以花丝为外植体诱导萱草红朗姆愈伤组织的方法

摘要

本发明提供一种以花丝为外植体诱导萱草‘Red Rum’愈伤组织的方法，包括外植体的采集与灭菌、花丝的获得与接种、愈伤组织的诱导培养、继代增殖培养和生根培养的步骤。本发明解决了目前萱草分株繁殖效率低、周期长的缺点，且与常规的以花茎作为外植体的组培方法相比，具有取材量更大、节约成本、灭菌效果好、愈伤组织诱导效率更高的优点，其诱导率比花茎的诱导率高出一倍左右。本发明的方法可以为以萱草花丝为基础的其他研究（例如体细胞胚的培养）等提供相关的技术支持。

说明书

技术领域

本发明涉及组织培养技术，具体地说，涉及一种以花丝为外植体诱导萱草‘Red Rum’愈伤组织的方法。 

背景技术

萱草为百合科萱草属多年生花卉，是中国的传统名花。萱草花叶兼美，花色花形丰富、观赏性高、观赏期长、适应性强，应用方式多样，尤其是作为地被植物被广泛用在花坛、花境等城市绿化和园林景观建设中。随着育种技术的不断进步，萱草的新品种也层出不穷。萱草‘Red Rum’为荷兰引进的品种，植株健壮，具有很高的观赏性，6月中旬现蕾，六月底至七月中旬为盛花期，七月底至八月中旬为末花期。株高50cm左右，花葶高50cm，叶绿色，叶长60cm，宽3cm，着花平均20朵，红色，艳丽，花径10cm左右。可以作为一种优良的地被广泛地应用于城市园林绿化中。然而，‘Red Rum’自然结实率低，传统的分株繁殖方法繁殖周期长、繁殖倍数低，难以满足工厂化生产的需要，限制了其在园林绿化中的快速应用。组织培养作为一种快速繁殖技术，是解决这一问题的有效途径。 

近年来国内关于萱草的组培研究也较多，但组培方法大同小异，常用的外植体种类也多集中在茎段、花蕾等材料上（例如，何秋月等2011年已对‘御衣黄’的花蕾为外植体诱导出愈伤组织；李秀华、宋阳、兰丽婷等通过茎段诱导出了愈伤组织），少数可以通过新叶、子房、花瓣获得愈伤组织，进而获得组培幼苗（Zhiwu Li等2010年通过幼叶诱导出了愈伤；安凤霞等2008年通过根段成功诱导出了红花萱草的愈伤）。但萱草的组培阶段极少对花丝进行研究。萱草中对花丝的研究多集中在体胚培养领域，在非胚性愈伤方面，高淑滢等2009年对‘金 娃娃’萱草的不同外植体的愈伤发生情况进行对比实验，其中花丝在含有不同浓度6-BA、KT、IBA激素的培养基中培养一段时间以后，花丝虽然有膨大变形，但是都没有愈伤组织产生，后逐渐枯萎死亡。 

目前尚未见关于通过萱草花丝获得非胚性愈伤组织，进一步获得组培幼苗的研究报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种以花丝为外植体诱导萱草‘Red Rum’愈伤组织的方法。 

为了实现本发明目的，本发明的以花丝为外植体诱导萱草‘Red Rum’愈伤组织的方法，包括以下步骤： 

1）外植体的采集与灭菌：采集长度为1.0～2.5cm的生长发育正常的萱草‘Red Rum’花蕾，用毛笔蘸取低浓度的洗洁精溶液进行初步的表面清洁，然后用水冲洗，依次置于75%～85%酒精（优选75%酒精）中10～20s（优选15s），1%NaClO溶液中8～15min（优选10min），进行灭菌，获得无菌花蕾； 

2）花丝的获得与接种：在无菌环境下，切除上述无菌花蕾底部花托部分，剖开花被，取出花丝，同时去除花丝下部与花托相连接的部分以及花丝上部与花药相连接的部分，取中段的花丝作为外植体；将作为外植体的花丝的形态学下端向下接种到诱导培养基中培养，将花丝下部约1/3的部分插入培养基中； 

