磷酸化-Akt作为药物响应的生物标志物的用途

摘要

本发明公开磷酸化-Akt作为预测对化合物的响应(例如耐药性)的生物标志物的用途，其中磷酸化-Akt为在一或多个残基上被磷酸化的Akt，前提是对于Akt1、Akt2和Akt3而言，名称磷酸化-Akt用于表示磷酸化的位点分别不是T308、T309或T305，其中所述化合物为通式I化合物，在式I中，R代表苯基、噻吩基或吡啶基，其中苯基任选被1或2个独立选自下列的取代基所取代：烷基、卤代-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基(其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基)、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧基羰基、氰基、卤素和硝基；并且其中两个相邻取代基为亚甲基二氧基；其中吡啶基任选被低级烷氧基、氨基或卤素取代；X代表基团C＝Y，其中Y代表被羟基或低级烷氧基取代的氧或氮；R1代表氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基；R2、R3和R6代表氢；R4和R5彼此独立代表氢、低级烷基或低级烷氧基；或者R4和R5一起代表亚甲基二氧基；及其可药用的衍生物；或者其中，R代表苯基或吡啶基，其中苯基任选被1或2个独立选自下列的取代基所取代：烷基、卤代-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基(其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基)、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧基羰基、甲酰基、氰基、卤素和硝基；并且其中两个相邻取代基为亚甲基二氧基；其中吡啶基任选被低级烷氧基、氨基或卤素取代；X代表氧；R1代表氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基；R2、R3和R6代表氢；R4和R5彼此独立代表氢、低级烷基或低级烷氧基；或者R4和R5一起代表亚甲基二氧基；及其可药用的衍生物。本发明也公开了采用这些化合物治疗肿瘤和自身免疫疾病的方法。

说明书

本发明涉及磷酸化-Akt作为生物标志物用于预测疾病例如肿瘤或自身免疫性疾病(优选癌症)对通式I化合物(例如3-(4-{1-[2-(4-氨基-苯基)-2-氧代-乙基]-1H-苯并咪唑-2-基}-呋咱-3-基氨基)-丙腈(BAL27862))的响应的用途。在其它方面，本发明还涉及方法和试剂盒，以及与生物标志物有关的治疗方法。 

微管是细胞骨架的组件之一，由α-和β-微管蛋白的异源二聚体组成。靶向微管的药物是最有效的细胞毒化疗剂之一，具有广谱活性。微管去稳定剂(如长春花生物碱，例如长春花碱、长春花碱和长春瑞滨)用于例如治疗多种血液系统恶性肿瘤(如淋巴母细胞性白血病和淋巴瘤)以及实体瘤(例如肺癌)。微管稳定剂(如紫杉烷类化合物，例如紫杉醇、多西他赛)用于例如治疗实体肿瘤，包括乳腺癌、肺癌和前列腺癌。 

然而，可能发生对这些已知的微管靶向试剂的耐药性。耐药性可以是固有的，或在暴露于这些药物后获得的。因此，此类耐药性影响患者的存活率以及对治疗方案的选择。已经确定了几个可能的耐药机制，包括微管靶点的缺陷，例如β-微管蛋白亚型III水平升高和β-微管蛋白亚型I的获得性突变，后者已知能降低紫杉烷的结合。此外，其他细胞蛋白的缺陷据报道可能与对某些微管靶向剂的耐药性相关，例如外排泵P-糖蛋白(P-gp，也称为多药耐药蛋白1或MDR1)的过表达。因此，这些因素可能被用来作为对这些传统微管靶向剂耐药性的生物标志物。 

近期发现的一类微管去稳定剂是下面给出的通式所包括的化合物： 

其中 

R代表苯基、噻吩基或吡啶基， 

其中苯基任选被1或2个独立选自下列的取代基所取代：烷基、卤代-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基(其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基)、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧基羰基、氰基、卤素和硝基；其中两个相邻取代基为亚甲基二氧基； 

且其中吡啶基任选被低级烷氧基、氨基或卤素取代； 

X代表基团C＝Y，其中Y代表被羟基或低级烷氧基取代的氧或氮； 

R¹代表氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基； 

R²、R³和R⁶代表氢； 

R⁴和R⁵彼此独立代表氢、低级烷基或低级烷氧基； 

或者R⁴和R⁵一起代表亚甲基二氧基； 

及其可药用的盐， 

或者其中： 

R代表苯基或吡啶基， 

其中苯基任选被1或2个独立选自下列的取代基所取代：烷基、卤代-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基(其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基)、低级 烷基羰基、羧基、低级烷氧基羰基、甲酰基、氰基、卤素和硝基；其中两个相邻取代基为亚甲基二氧基； 

并且其中吡啶基任选被低级烷氧基、氨基或卤素取代； 

X代表氧； 

R¹代表氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基； 

R²、R³和R⁶代表氢； 

R⁴和R⁵彼此独立代表氢、低级烷基或低级烷氧基； 

或者R⁴和R⁵一起代表亚甲基二氧基； 

及其可药用的盐； 

并且其中所述前缀“低级”表示具有最多7个并包括7个，尤其是最多4个并包括4个碳原子的基团。 

这些化合物公开在WO2004/103994A1中，在此通过交叉参考引入本文。已证明这些化合物可阻止肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡。 

式I化合物的合成在WO2004/103994A1第29-35页一般地描述，具体描述是在第39-55页，其通过交叉参考的方式并入本文。它们可以如其中所公开的那样制备，或通过与其中描述的方法类似的方法制备。 

属于这一类的一种化合物称为BAL27862，并在WO2004/103994A1作为实施例58显示，其特别引入本文作为参考，具有如下给出的结构及化学名称： 

化学名：3-(4-{1-[2-(4-氨基-苯基)-2-氧代-乙基]-1H-苯并咪唑-2-基}-呋咱-3-基氨基)-丙腈；或在本文中称为化合物A。 

其他的化合物分别例示在WO2004/103994A1的实施例50和79中，并且也通过交叉参考引入本文，其具有如下给出的结构和化学名： 

化学名：2-[2-(4-氨基-呋咱-3-基)-苯并咪唑-1-基]-1-(4-氨基-苯基)-乙酮；或在本文中称为化合物B， 

和 

化学名：3-(4-{1-[2-(6-氨基-吡啶-3-基)-2-氧代-乙基]-1H-苯并咪唑-2-基}-呋咱-3-基氨基)-丙腈；或在本文中称为化合物C。 

BAL27862在实体瘤异种移植模型的广泛实验中具有活性。此外，即使对于被选择用于对传统微管靶向剂(包括长春花生物碱类的微管去稳定剂和微管稳定剂紫杉醇和埃坡霉素B)具有耐药性的肿瘤模型，也保持有活性。在任何体外测试模型以及人乳腺肿瘤异种移植物模型中，BAL27862的活性均不受P-gp泵过度表达的影响。而且，即使β-微管蛋白亚型III水平升高并且在微管蛋白亚型I中有突变，BAL27862仍然保持其活性。 

因此，BAL27862活性不受引起对传统微管靶向剂耐药性的一些因素的影响。 

此外，已知与其他微管靶向剂(包括其他微管去稳定剂)相比，通式I化合物对细胞表型具有不同的作用。在衍生自各种器官例如肺、子宫颈和乳腺的肿瘤细胞系中，通式I化合物的治疗能够诱导一致的微管表型，如图1所示。用抗-α-微管蛋白抗体在这些细胞中对微管染色显示，在处理后的细胞中只有点状结构 可见，而不是未经处理的细胞中的有丝分裂纺锤体纤维。这种相同的效果还显示在用化合物C和B处理肺癌细胞系A549时，分别如图2A和2B所示。然而，这与分别显示在图3B、3C、3D和4中的传统微管靶向剂长春花碱、秋水仙素、紫杉醇和诺考达唑的观察结果非常不同。微管用抗-α-微管蛋白抗体染色，并在1000×放大倍数下观察细胞(图3、4)。对于用BAL27862处理的细胞，可见多个点状结构，而与之形成鲜明对比的是，其他传统药物产生丝状微管结构，或密集的微管聚集结构。这些在表型水平上、在被认为抗增殖作用最佳的化合物剂量下表现出的差异，表明了在分子水平上的作用方式的不同。 

