。

进一步地，步骤（2）中所述5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液由浓度 为0.5～2.5mmol.L^-1的5-氨基尿嘧啶溶液和浓度为0.3～0.7mol.L^-1的丙二 醇溶液按体积比1:1配制。

进一步地，步骤（3）中所述胺磺灵和戊炔草胺混合溶液由浓度为50～ 100umol.L^-1的胺磺灵溶液和浓度为20～50umol.L^-1的戊炔草胺溶液按体积 比1:1配制。

进一步地，步骤（4）中所述秋水仙素和富民隆混合溶液由浓度为0.2～ 0.8%的秋水仙素溶液和浓度为0.03～0.08%的富民隆溶液按体积比1:1配 制。

本发明能有效地降低山葵植物在多倍体诱导中的回复突变率，可确保 诱导的山葵多倍体植物的遗传物质的稳定性，为山葵优良品种的快速培育 提供了一条新途径。

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

具体实施方式

实施例1

（1）选取当年生饱满的山葵种子，先用0.01%的过氧乙酸消毒10min， 再用无菌水清洗2次，然后置于3℃的低温条件下保存10天；

（2）将经低温保存的山葵种子，放在浸有5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合 溶液的滤纸上培养10h，培养温度为5℃，所述5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合 溶液由浓度为0.5mmol.L^-1的5-氨基尿嘧啶溶液和浓度为0.3mol.L^-1的丙二 醇溶液按体积比1:0.95配制；

（3）将培养后的山葵种子用无菌水清洗2次后，置于12℃的条件下用 无菌水进行恢复培养5h,再转放在浸有胺磺灵溶液和戊炔草胺混合溶液的 滤纸上培养3h，培养温度为4℃，光照强度为2000lx，所述胺磺灵和戊炔 草胺混合溶液由浓度为50umol.L^-1的胺磺灵溶液和浓度为20umol.L^-1的戊炔 草胺溶液按体积比1:0.95配制；

（4）将步骤（3）培养的种子用无菌水清洗清洗2次后，转放在浸有 秋水仙素和富民隆混合溶液的滤纸上，在无光照和4℃的条件下诱导培养 2～5天，所述秋水仙素和富民隆混合溶液由浓度为0.2%的秋水仙素溶液和 浓度为0.03%的富民隆溶液按体积比1:0.95配制；

（5）将经诱导培养的种子取出，放在只有无菌水的滤纸上萌发生长， 培养条件为：温度8℃、光照强度2500lx、光照8h；

（6）选取步骤（5）中已萌发出胚根的多倍体种子，将其播种于育苗盘 中，每穴3粒种子，在温度为20℃、每天光照12h和光照强度为2500lx的 条件下培养25天，观察到山葵多倍体幼苗生长健康，统计山葵多倍体幼苗 的回复突变率为31.54%。

实施例2

（1）选取当年生饱满的山葵种子，先用0.04%的过氧乙酸消毒20min， 再用无菌水清洗3次，然后置于6℃的低温条件下保存12天；

（2）将经低温保存的山葵种子，放在浸有5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合 溶液的滤纸上培养18h，培养温度为8℃，所述5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合 溶液由浓度为1.5mmol.L^-1的5-氨基尿嘧啶溶液和浓度为0.5mol.L^-1的丙二 醇溶液按体积比1:1配制；

（3）将培养后的山葵种子用无菌水清洗3次后，置于15℃的条件下用 无菌水进行恢复培养7h,再转放在浸有胺磺灵和戊炔草胺混合溶液的滤纸 上培养7h，培养温度为6℃，光照强度为2500lx，所述胺磺灵和戊炔草胺 混合溶液由浓度为70umol.L^-1的胺磺灵溶液和浓度为40umol.L^-1的戊炔草胺 溶液按体积比1:1配制；

（4）将步骤（3）培养的种子用无菌水清洗清洗4次后，转放在浸有 秋水仙素和富民隆混合溶液的滤纸上，在无光照和8℃的条件下诱导培养4 天，所述秋水仙素和富民隆混合溶液由浓度为0.6%的秋水仙素溶液和浓度 为0.05%的富民隆溶液按体积比1:1配制；

（5）将诱导培养后的种子取出，放在只有无菌水的滤纸上萌发生长， 培养条件为：温度15℃、光照强度2800lx、光照10h；

（6）选取步骤（5）中已萌发出胚根的多倍体种子，将其播种于育苗盘 中，每穴3粒种子，在温度为20℃、每天光照12h和光照强度为2500lx的 条件下培养25天，观察到山葵多倍体幼苗生长健康，统计山葵多倍体幼苗 的回复突变率为15.54%。

实施例3

（1）选取当年生饱满的山葵种子，先用0.07%的过氧乙酸消毒30min， 再用无菌水清洗5次，然后置于10℃的低温条件下保存15天；

（2）将经低温保存的山葵种子，放在浸有5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合 溶液的滤纸上培养24h，培养温度为9℃，所述5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合 溶液由浓度为2.5mmol.L^-1的5-氨基尿嘧啶溶液和浓度为0.7mol.L^-1的丙二 醇溶液按体积比1:1.05配制；

（3）将培养后的山葵种子用无菌水清洗5次后，置于18℃的条件下用 无菌水进行恢复培养9h,再转放在浸有胺磺灵和戊炔草胺混合溶液的滤纸 上培养10h，培养温度为10℃，光照强度为3000lx，所述胺磺灵和戊炔草 胺混合溶液由浓度为100umol.L^-1的胺磺灵溶液和浓度为50umol.L^-1的戊炔 草胺溶液按体积比1:1.05配制；

（4）将步骤（3）培养的种子用无菌水清洗清洗3次后，转放在浸有 秋水仙素和富民隆混合溶液的滤纸上，在无光照和15℃的条件下诱导培养 5天，所述秋水仙素和富民隆混合溶液由浓度为0.8%的秋水仙素溶液和浓 度为0.08%的富民隆溶液按体积比1:1.05配制；

（5）将诱导培养后的种子取出，放在只有无菌水的滤纸上萌发生长， 培养条件为：温度18℃、光照强度3000lx、光照12h；

（6）选取步骤（5）中已萌发出胚根的多倍体种子，将其播种于育苗盘 中，每穴3粒种子，在温度为20℃、每天光照12h和光照强度为2500lx的 条件下培养32天，统计山葵多倍体幼苗的回复突变率为12.16%，但观察发 现山葵多倍体幼苗生长缓慢。

实施例4

将实施例2步骤（3）中所述胺磺灵溶液的浓度改为50umol.L^-1，其它 步骤同实施例2，培养后统计恢复突变率为22.43%。

实施例6

将实施例2步骤（4）中秋水仙素的浓度改为0.3%，富民隆溶液的浓度 改为0.04%，其它步骤同实施例2，培养后统计恢复突变率为26.17%。

比较实施例1

取消实施例2的步骤（2），其它步骤同实施例2，培养后统计回复突变 率为49.15%。

比较实施例2

取消实施例2的步骤（3），其它步骤同实施例2，培养后统计回复突变 率为53.01%。

比较实施例3

在实施例2步骤（4）中，改为只采用浓度为0.6%的秋水仙素溶液，不 用富民隆溶液，其它步骤同实施例（2），培养后统计回复突变率为40.23%。

比较实施例4

取消实施例2的步骤（2）和步骤（3），其它步骤同实施例2，培养后统 计回复突变率为78%。