3）愈伤组织的诱导培养：上述诱导培养基为MS培养基中添加了浓度为0～1.0mg/L的6-苄基嘌呤、0.5～2.0mg/L的二氯苯氧乙酸、30g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂，pH值6.15，培养至愈伤组织出现； 

4）继代增殖培养：将愈伤组织转移至增殖培养基中，进行增殖培养，每隔28～30天（优选30天）继代一次，继代一至三次（优选继代三次）； 

5）生根培养：将继代增殖后生长良好的组培幼苗去除愈伤组织 后转入空白MS培养基中培养两周后，再转入生根培养基中进行生根培养。 

其中，步骤3）-5）中培养条件为：23±1℃，光照强度2000-3000Lx，光照周期16/8h。 

步骤4）中增殖培养基为MS培养基中添加了浓度为0.5～2.0mg/L的6-苄基嘌呤、0.01～0.1mg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂，pH值6.15。 

步骤5）中生根培养基为1/2MS培养基中添加了浓度为0～0.2mg/L的吲哚丁酸、0～0.2mg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂，pH值6.15。 

步骤2）中接种使用的培养容器为直径为12cm的培养皿，其中添加的培养基厚度为0.7～1.0cm；步骤3）-5）中使用的培养容器为100mL的锥形瓶，培养基厚度为0.7～1.0cm。 

优选地，步骤3）中使用的诱导培养基为：MS+1.0mg/L6-苄基嘌呤+0.5mg/L二氯苯氧乙酸＋30g/L蔗糖＋7.0g/L琼脂，pH值6.15。 

步骤4）中使用的增殖培养基为：MS+1.0mg/L6-苄基嘌呤+0.01mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，pH值6.15；或MS+2.0mg/L6-苄基嘌呤+0.01mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，pH值6.15。 

步骤5）中使用的生根培养基为：1/2MS+0.1mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂。 

本发明中所述MS培养基为： 

大量元素：NH₄NO₃1650mg/L、KNO₃1900mg/L、CaC1₂·2H₂O440mg/L、MgSO₄·7H₂O370mg/L、KH₂PO₄170mg/L； 

微量元素：KI0.83mg/L、H₃BO₃6.2mg/L、MnSO₄·4H₂O22.3mg/L、ZnSO₄·7H₂08.6mg/L、Na₂MnO₄·2H₂O0.25mg/L、CuSO₄·5H₂O0.025mg/L、CoC1₂·6H₂O0.025mg/L； 

铁盐：FeSO₄·7H₂O27.8mg/L、Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg/L； 

有机物质：肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸毗哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸2.0mg/L。 

本发明还提供用于以花丝为外植体诱导萱草‘Red Rum’愈伤组织的培养基，包括上述三种培养基，即愈伤组织的诱导培养基、继代增殖培养基和生根培养基。 

本发明针对国内萱草在花丝组培技术方面的空白，提供一种以花丝为外植体进行萱草‘Red Rum’愈伤组织诱导的方法，该方法具有取材量更大、节约成本、灭菌效果好、愈伤组织诱导效率更高的优点，其诱导率比花茎的诱导率高出一倍左右。 

本发明所述的方法，是以萱草‘Red Rum’1.0～2.5cm花丝为外植体进行组织培养、获得组培苗的方法，包括下述步骤：（1）外植体的采集与灭菌；（2）花丝的获得与接种；（3）愈伤组织的诱导培养；（4）愈伤组织的增殖培养；（5）组培苗的生根培养。 

步骤（1）外植体的采集与灭菌：在六月下旬萱草‘Red Rum’开始现蕾的时候，选择晴朗的中午，在田间采集长度在1.0～2.5cm左右的发育正常的花蕾，用毛笔在低浓度的洗洁精溶液中进行初步的表面清洁，然后用自来水冲洗2h，然后转移到超净工作台上，采用75%酒精震荡灭菌20s，无菌水冲洗2次，然后放入浓度为1.0%的NaClO中灭菌10min，采用上述组合灭菌方法，最终获得无菌花蕾。 