此外，已知BAL27862在其他微管靶向剂的存在下引发显性微管表型。用长春花碱、秋水仙素、紫杉醇或诺考达唑单独治疗诱导这些药物的微管表型特征(分别如图5A、5D、5G、6C-6F所示)。然而，在最后的4小时与BAL27862联合治疗导致这些表型的破坏，尽管长春花碱、秋水仙素、紫杉醇或诺考达唑继续存在(分别为图5B、5E、5H、6G-6J)。相反，先用BAL27862处理并随后与长春花碱、秋水仙素、紫杉醇或诺考达唑联合处理4小时对表型的产生没有任何影响，其与BAL27862处理一致(分别为图5C、5F、5I、6K-6N)。 

这些数据都表明BAL27862以与传统微管靶向剂不同的方式影响微管的生物学。 

因此，从传统微管靶向剂有关的信息，无法预测特定基因是否或如何参与通式I化合物的作用。 

本发明的一个目的是鉴定与对式I化合物或其可药用衍生物的响应相关的因素，例如，鉴定与如下文定义的通式I化合物、尤其是BAL27862或其可药用衍生物耐药性相关联的因素。 

令人惊奇地发现，磷酸化-Akt可以用作对下文定义的通式I化合物或其可药用衍生物治疗的响应的生物标志物。 

在本发明的一个优选的实施方案中，肿瘤样本中相对高的磷酸化-Akt水平与对BAL27862的固有抗性相关。 

迄今为止，Akt家族包括三种已知的基因，也称为同工型Akt1、Akt2和Akt3。这些基因在核酸水平以及多肽序列水平上是同源的。Akt基因也有多种别名，反映了发现其的不同群体。名称Akt是由于其作为转化逆转录病毒AKT8的原癌基因的人同源物而发现的。Akt也称为蛋白激酶B或RAC(与A和C激酶有关)，因为这些Akt蛋白与蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)密切相 关。因此，Akt家族也有下列同义词：c-AKT；原癌基因c-Akt；蛋白激酶B；PKB；RAC；RAC丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶；rac蛋白激酶和RAC-PK。Akt1是第一个被发现的基因，也称为c-AKT1；PKB；PKB-α；PRKBA；RAC；RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶；RAC-ALPHA；RAC-PK-α和MGC99656。Akt2也称为蛋白激酶Akt-2；蛋白激酶Bβ；PKBBETA；PRKBB；RAC-BETA；RAC-β丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶和RAC-PK-β。Akt3也称为PKB-γ；PKBG；PRKBG；RAC-γ丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶；RAC-γ；RAC-PK-γ；DKFZP434N0250和STK-2。也已经发现了某些此类基因的选择性剪接转录变体。已经公开了Akt3的编码的不同的同工型的选择性剪接转录变体，称为RAC-γ丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶同工型1和RAC-γ丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶同工型2，其长度不同。名称Akt在本文中应当包括三种相关的蛋白Akt1、Akt2、Akt3以及所有上述同义词，包括同工型。 

Akt可以转译后被修饰，包括在一或多个位点被磷酸化。例如已知Akt1能够在Ser-124、Thr-308、Thr-450和Ser-473被磷酸化。一个以上的位点可以同时被磷酸化。Akt功能的调节已经被具体确定与两个位点的磷酸化有关：苏氨酸：T308(Akt 1)、T309(Akt 2)、T305(Akt 3)；丝氨酸：S473(Akt 1)、S474(Akt 2)、S472(Akt 3)。 

据认为磷酸肌醇依赖性激酶1(PDK1)可能使得苏氨酸308被磷酸化，而mTOR复合体2(mTORC2)最近被确定为PDK2，因为它可能使得Akt 1的丝氨酸473被磷酸化。 

本文中使用的磷酸化-Akt是指在一或多个残基上被磷酸化的Akt，前提是对于Akt1、Akt2和Akt3而言，名称磷酸化-Akt是用于指明磷酸化的位点并非分别为T308、T309或T305。为了进一步说明上述观点，磷酸化-Akt可能会或者可能不会在Akt1、Akt2和Akt3的各个T308、T309或T305位点被磷酸化，而名称磷酸化-Akt说明磷酸化的位点不是这些位点。磷酸化-Akt也可以任选以任何并非磷酸化的方式被转译后修饰。 

更优选磷酸化-Akt应当是指在下列丝氨酸残基上被磷酸化的Akt： 

对于Akt1：S473； 

对于Akt2：S474；且 

对于Akt3：S472。 

因此，该优选的实施方案不包括由RAC-γ丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶同工型2编码的Akt3，因为它不具有丝氨酸472。 

编码人Akt1、Akt2和Akt3的蛋白序列可以获自国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)编号： 

Akt1：NP_005154.2，参见SEQ.ID.No.1(也参见NP_001014431和NP_001014432；)， 

Akt2：NP_001617.1，参见SEQ ID No.2，和 

Akt3：NP_005456.1：RAC-γ丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶同工型1，参见SEQ ID No.3。 

本发明的一个方面涉及磷酸化-Akt作为预测对化合物响应的生物标志物的用途， 

其中磷酸化-Akt是在一或多个残基上被磷酸化的Akt，前提是对于Akt1、Akt2和Akt3而言，名称磷酸化-Akt用于什么磷酸化的位点分别不是T308、T309或T305， 

其中所述化合物为通式I化合物： 

其中： 

R代表苯基、噻吩基或吡啶基， 

其中苯基任选被1或2个独立选自下列的取代基所取代：烷基、卤代-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基(其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基)、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧基羰基、氰基、卤素和硝基；并且其中两个相邻取代基为亚甲基二氧基； 

其中吡啶基任选被低级烷氧基、氨基或卤素取代； 

X代表基团C＝Y，其中Y代表被羟基或低级烷氧基取代的氧或氮； 

R¹代表氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基； 

R²、R³和R⁶代表氢； 

R⁴和R⁵彼此独立代表氢、低级烷基或低级烷氧基； 

或者R⁴和R⁵一起代表亚甲基二氧基； 

及其可药用的衍生物； 

或者其中： 

R代表苯基或吡啶基， 

其中苯基任选被1或2个独立选自下列的取代基所取代：烷基、卤代-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基(其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基)、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧基羰基、甲酰基、氰基、卤素和硝基；并且其中两个相邻取代基为亚甲基二氧基； 

其中吡啶基任选被低级烷氧基、氨基或卤素取代； 

X代表氧； 

R¹代表氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基； 

R²、R³和R⁶代表氢； 

R⁴和R⁵彼此独立代表氢、低级烷基或低级烷氧基； 

或者R⁴和R⁵一起代表亚甲基二氧基； 

及其可药用的衍生物； 

其中前缀“低级”表示具有最多7个并包括7个碳原子的基团，尤其是最多4个并包括4个碳原子的基团。 

优选地，所述响应可以是个体的疾病的响应。还优选所述响应是对治疗的响应，即对用通式I化合物或其可药用衍生物的治疗的响应。 

在从人体或动物体(优选从人体)获得的样本或多个样本中离体测定生物标志物磷酸化-Ak。所述样本预先获自人体或动物体，优选预先获自人体。 

在一个优选的实施方案中，本发明涉及磷酸化-Akt作为预测个体的疾病对如上文所定义的通式I化合物或其可药用衍生物的耐药性的生物标志物的用途。 

优选的可药用衍生物选自通式I化合物的盐、溶剂化物、前药、前药的盐、多晶型物和异构体。前药优选为天然氨基酸的酯和酰胺、小肽或聚乙二醇化羟基酸。更优选前药是由存在于通式I化合物R基团内的氨基与甘氨酸、丙氨酸或赖氨酸的羧基形成的酰胺。 

特别优选下列化合物： 

或其可药用的盐，优选其盐酸盐，最优选其二盐酸盐。 

本发明另一方面涉及用于预测个体的疾病对如上述定义的通式I化合物或其可药用衍生物的响应的方法，其包括以下步骤： 

a)测定预先从个体获得的样本中的磷酸化-Akt水平，以获得代表该水平的一个或多个值；以及 

b)将步骤a)的一个或多个值与标准值或一组标准值相比较。 

更优选待预测的响应是耐药性。 

磷酸化-Akt水平的测定用预先从个体获得的一个样本离体进行。预先获得是指，在对个体进行涉及测定生物标志物水平的任何方法之前获得的样本，而且预先获得不能理解为与治疗相关。 

在优选的实施方案中，相对于标准值或一组标准值而言，从个体获得的样本中的磷酸化-Akt水平较高预示了耐药性。 

还优选所述疾病是肿瘤或自身免疫性疾病。更优选的疾病是癌症。特别优选癌症选自乳腺癌、前列腺癌、子宫颈癌、胃癌、卵巢癌、结肠直肠癌(即包括结肠癌和直肠癌)、胰腺癌，肝癌、脑癌、神经内分泌癌、肺癌、肾癌、血液系统恶性肿瘤、黑色素瘤和肉瘤。更特别优选癌症选自乳腺癌、子宫颈癌、胃 癌、肺癌、结肠直肠癌和黑素瘤。特别优选癌症选自胃癌、肺癌、结肠直肠癌和黑素瘤。 

在另一方面，本发明涉及在需要的个体中治疗肿瘤或自身免疫性疾病(优选癌症)的方法，其包括：测定个体样本中的磷酸化-Akt水平以获得代表这一水平的一个或多个值，如果所述样本中磷酸化-Akt的水平不高于标准值或一组标准值，则可以采用如上文所定义的通式I化合物或其可药用衍生物治疗该个体。 

另一方面，本发明涉及用于治疗肿瘤或自身免疫性疾病(优选癌症)的如上文所定义的磷酸化-Akt，其包括：测定个体样本中的磷酸化-Akt水平以获得代表这一水平的一个或多个值，如果磷酸化-Akt的水平不高于标准值或一组标准值，则用如上文所定义的通式I化合物或其可药用衍生物治疗该个体。 

磷酸化-Akt水平的测定在预先从个体获得的一个样本中离体进行。 

另一方面，本发明还涉及治疗肿瘤或自身免疫性疾病(优选癌症)的方法，其包括首先降低其样本具有比标准水平或一组标准水平高的磷酸化-Akt水平的个体的如上文所定义的磷酸化-Akt水平，然后用如上文定义的通式I化合物或其可药用衍生物治疗该个体。 

另一方面，本发明涉及预测对如上文定义的通式I化合物或其可药用衍生物的响应的试剂盒，其包含测定样本中磷酸化-Akt水平所必需的试剂。更优选该试剂盒还包含比较器模块(comparator module)，其包括用于将样本中的磷酸化-Akt水平与之进行比较的一个或一组标准值。 

更优选该试剂盒包含如上文所定义义的通式I化合物或其可药用衍生物。在一个特别优选的实施方案中，该试剂盒包含下式化合物或其可药用盐： 

化学名：S-2，6-二氨基-己酸[4-(2-{2-[4-(2-氰基-乙基氨基)-呋咱-3-基]-苯并咪唑-1-基}乙酰基)-苯基]-酰胺。 

在一个特别优选的实施方案中，所述可药用盐是二盐酸盐。 

本发明的另一方面涉及用于预测对如上定义的通式I化合物或其可药用衍生物的响应的装置，其包含测定样本中磷酸化-Akt水平所必需的试剂以及比较器模块，所述比较器模块包括用于将样本中的磷酸化-Akt水平与之进行比较的一个或一组标准值。 

在一个优选的实施方案中，该试剂盒或装置中的试剂包括捕获试剂以及检测试剂，其中所述捕获试剂包含磷酸化-Akt的检测剂。特别优选所述捕获试剂是抗体。还优选的是，当磷酸化-Akt水平高于一个或一组标准值时，该疾病被预测为对所述化合物的治疗有耐药性。在优选的实施方案中，比较器模块包含在试剂盒的使用说明中。在另一个优选的实施方案中，比较器模块为显示装置的形式。 

现在通过实例的方式，参照附图描述本发明的实施方案。然而，本发明不应该理解为受这些实施方案的限制。 

附图说明

图1：显示用50nM BAL27862处理来自不同组织型的人肿瘤细胞系。在用50nM BAL27862或溶媒对照处理24小时后，对有丝分裂或G2/M期停滞的细胞的微管进行染色。 

图1A和1B：A549NSCLC细胞； 

图1C和1D：HeLa宫颈癌细胞； 

图1E和1F：SKBR3乳腺癌细胞； 

溶媒对照处理：图1A、1C和1E； 

BAL27862处理：图1B、1D和1F。 

图2：显示用化合物B和C对A549NSCLC细胞的处理。在分别用80nM或20nM化合物B和C处理24小时后，对有丝分裂或G2/M期停滞的A549NSCLC细胞的微管进行染色。白色标尺表示10微米。 

图2A：用20nM化合物C处理； 

图2B：用80nM化合物B处理。 

图3：显示BAL27862处理细胞与传统微管靶向剂处理细胞的比较。在用50nM的A：BAL27862；B：长春花碱；C：秋水仙素；D：紫杉醇处理24小时后，对有丝分裂或G2/M期停滞的A549NSCLC细胞的微管进行染色。每1μm图像的堆叠用ImageJ软件处理。 

图4：显示BAL27862与诺考达唑处理A549NSCLC细胞的比较。在用各种浓度的诺考达唑(B、C和D)和BAL27862(E、F和G)处理24小时后，对有丝分裂或G2/M期停滞的细胞的微管进行染色。A：对照；B：诺考达唑50nM；C：诺考达唑100nM；D：诺考达唑200nM；E：BAL2786220nM；F：BAL2786230nM以及G：BAL2786250nM。白色标尺表示10微米。显示了观察到的微管表型的代表性图像。 

图5：显示BAL27862与传统微管靶向剂的组合处理。在处理如下所示的时间后对有丝分裂或G2/M期停滞的A549NSCLC细胞的微管进行染色。采用50nM BAL27862、50nM长春花碱、50nM秋水仙素和25nM紫杉醇。白色标尺表示10微米。 

图5A：24小时长春花碱处理； 

图5B：24小时长春花碱处理，最后4小时包括BAL27862； 

图5C：24小时BAL27862处理，最后4小时包括长春花碱。 

图5D：24小时秋水仙素处理； 

图5E：24小时秋水仙素处理，最后4小时包括BAL27862； 

图5F：24小时BAL27862处理，最后4小时包括秋水仙素。 

图5G：24小时紫杉醇处理； 

图5H：24小时紫杉醇处理，最后4小时包括BAL27862； 

图5I：24小时BAL27862处理，最后4小时包括紫杉醇。 

图6：显示BAL27862和诺考达唑的组合处理。在处理如下所示的时间后，对有丝分裂或G2/M期停滞的A549NSCLC细胞的微管进行染色。采用25nMBAL27862和如下所示浓度的诺考达唑。白色标尺表示10微米。 