步骤（2）花丝的获得与接种：在无菌环境下，用解剖刀将无菌花蕾底部花托部分切除，剖开花被，用镊子小心取出花丝，同时要去除花丝下部与花托相连接的部分和花丝上部与花药相连接的部分，得到相应的花丝作为外植体。将获得的花丝小心接种到相应的诱导培养基上，接种时要注意将花丝的形态学下端向下插入到培养基中进行培养。将花丝下部约1/3的部分插入培养基中，不要全部插入。 

步骤（3）愈伤组织的诱导培养：将上一步获得的花丝接种在添加了浓度为0～1.0mg/L的6-苄基嘌呤（6-BA）、0.5～2.0mg/L的二氯苯 氧乙酸（2,4-D）、30g/L的蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基中进行培养，60天以后即可有较多的愈伤组织出现。待花丝底部长出了较多的愈伤、且愈伤上有较多的芽点出现的时候，将愈伤组织转移到增殖培养基上进行后续的增殖培养。 

步骤（4）愈伤组织的增殖培养：将上一步获得的花丝接种在添加了浓度为0.5～2.0mg/L的6-苄基嘌呤（6-BA）和0.01～0.1mg/L的萘乙酸（NAA）、30g/L的蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基中进行增殖培养，每隔30天继代一次。 

步骤（5）组培苗的生根培养：将生长情况较好的组培幼苗去除愈伤组织后转入空白MS培养基中培养两周，以消除前摄激素的影响。然后转入生根培养基中进行生根培养。 

实验证明，当选择的激素浓度分别为6-BA1.0mg/L和2,4-D0.5mg/L时，获得的愈伤组织的诱导率最高，因此步骤（3）中最佳诱导培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D＋30g/L蔗糖＋7.0g/L琼脂。 

当选择的激素浓度为6-BA1.0mg/L和0.01mg/L NAA时，或者6-BA2.0mg/L和0.01mg/L NAA时，可以获得最高的增殖率。因此，步骤（4）中最佳增殖培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.01mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂或MS+2.0mg/L6-BA+0.01mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂。步骤（5）中最佳生根培养基为1/2MS+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L。 

步骤（3）中，经过愈伤组织诱导的培养发现，在愈伤组织产生一段时间以后，会逐渐分化出芽点，后期芽点与愈伤组织同时生长，因此不需要进行单独的丛生芽的分化的诱导，而可以直接进行丛生芽的增殖培养。 

上述启动培养阶段，采用的培养基为固体培养基，培养容器为培养皿，培养基厚度在1.0cm左右；增殖培养阶段，采用的培养基为固 体无菌培养基，培养容器为100mL的锥形瓶。其余培养环境均为温度23±1℃，光照强度2000-3000Lx，光照周期16/8h。 

发明人经过大量的实验对比，通过对萱草‘Red Rum’进行不同激素、不同外植体的组培研究，摸索出了通过花丝进行愈伤组织诱导的一个新的萱草的组培途径。 

本发明的优点是取材量相对传统的花茎来说，具有取材量更大、灭菌效果好、愈伤组织诱导效率更高的优点，其诱导率比花茎的诱导率高出一倍左右。同时，由于初期所需的培养基量更少，约为花茎所需培养基的1/12，减少了配置培养基与转瓶的步骤，因此更为节省劳动力。同时，此技术可以为今后以萱草花丝为外植体的其他方面的组培研究提供参考借鉴。 

本发明所述的方法，在步骤（5）之后还可进行进一步的炼苗移栽，由于这些部分已有研究，因此不在本发明中赘述。 

附图说明

图1-2为本发明萱草‘Red Rum’的花丝在启动培养基中培养60天时候的生长状况，可以看到花丝在培养基中都有不同程度的愈伤组织的产生，并有幼嫩芽的出现。 

图3为本发明田间采集的经愈伤组织诱导后发育形成的萱草‘Red Rum’的花枝。 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。 