图6A：24小时对照处理； 

图6B：24小时25nM BAL27862处理； 

图6C：24小时50nM诺考达唑处理； 

图6D：24小时100nM诺考达唑处理； 

图6E：24小时150nM诺考达唑处理； 

图6F：24小时200nM诺考达唑处理； 

图6G：24小时50nM诺考达唑处理，最后4小时包括25nM BAL27862； 

图6H：24小时100nM诺考达唑处理，最后4小时包括25nM BAL27862； 

图6I：24小时150nM诺考达唑处理，最后4小时包括25nM BAL27862； 

图6J：24小时200nM诺考达唑处理，最后4小时包括25nM BAL27862； 

图6K：24小时25nM BAL27862处理，最后4小时包括50nM诺考达唑； 

图6L：24小时25nM BAL27862处理，最后4小时包括100nM诺考达唑； 

图6M：24小时25nM BAL27862处理，最后4小时包括150nM诺考达唑； 

图6N：24小时25nM BAL27862处理，最后4小时包括200nM诺考达唑。 

图7：显示了制备自胃癌(图.7A)、肺癌(图.7B)、结肠直肠癌(图.7C)和黑素瘤(图.7D)肿瘤个体的蛋白提取物，这些肿瘤是由皮下异种移植裸鼠而产生的，通过免疫印迹法分析磷酸化-Akt和Akt的表达，采用包含的肌动蛋白作为上样对照。在每一种情况下分析三种不同的肿瘤(1-3)。采用离体菌群生长分析肿瘤细胞对BAL27862、紫杉醇和长春花碱的耐药性和敏感性如表1所确定。 

图8：显示了通过离体菌群生长分析确定的具有BAL27862耐药性的异种移植的胃肿瘤模型个体中，肿瘤细胞磷酸化-Akt水平的升高。制备肿瘤异种移植(在裸鼠中保持)个体、固化并采用免疫组织化学方法对磷酸化-Akt蛋白表达进行染色。采用离体菌群生长分析肿瘤细胞对BAL27862、紫杉醇和长春花碱的耐药性和敏感性如表1所确定。 

图9：显示Akt1的蛋白序列(RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶)[智人(Homo sapiens)](SEQ.ID.No.1) 

图10：显示Akt2的蛋白序列(RAC-β丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶)[智人](SEQ. ID.No.2) 

图11：显示Akt3的蛋白酸序列(RAC-γ丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶同工型1)[智人](SEQ.ID.No.3) 

详述 

式I化合物 

本发明的化合物由通式I代表： 

其中： 

R代表苯基、噻吩基或吡啶基， 

其中苯基任选被1或2个独立选自下列的取代基所取代：烷基、卤代-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基(其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基)、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧基羰基、氰基、卤素和硝基；并且其中两个相邻取代基为亚甲基二氧基； 

其中吡啶基任选被低级烷氧基、氨基或卤素取代； 

X代表基团C＝Y，其中Y代表被羟基或低级烷氧基取代的氧或氮； 

R¹代表氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基； 

R²、R³和R⁶代表氢； 

R⁴和R⁵彼此独立代表氢、低级烷基或低级烷氧基； 

或者R⁴和R⁵一起代表亚甲基二氧基； 

及其可药用的衍生物， 

或者其中： 

R代表苯基或吡啶基， 

其中苯基任选被1或2个独立选自下列的取代基所取代：烷基、卤代-低级烷基、 羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基(其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基)、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧基羰基、甲酰基、氰基、卤素和硝基；并且其中两个相邻取代基为亚甲基二氧基； 

其中吡啶基任选被低级烷氧基、氨基或卤素取代； 

X代表氧； 

R¹代表氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基； 

R²、R³和R⁶代表氢； 

R⁴和R⁵彼此独立代表氢、低级烷基或低级烷氧基； 

或者R⁴和R⁵一起代表亚甲基二氧基； 

及其可药用的衍生物； 

并且其中前缀“低级”表示具有最多7个并包括7个碳原子的基团，尤其是最多4个并包括4个碳原子的基团。 

杂环基优选是指饱和、部分饱和或不饱和的、含有4-10个原子的单环或双环，其包含一个、两个或三个选自氮、氧和硫的杂原子，除另有说明外，它们可以是碳或氮连接的，其中环氮原子可任选地被选自低级烷基、氨基-低级烷基、芳基、芳基-低级烷基和酰基的取代基取代，环碳原子可被低级烷基、氨基-低级烷基、芳基、芳基-低级烷基、杂芳基、低级烷氧基、羟基或氧代基的取代基所取代。杂环基的例子是吡咯烷基、噁唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、二氧戊环基和四氢吡喃基。 

酰基是指例如烷基羰基、环己基羰基、芳基羰基、芳基-低级烷基羰基或杂芳基羰基。低级酰基优选为低级烷基羰基，尤其是丙酰基或乙酰基。 

优选本发明的通式I化合物被定义为其中R¹选自氢、乙酰基、CH₂CH₂CN和CH₂CH₂CH₂OH。 

在一个优选的实施方案中，本发明的通式I化合物选自： 

4-(1-苯甲酰甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-呋咱-3-基胺， 

4-[1-(4-溴代苯甲酰甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基胺肟， 

N-{4-[1-(4-氯代苯甲酰甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基}-乙酰胺， 

4-[1-(4-氯代苯甲酰甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基-N-(2-氰基乙基)-胺， 

4-[1-(4-氯代苯甲酰甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基-N-(3-羟基丙基)-胺， 

4-[1-(3-氨基-4-氯代苯甲酰甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基胺， 

4-[1-(3-甲氧基-4-甲氧基甲氧基-苯甲酰甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基胺，及其可药用的衍生物。 

在一个优选的实施方案中，本发明的通式I化合物为： 

其中： 

R、Y和R¹如下所定义： 

或其可药用的衍生物。 

在另一优选的实施方案中，本发明的通式I化合物选自： 

4-(1-苯氧基甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-呋咱-3-基胺， 

4-[1-(4-氟苯氧基甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基胺， 

4-[1-(3，4-二甲基苯氧基甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基-N-(2-氰基乙基)-胺，以及由下式代表的化合物： 

其中R和R¹如下定义： 

或其可药用的衍生物。 

在另一个优选的实施方案中，本发明的通式I化合物为： 

其中R、R⁴和R⁵如下所定义： 

或其可药用的衍生物。 

更优选本发明的化合物为通式I化合物： 

其中： 

R代表苯基或吡啶基 

其中苯基任选被1或2个独立选自下列的取代基所取代：低级烷基、低级烷氧基、氨基、乙酰基氨基、卤素和硝基； 

其中吡啶基任选被氨基或卤素取代； 

X代表基团C＝O； 

R¹代表氢或氰基-低级烷基； 

R²、R³、R⁴、R⁵和R⁶代表氢； 

及其可药用的衍生物， 

其中前缀“低级”表示具有最多7个并包括7个碳原子的基团，尤其是最多4个并包括4个碳原子的基团。 

特别优选本发明的化合物由下式所代表： 

其中R、Y和R¹如下所定义： 

或其可药用的衍生物。 

更特别优选本发明的化合物由下式所代表： 

其中R、Y和R1如下所代表： 

或其可药用的衍生物。 

特别优选本发明的通式I化合物为： 

或其可药用的衍生物。 

在短语通式I化合物的“可药用的衍生物”中的术语“衍生物”指它的盐、溶剂化物和复合物以及其盐的溶剂化物和复合物，以及它的前药、多晶型物和异构体(包括光学、几何异构和互变异构的异构体)及其前药的盐。在更优选的实施方案中，指其盐和前药，及其前药的盐。 