实施例1以花丝为外植体诱导萱草‘Red Rum’愈伤组织的方法 

（1）外植体的采集与灭菌 

在六月下旬萱草‘Red Rum’初花时期，选择晴朗的中午，采取长度在1～2.5cm左右的发育正常的花蕾，在低浓度的洗洁精溶液中浸泡5 分钟左右，并用毛笔进行初步的表面清洁，然后将外植体置于瓶中，用自来水冲洗2～3h。完成初步清洁以后将花蕾转移到超净工作台上，采用组合灭菌方法，将5个花蕾一组，放入盛有80mL75%酒精的锥形瓶中，轻轻震荡20s，倒出酒精，加入60mL无菌水冲洗2遍，倒出无菌水以后，然后想锥形瓶中加入80mL1.0%的NaClO溶液，灭菌10min，期间可以轻轻震荡锥形瓶，以保证花蕾表面与溶液充分接触。 

（2）花丝的获得与接种 

在无菌环境下，将上一步锥形瓶中的NaClO溶液倒出，用镊子小心取出花蕾，注意花蕾不要接触到锥形瓶口。将花蕾置于无菌滤纸之上，用解剖刀将花蕾底部花托部分切除，然后剖开花被，用镊子小心取出花丝，得到相应的花丝作为外植体。要注意，尽可能取得完整的花丝，同时要去除花丝下部与花托相连接的部分和花丝上部与花药相连接的部分。将获得的花丝小心接种到相应的诱导培养基上，接种时要注意将花丝的形态学下端向下插入到培养基中。将花丝下部约1/3的部分插入培养基中即可，不要全部插入。每个直径为12cm的培养皿中接种12根花丝。 

（3）愈伤组织的诱导培养 

将上一步获得的花丝接种在添加了不同浓度的6-苄基嘌呤（6-BA）（浓度分别为0mg/L、1.0mg/L）、二氯苯氧乙酸（2,4-D）（浓度分别为0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L）和萘乙酸（NAA）（浓度分别为0mg/L、0.2mg/L）的培养基中，进行培养。愈伤组织诱导培养基中添加的激素如表1所示。 

表1愈伤组织诱导培养基中添加的激素含量 

60天后观察，在添加了浓度为1.0mg/L的6-苄基嘌呤（6-BA）、 0.5mg/L的二氯苯氧乙酸（2,4-D）、30g/L的蔗糖和7.0g/L琼脂的培养基中，有较多的愈伤组织出现。（表2，图1-2） 

表2不同愈伤组织诱导培养基中形成愈伤组织的情况 

此种诱导培养基中，花丝获得的愈伤组织发生率可达到82.32%。 

待花丝底部长出了较多的愈伤、且愈伤上有较多的芽点出现的时候，将愈伤组织转移到增殖培养基上进行后续的增殖培养。经观察，通过花丝获得的愈伤组织可以培养出正常的组培幼苗。 

培养环境为温度23±1℃，光照强度2000-3000L，光照周期16/8h。 

（4）丛生芽的增殖培养 

上一步中，愈伤组织的发生和丛生芽的出现几乎是同时的。所以，将上一步实验中获得的丛生芽转移到增殖培养基中进行增殖培养。丛生芽的增殖培养采用二因素三水平完全随机区组实验设计，以MS为基本培养基，选用6-AB、NAA两种激素进行丛生芽继代增殖培养，6-BA选用0.5、1.0、2.0mg/L，NAA选用0.01、0.05、0.1mg/L三水平。每种培养基接种6瓶，每瓶内含3块生长情况近似的带有芽的愈伤块。每四周继代一次，连续培养三个月以后，分别统计从生芽增殖倍数和不定芽长势。（表3） 

表3不同增殖培养基中从生芽增殖倍数和不定芽长势情况 

通过表3可以看出，6-BA和NAA对丛生芽的增殖都有显著影响。随着NAA浓度的增加，丛生芽的增殖倍数下降，在浓度为0.01mg/L时丛生芽的增殖倍数最高。6-BA浓度的变化对丛生芽增殖倍数有较大的影响，随6-BA浓度的增加，丛生芽的增殖倍数先上升、后下降，在6-BA浓度为1.0mg/l时，丛生芽的增殖倍数最高。平均增殖倍数以J7和J4的较高，并且这两种培养基中丛生芽均较为健壮。另外，除J9外，各增殖培养基中丛生芽在经过三次继代后，增殖倍数都有一定程度的下降，最后都达到2.1左右。 

综合以上情况，MS+1.0mg/L6-BA+0.01mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂和MS+2.0mg/L6-BA+0.01mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂为最佳增殖培养基。 

（5）生根培养 

将增殖后获得的较为健壮的组培苗去除愈伤组织后转入空白MS培养基中培养两周，以消除前摄激素的影响。然后转入生根培养基中（G1-G6都是以1/2MS为基本培养基）。所有的生根培养基都添加30g/L的蔗糖和6.5g/Ld琼脂。20天后统计生根情况，结果如表4所示。 

表4生根培养情况 

注：生根率=已生根组培苗数/组培苗总数；平均单株根数=根总数/已生根组培苗数；平均单株根长=根总长/生根苗总数；平均单根长=根总长/根总数。 

从表4可以看出，在植株生根过程中，NAA对生根的促进作用明显高于IBA。添加了NAA的1/2MS比空白的1/2MS和MS中组培苗的生根率更高，说明NAA对根的形成有显著的促进作用。在NAA浓度为0.1mg/L时生根率最高，且植株生根数与根长都是最大的。IBA在浓度为0.05mg/L时，根的诱导率也高于空白1/2MS，而浓度升高时根的诱导率开始低于空白1/2MS，说明IBA只有在低浓度时才能促进根的形成，浓度高了反而会有抑制作用。从生根所用时间来看，添加了NAA的培养基中，组培苗生根所用时间明显较短。另外，组培苗的根在空白MS中比1/2MS中生长情况较好，说明在生根初期，充足的大量元素也可以在一定程度上促进根的生长。总体来看，不论是从生根率、根数还是单根长的角度来看，第二种培养基都有较为明显的优势，因此Hemerocallis'Red Rum'的最佳生根培养基为1/2MS+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L。 

（6）本发明还对萱草‘Red Rum’的花茎进行了组织培养研究（高凤，2012）。在愈伤组织的发生阶段，采用了不同的培养基。实验情况如下：采用三因素三水平正交实验设计，以MS为基本培养基，6-BA和KT分别选用0、1.0、2.0mg/L三个水平，NAA选用0.05、0.10、0.20mg/L三个水平。对萱草的花丝、花茎进行培养。4周以后观察统计，发现花丝在所有的培养基中都不能产生愈伤组织，最终枯萎死亡。花茎在含有1.0mg/L6-BA和0.2mg/L NAA的培养基中产生的愈伤组织最多，愈伤诱导率为44.4%。 

关于这两种不同类型外植体的研究，可以通过一组对比，来进一步了解花丝作为外植体进行愈伤组织诱导的优势（表5）。 

以一枝含有四个花蕾的花茎（图3）为例： 

表5愈伤组织诱导情况比较 

对比项目 花茎 花丝 可用外植体个数 3 18～24 灭菌后外植体成活率 62.26% 100.00% 启动率 44.4% 82.3% 启动时间 18天 62天 培养阶段所用容器 锥形瓶 12cm培养皿 每个容器可培养的外植体个数 3 12 每50mL培养基可以培养的外植体个数 3 12

通过比较可以看出，以花丝作为外植体的情况下，可以取得更多数量的外植体，获得更高的愈伤诱导率和存活率。启动阶段，花丝所需的培养基更少，因此可以大大减少培养基的配制，减少转瓶次数，因此更为节约资源与人力。经后期实验观察，花丝获得的愈伤组织经过增殖培养以后，可以长出正常的组培幼苗。 

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。