盐优选为酸加成盐。所述盐优选由含碱性氮原子的式(I)化合物与有机或无机酸形成，尤其是其可药用盐。合适的无机酸例如是氢卤酸(例如盐酸)、硫酸或磷酸。合适的有机酸例如是羧酸、膦酸、磺酸或氨基磺酸，例如乙酸，丙酸，辛酸，癸酸，十二烷酸，羟基乙酸，乳酸，富马酸，琥珀酸，己二酸，庚二酸，辛二酸，壬二酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸，氨基酸(如谷氨酸或天冬氨酸)，马来酸，羟基马来酸，甲基马来酸，环己烷甲酸，金刚烷甲酸，苯甲酸，水杨酸，4-氨基水杨酸，邻苯二甲酸，苯乙酸，扁桃酸，肉桂酸，甲磺酸或乙磺酸，2-羟基乙磺酸，乙烷-1，2-二磺酸，苯磺酸，2-萘磺酸，1，5-萘二磺酸，2-、3-或4-甲基苯磺酸，甲基硫酸，乙基硫酸，十二烷基硫酸，N-环己基氨基磺酸，N-甲基、N-乙基或N-丙基-氨基磺酸或其他有机质子酸(如抗坏血酸)。 

本发明的化合物可以以前药的形式给药，该前药可在人体或动物体中降解得到式I化合物。前药的实例包括体内可水解的式I化合物的酯和酰胺。可考虑的具体前药是天然氨基酸的酯和酰胺，以及小肽(尤其是由最多五个，优选两个或三个氨基酸组成的小肽)的酯或酰胺，以及聚乙二醇化的羟基酸(优选羟基乙酸和乳酸)的酯或酰胺。前药酯由氨基酸或肽C端的酸官能团与式I化合物的合适羟基基团形成。前药酰胺由氨基酸或肽N端的氨基官能团与式I化合物的合适羧基基团形成；或由氨基酸或肽C端的酸官能团与式I化合物的合适氨基基团形成。尤其优选的前药酰胺由存在于式I的R基团中的氨基形成。 

更优选前药通过将甘氨酸、丙氨酸或赖氨酸加成至式I化合物形成。 

甚至更优选通式I化合物为选自下式化合物的前药形式： 

在一个特别优选的实施方案中，本发明的化合物为具有下式的前药形式： 

在最优选的实施方案中，本发明的化合物为下式化合物的可药用的盐，优选其盐酸盐，最优选其二盐酸盐： 

在这种情况下，体内的药物活性代谢产物是BAL27862。 

这些前药可以通过本身已知的方法制备，特别是以下方法： 

其中将式(II)化合物或其盐： 

其中，R¹如式(I)所定义，且Z是CH或N，或包含被保护形式的官能团的该化合物的衍生物， 

(1)用式(III)的氨基酸酰化： 

其中： 

R¹⁰选自氢(Gly)、甲基(Ala)和被保护的氨基丁基(Lys)，R¹¹是合适的氨基保护基团，以及 

(2)将获得的化合物的被保护衍生物中的任何保护基团除去，得到如上文所示的前药，并且，在需要时， 

(3)通过用酸处理将所述前药转化成盐，或将式(II)化合物的盐转化为式(II)化合物的相应的游离化合物或转化为另一种盐，和/或将异构体产物化合物的混合物分离为单一的异构体。 

式(II)化合物与式(III)的氨基酸的酰化反应通过本身已知的方法进行，通常是在适宜的极性或偶极非质子溶剂的存在下，根据需要冷却或加热，例如，在约零下80℃至约零上150℃，更优选为零下30℃至零上120℃，特别是在约0℃至所用溶剂的回流温度下的范围内进行。任选地加入合适的碱，特别是芳族碱，如吡啶或三甲吡啶或叔胺碱，例如三乙胺或二异丙基乙胺，或无机碱盐，如碳酸钾或碳酸钠。 

酰化反应可在肽化学中本身已知的用于酰胺形成的条件下进行，例如使用羧基的活化剂，例如碳二亚胺，如N，N’-二乙基-、N，N’-二丙基-、N，N’-二异丙基、N，N’-二环己基碳二亚胺和N-(3-二甲氨基异丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，或使用如下试剂，例如1-羟基苯并三唑(HOBt)、苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)-六氟磷酸盐(BOP)、O-(7-氮杂-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲 六氟磷酸盐(HATU)、2-(2-氧代-1-(2H)-吡啶基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐(TPTU)，可任选在合适的碱、催化剂、辅助试剂的存在下进行。羧基也可被活化为酰基卤化物，优选为酰氯，例如，通过与亚硫酰氯或草酰氯反应，或活化为对称或不对称的酸酐，例如通过与卤代甲酸酯(如氯甲酸乙酯反应)，任选在合适的碱、催化剂或辅助试剂的存在下反应。 

如果式(II)或(III)的化合物中一个或多个其它官能团，例如羧基、羟基或氨基，由于不应参与到反应中而受到或需要受到保护，则这些是在酰胺类合成，特别是肽类化合物、头孢菌素类、青霉素类、核酸衍生物和糖的合成中通常应用的保护基，这是本领域技术人员公知的。合适的氨基的保护基团例如是氨基甲酸叔丁酯、氨基甲酸苄基酯或氨基甲酸9-芴基甲基酯。 

这些保护基可已经存在于前体中，并应当保护相关的官能团不进行不想要的副反应，如烷基化、酰基化、醚化、酯化、氧化、溶剂分解以及类似的反应。保护基的特点是它们本身能很容易地被除去，即没有不需要的副反应，通常通过溶剂分解、还原、光解或也可以通过酶的活性(例如，在类似生理条件的条件下)除去，并且它们不存在于终产物当中。专业人士知道或者可以很容易地确定，哪些保护基适于上文和下文提及的反应。 

通过此类保护基保护此类官能团、保护基本身以及除去它们的反应描述于例如用于肽合成的标准参考书以及关于保护基的专业书籍中，例如：J.F.W.McOmie，″有机化学中的保护基团(Protective Groups in Organic Chemistry)″，Plenum Press，London and New York 1973，″Methoden der organischen Chemie″(有机化学方法)，Houben-Weyl，第4版，卷15/I，Georg Thieme Verlag，Stuttgart 1974，以及T.W.Greene，G.M.Wuts″Protective Groups in Organic Synthesis″(有机合成中的保护基)，Wiley，New York，2006。 

疾病 

本发明的通式I化合物已被证明能够终止细胞增殖和诱导细胞死亡，例如通过细胞凋亡诱导。 

细胞增殖的失调或缺乏适当的细胞死亡具有广泛的临床意义。与该失调相关的许多疾病涉及过度增殖、炎症、组织重构和修复。在该范畴内常见的适应症包括癌症、再狭窄、新内膜增生、血管生成、子宫内膜异位、淋巴细胞增殖性疾病、与移植相关的病状(移植排斥)、息肉病、在组织重构的情况中丧失神经功能等。 

癌症与异常的细胞增殖和细胞死亡率相关。由于在大多数增殖性、肿瘤性疾病中细胞凋亡被抑制或延迟，因此诱导细胞凋亡是用于治疗癌症、特别是用于治疗对经典的化学疗法、放射和免疫疗法表现出抗性的癌症类型的一种选择(Apoptosis and Cancer Chemotherapy，Hickman和Dive编辑，Blackwell Publishing，1999)。此外，在自身免疫和移植相关的疾病和病理中，可用诱导细胞凋亡的化合物来恢复正常的细胞死亡过程，因此可根除该症状并且可能治愈该疾病。可诱导细胞凋亡的化合物的其它应用可以是治疗再狭窄，即，动脉壁内血管平滑肌细胞的蓄积，以及由于不能根除细菌和病毒感染的细胞所引起的持续感染。此外，可在上皮细胞内、内皮细胞内、肌肉细胞内以及不与细胞外基质接触的其它细胞内诱导或重新建立细胞凋亡。 

通式I的化合物或其可药用衍生物可用于预防性或尤其是治疗性治疗人或动物体，尤其是用于治疗肿瘤性疾病、自身免疫性疾病、与移植相关的病状和/或变性疾病。此类肿瘤疾病的例子包括但不限于上皮肿瘤、鳞状细胞瘤、基底细胞瘤、移行细胞乳头状瘤和癌、腺瘤和腺癌、附件或皮肤附件瘤、粘膜表皮样肿瘤、囊性肿瘤、粘液和浆状的肿瘤、导管、小叶和髓质肿瘤、腺泡细胞肿瘤、复合型上皮瘤、泛发的性腺瘤、副神经节瘤和血管球瘤、痣和黑色素瘤、软组织肿瘤和肉瘤、纤维瘤、粘液瘤、脂肪瘤、肌瘤、复合型混合的和基质瘤、纤维上皮瘤、滑膜样肿瘤、间皮瘤、生殖细胞瘤、滋养细胞瘤、中肾瘤、血管肿瘤、淋巴管肿瘤、骨和软骨瘤、巨细胞肿瘤、混杂的骨肿瘤、牙原性肿瘤、神经胶质瘤、神经上皮瘤、脑膜瘤、神经梢肿瘤、粒细胞肿瘤和腺泡状软组织肉瘤、何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、其它的淋巴网状内皮细胞瘤、浆细胞肿瘤、肥大细胞肿瘤、免疫增殖性疾病、白血病、混杂的骨髓增殖性病症、淋巴细胞增殖性疾病和骨髓增生异常综合征。 

通式I的化合物或其可药用衍生物可用于治疗自身免疫性疾病。此类自身免疫性疾病的实例包括但不限于全身性、盘状或亚急性皮肤性红斑狼疮、类风湿性关节炎、抗磷脂综合征、CREST、进行性全身性硬化、混合性结缔组织疾病(Sharp综合征)、莱特尔氏综合征、少年关节炎、冷凝集素性疾病、原发性混合型冷球蛋白血症、风湿性发热、强直性脊椎炎、慢性多关节炎、重症肌无力、多发性硬化、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、格巴二氏综合征、皮肤肌炎/多肌炎、自身免疫性溶血性贫血、血小板减少性紫癫、中性白细胞减少症、I型糖尿病、甲状腺炎(包括桥本甲状腺炎和格雷夫斯病)、阿狄森氏病、多腺综合征、天疱疮 (寻常天疱疮、落叶型天疱疮、皮脂型天庖疮和增殖型天庖疮)、大疱性和瘢痕性类天疱疮、妊娠性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症、线状IgA疾病、萎缩性硬化性苔藓、杜林病、寻常型银屑病、滴状银屑病、泛发性脓疱性银屑病和局限性脓疱性银屑病、白癜风、斑秃、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、所有形式的肾小球肾炎、肺出血(肺出血肾炎综合征)、IgA肾病、恶性贫血和自身免疫性肾炎、炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩病)、白塞氏病、西力克-施普鲁病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性心肌炎、肉芽肿性睾丸炎、不具有睾丸炎的精子形成缺乏、特发性和继发性肺纤维化、具有自身免疫性病因的可能性的炎性疾病，例如坏疽性脓皮病、毛发红糠疹、结节病(包括勒夫格伦和皮肤/皮下型)、环形肉芽肿、I型和IV型过敏性免疫反应、支气管哮喘、花粉热、特应性、接触性和空气传播性皮炎、大血管炎(巨细胞性动脉炎和高安动脉炎)、中型血管炎(结节性多动脉炎、川崎病)、小血管炎(韦格纳肉芽肿病、Churg-Strauss综合征、显微镜下多血管炎、亨诺-许兰氏紫癜、原发性冷球蛋白性血管炎、皮肤白细胞破坏脉管炎)、过敏综合征、中毒性表皮坏死松解症(史蒂芬-约翰逊综合征、多形性红斑)、因药物副作用引起的疾病，所有形式的由I-vu型(库姆斯分类)免疫反应形式引起的皮肤、器官特异性和全身性作用，与移植相关的病状、例如急性和慢性移植物抗宿主病和宿主抗移植物病，其涉及所有器官(皮肤、心脏、肾、骨髓、眼、肝脏、脾脏、肺、肌肉、中枢和周围神经系统、结缔组织、骨、血液和淋巴管、生殖-泌尿系统、耳朵、软骨、原发性和继发性淋巴系统，包括骨髓、淋巴结、胸腺、胃肠道、包括口咽、食管、胃、小肠、结肠和直肠，包括低至单细胞水平和亚结构的上述器官的部分，例如干细胞)。 

特别优选本发明的疾病是肿瘤或自身免疫性疾病。在特别优选的实施方案中，所述疾病是癌症。 

就受影响的人体器官和部位而言的癌症的实例包括但不限于，乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌(包括结肠和直肠，即结肠直肠癌)、肺癌(包括小细胞性肺癌，非小细胞性肺癌、大细胞肺癌和间皮瘤)、内分泌系统癌、骨癌、肾上腺癌、胸腺癌、肝癌、胃癌、肠道癌(包括胃癌)、胰腺癌、骨髓瘤、血液系统恶性肿瘤(如淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴系统恶性肿瘤)、膀胱癌、尿道癌、肾癌、皮肤癌、甲状腺癌、脑癌、头部肿瘤、颈部肿瘤、前列腺癌和睾丸癌。癌症优选选自乳腺癌、前列腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌、脑癌、神经内分泌癌、肺癌、肾癌、血液系统恶性肿瘤、 黑色素瘤和肉瘤。特别优选所述癌症选自乳腺癌、子宫颈癌、胃癌、肺癌、结肠直肠癌和黑色素瘤。更优选所述癌症选自胃癌、肺癌、结肠直肠癌和黑色素瘤。 

样本 

磷酸化-Akt水平的测定可在源自个体的生物材料样本上在体外进行。样本可以是从机体分离的任何生物材料，例如正常组织、肿瘤组织、细胞系、血浆、血清、全血、脑脊液、淋巴液、循环肿瘤细胞、细胞裂解液、组织裂解液、尿液和吸出物。优选所述样本源自正常组织、肿瘤组织或循环肿瘤细胞。更优选样本源自肿瘤组织或循环肿瘤细胞。在一个特别优选的实施方案中，样本源自肿瘤组织。例如，可在新鲜的、冷冻的或福尔马林固定/石蜡包埋的肿瘤组织样本中测定磷酸化-Akt水平。 

样本是在样本进行涉及测定生物标志物水平的方法步骤之前从个体中预先得到的。移除样本的方法是本领域已知的，并且其例如可以通过活检从个体中移除，例如通过穿刺活检、针芯活检或抽吸细针穿刺活检、内窥镜活检或表面活检。全血、血浆或血清样本可通过静脉穿刺收集，并根据标准技术进一步处理。循环肿瘤细胞也可根据例如大小(例如根据上皮肿瘤细胞大小的ISET-分离)或免疫磁细胞富集(例如CellsearchVeridex，Raritan，NJ)从而从血液中获得。 

样本比较 

本发明的个体可以是人类或动物。优选所述个体是人类。 

在从人体或动物体(优选从人体)获得的样本中，离体测定生物标志物磷酸化-Akt。该样本从人体或动物体中预先获得，优选在进行涉及测定生物标志物水平的方法步骤之前从人体预先得到的。 

生物标志物一般是用作生物学响应指示物的物质，优选作为对给定治疗的敏感性的指标，所述治疗在本申请中为采用通式I化合物或其可药用衍生物的治疗。 

在特别优选的实施方案中，相对于标准值或一组标准值，样本中更高的磷酸化-Akt水平预示着耐药性。 

较高的磷酸化-Akt水平可能是由于样本中较高的总Akt水平引起的和/或被磷酸化的Akt的百分比较高引起的。 

本文所使用的相对于标准值或一组标准值升高的、或相对高的、或高的、或更高的水平的意思是指样本中的生物标志物的量或浓度在样本中相对于标准 值或一组标准值可检测地更高。这包括相对于标准至少升高约1％或更高的水平，优选相对于标准值至少升高约5％。更优选其为相对于标准值至少升高约10％或更高的水平。更特别优选其为相对于标准值至少升高约20％或更高的水平。例如，此类升高或更高的水平可以包括但不限于相对于标准值至少高约1％、约10％、约20％、约30％、约50％、约70％、约80％、约100％、约150％或200％左右或更高。 

优选 

i)相对于获自具有相同肿瘤组织型的个体的标准值或一组标准值；或 

iii)相对于获自正常细胞、组织或体液的标准值或一组标准值， 

样本中更高的磷酸化-Akt水平预示了耐药性。 

磷酸化-Akt水平的测定在预先获自个体的样本中离体进行。 

特别优选，相对于获自具有相同肿瘤组织型个体的标准值或一组标准值，样本中更高的磷酸化-Akt水平预示着耐药性。 

在一个优选的实施方案中，对于情况i)，采用相对于获自具有相同肿瘤组织型的个体的样本(作为与其比较的样本)的标准值或一组标准值来比较样本中的测定值，从获自具有该癌症类型的一群个体的样本中建立该标准值或一组标准值。获自这些标准个体的样本例如可以源自肿瘤组织或循环肿瘤组织，只要标准样本和待比较样本的样本来源是一致的。 

在另一优选的实施方案中，对于情况ii)，相对于获自正常细胞或组织的标准值或一组标准值，在样本中比较测定值，标准值或一组标准值可以从正常(例如非肿瘤)细胞、组织或体液中建立。此类数据可以从一组个体中获得从而产生出标准值或一组标准值。 

该标准值或一组标准值从预先获得的样本中离体建立，所述样本可以来自细胞系，或优选为来自至少一个个体的生物材料，更优选来自多个个体(例如，n＝2-1000或更多)的平均值。然后可将该标准值或一组标准值与用通式I化合物或其可药用衍生物治疗的相同细胞系或相同个体的响应相关联。从这一关联中，可建立比较器模块，例如相对比例或打分系统形式，任选包括截止值或阈值，该比较器模块指示了生物标志物的水平，该水平与对式I化合物或其可药用衍生物的响应水平谱相关。该响应水平谱包括对该化合物治疗活性的相对敏感性(例如，高敏感性至低敏感性)以及对治疗活性的耐药性。在优选的实施方案中，这一比较器模块包含截止值或阈值，其预示了对治疗的耐药性。 

例如，如果应用免疫组织化学方法测定样本中的磷酸化-Akt水平，则标准值可以是打分系统的形式。这样的系统可能会考虑其中存在磷酸化-Akt染色的细胞的百分比。该系统还可考虑在单个细胞中染色或细胞定位的相对强度。然后可以将磷酸化-Akt水平的标准值或一组标准值与指示个体或组织或细胞系对式I化合物或其可药用衍生物的治疗活性的响应(尤其是耐药性)相关联。然后，此类数据可形成比较器模块的一部分。 

响应是细胞系、或优选个体、或更优选是个体的疾病对通式I化合物或其可药用衍生物治疗活性的反应。响应水平谱可以包括对化合物治疗活性的相对敏感度(例如高敏感度至低敏感度)以及对该治疗活性的耐药性。该响应数据可以例如以如下方式监测：客观响应率、疾病进展时间、无进展的生存以及总生存。 

癌症的响应可以通过采用癌症治疗领域普通技术人员公知的标准来进行评价，例如但不限于： 

实体瘤反应评价标准(RECIST)指导(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors(RECIST)Guidelines)，来源：Eisenhauer EA，Therasse P，Bogaerts J，Schwartz LH，Sargent D，Ford R，Dancey J，Arbuck S，Gwyther S，Mooney M，Rubinstein L，Shankar L，Dodd L，Kaplan R，Lacombe D，Verweij J.New response evaluation criteria in solid tumours：revised RECIST guideline(版本1.1).Eur J Cancer.2009；45：228-47； 

重度神经胶质瘤的RANO标准，来源：Wen PY，Macdonald DR，Reardon DA，Cloughesy TF，Sorensen AG，Galanis E，Degroot J，WickW，Gilbert MR，Lassman AB，Tsien C，Mikkelsen T，Wong ET，Chamberlain MC，Stupp R，Lamborn KR，Vogelbaum MA，van den Bent MJ，Chang SM.Updated response assessment criteria for high-grade gliomas：response assessment in neuro-oncology working group.J Clin Oncol.2010；28(11)：1963-72； 

卵巢癌反应的CA-125 Rustin标准，来源：Rustin GJ，Quinn M，Thigpen T，du Bois A，Pujade-Lauraine E，Jakobsen A，Eisenhauer E，Sagae S，Greven K，Vergote I，Cervantes A，Vermorken J.Re：New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors(ovarian cancer).J Natl Cancer Inst.2004；96(6)：487-8；以及 

前列腺癌反应的PSA工作组2标准，来源：Scher HI，Halabi S，Tannock I，Morris M，Sternberg CN，Carducci MA，Eisenberger MA，Higano C，Bubley GJ，Dreicer R，Petrylak D，Kantoff P，Basch E，Kelly WK，Figg WD，Small EJ，Beer TM，Wilding G，Martin A，Hussain M；Prostate Cancer Clinical Trials Working  Group.Design and end points of clinical trials for patients with progressive prostate cancer and castrate levels of testosterone：recommendations of the Prostate Cancer Clinical Trials Working Group.J Clin Oncol.2008；26(7)：1148-59。 

耐药性与没有可观察到的和/或可测定的一个或多个以下这些情况的减少或缺乏有关：不正常的细胞(优选癌细胞)的减少，或不存在异常细胞(优选癌细胞)；对于癌症而言：肿瘤尺寸的减小；进一步的肿瘤生长的抑制(即，减缓至一定程度，优选停止)；肿瘤标志物例如PSA和CA-125的水平降低；癌细胞浸润到其他器官(包括癌细胞扩散进入软组织和骨)的抑制(即，减缓至一定程度，优选停止)；肿瘤转移的抑制(即，减缓至一定程度，优选停止)；一种或多种与特定癌症相关的症状的减轻；以及发病率和死亡率的降低。 

在优选的实施方案中，耐药性意味着没有可观察到的和/或可测定的一个或多个以下标准的减少或缺乏：肿瘤尺寸的减小；进一步肿瘤生长的抑制，癌细胞浸润到其他器官的抑制；以及肿瘤转移的抑制。 

在更优选的实施方案中，耐药性是指以下标准中的一个或多个：肿瘤尺寸没有减小；进一步的肿瘤生长没有受到抑制；癌细胞浸润到其他器官没有受到抑制；以及肿瘤转移没有受到抑制。 

上述耐药性标准根据癌症治疗领域普通技术人员公知的临床指导测定，如上面列出的用于测定癌症响应的那些。 

还可通过评估细胞的增殖和/或细胞死亡在体外建立响应。例如，可通过一个或多个以下建立的测定法在体外评估对细胞死亡或增殖的影响：A)用Hoechst 33342染料进行核染色，提供有关核的形态和DNA片段化的信息，其为细胞凋亡的标志。B)膜联蛋白V结合测试，其反映浆膜的外脂质双分子层的磷脂酰丝氨酸含量。该事件被认为是细胞凋亡的早期标志。C)TUNEL测定法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法)，其为评估细胞发生凋亡或坏死的荧光法，通过标记核酸末端而测定DNA片段。D)MTS增殖测定法，其测定细胞的代谢活动。在该测试中活细胞代谢活跃，而具有受损呼吸链的细胞显示出活性降低。E)结晶紫染色测定法，通过直接染色细胞成分监测对细胞数量的影响。F)增殖测定法，其通过掺入溴脱氧尿苷(BrdU)监测DNA合成。可直接确定对生长/增殖的抑制作用。G)YO-PRO测定法，其包括膜不透过的荧光的单体酞菁的核酸染色，其允许在不干扰细胞活力的情况下分析细胞 死亡(如细胞凋亡)。也可在细胞渗透后，分析对细胞数量的总体影响。H)细胞周期分布的碘化丙锭染色，其表明在细胞周期不同阶段之间分布的改变。可确定细胞周期停滞点。I)不依赖贴壁生长测试，例如集落生成测试，其评估单细胞悬浮液在软琼脂中生长为集落的能力。 

在涉及体外测定耐药性的优选实施方案中，耐药性是指异常细胞的增殖速率没有减少和/或异常细胞数量没有减少。更优选耐药性是指癌细胞增殖速率没有减少和/或癌细胞数量没有减少。异常细胞(优选癌细胞)数量的减少可通过各种程序性和非程序性细胞死亡机制发生。不依赖半胱天冬酶的程序性细胞死亡和自噬性细胞死亡的细胞凋亡是细胞程序性死亡的实例。然而，本发明实施方案中所涉及的细胞死亡标准不应当被视为对任一种细胞死亡机制的限定。 

磷酸化-Akt 

如上文所定义，本文中使用的术语Akt应当包括所有前面所述的同义词和同工型，磷酸化-Akt是在一或多个位点上已经被磷酸化的Akt，前提是对于Akt1、Akt2和Akt3而言，名称磷酸化-Akt用于指明磷酸化的位点分别并是T308、T309或T305。为了进一步说明这一点，磷酸化-Akt可能会或者可能不会分别在Akt1、Akt2和Akt3的T308、T309或T305位点被磷酸化，而名称磷酸化-Akt说明磷酸化的位点不是这些位点。 

Akt(人类Akt)的蛋白序列的优选示例列示于SEQ.ID No.1-3，图9-11。然而，术语Akt也包括这些序列的同源物、突变体形式、等位基因变异体、同工型、剪接变异体和等同物。这些序列的人同源物、突变体形式、等位基因变异体、同工型、剪接变异体和等同物是更优选的实施方案。更优选其包括与SEQ.ID.No.1-3所代表的任何序列具有至少约75％同一性(identity)的序列，特别是优选至少约85％同一性，尤其是优选至少约95％同一性。在特别优选的实施方案中，Akt相应于SEQ.ID.No.1-3所代表的任何序列，该序列具有至少99％的同一性。在特别优选的实施方案中，Akt相应于SEQ.ID.No.1所代表的任何序列，该Akt序列与后者具有至少95％的同一性，优选至少99％的同一性。在更特别优选的实施方案中，Akt相应于任何SEQ.ID.No.1-3所代表的一种序列。在甚至更特别优选的实施方案中，Akt相应于SEQ.ID.1所代表的序列。 

在特别优选的实施方案中，磷酸化-Akt应当是指在下列丝氨酸残基上被磷酸化的Akt(其中其优选的实施方案如前一段所给出)： 

对于Akt1(SEQ.ID.No.1)：S473； 

对于Akt2(SEQ.ID.No.2)：S474；且 

对于Akt3(SEQ.ID.No.3)：S472。 

在另一特别优选的实施方案中，磷酸化-Akt相应于SEQ.ID.No.1-3所代表的任何序列，该序列与任何这些序列具有至少99％的同一性，其中对于由SEQ.ID.No.1所代表的序列，S473被磷酸化，对于SEQ.ID.No.2所代表的序列，S474被磷酸化，或者对于SEQ.ID.No.3所代表的序列，S472被磷酸化。 

在非常特别优选的实施方案中，磷酸化-Akt相应于在S473上被磷酸化的SEQ.ID.No.1所代表的序列。 

磷酸化-Akt的水平 

磷酸化-Akt的水平可通过技术人员已知的分析技术在样本中测定。本领域已知的适合于蛋白水平测定磷酸化-Akt水平的蛋白表达试验方法的实例包括但环限于：i)免疫组织化学(IHC)分析，ii)蛋白质免疫印迹法；iii)免疫沉淀法；iv)酶联免疫吸附测定法(ELISA)；v)放射免疫法；vi)荧光激活细胞分选术(FACS)；vii)质谱，包括基质辅助激光解吸/电离(MALDI，如MALDI-MS)或电喷雾离子化质谱分析(ESI-MS)。 

上述一些方法中涉及的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体、抗体片段和/或各种类型的合成抗体，包括嵌合抗体。可以对抗体进行标记，以使得其在与一个或多个其它物质反应后被检测或能够被检测，例如采用被标记的或能够产生可检测结果的二级抗体。磷酸化-Akt的特异性抗体可从Cell Signaling购得，或者可以通过技术人员熟知的常规抗体产生方法制备。 

蛋白分析的优选方法是ELISA、质谱技术、免疫组织化学法和蛋白免疫印迹法，特别优选ELISA、蛋白免疫印迹法和免疫组织化学法。特别优选蛋白免疫印迹法和免疫组织化学法。在蛋白免疫印迹法(也被称为免疫印迹)中，经标记的抗体可用于评估蛋白水平，其中来自可检测标记物的信号强度相应于蛋白的量，并可以例如通过光密度法量化测定。 

免疫组织化学法也采用经标记的抗体检测生物标志物的存在和相对量。它可用于评估存在生物标志物的细胞的百分比。它也可以用来评估单个细胞中生物标志物的定位和相对量，后者被认为是染色强度的函数。 

ELISA代表酶联免疫吸附测定法，因为它采用连接至用于检测特定蛋白的抗体或抗原的酶。ELISA通常如下进行(尽管存在其他变通方法)：在例如96孔板的固相基质上包被第一抗体，该抗体识别生物标志物。被结合的生物标志物 然后通过对该生物标志物特异性的二级抗体识别。其可直接与酶结合，或者可以采用与酶结合的抗免疫球蛋白第三抗体。加入底物，酶催化反应，产生特定的颜色。通过测定这种颜色的光密度，可以确定生物标志物的存在和量。 

生物标志物用途 

生物标志物可用于预测个体的疾病对如上文所定义的通式I化合物或其可药用衍生物的固有性耐药性。 

生物标志物可用于选择患有或易患疾病(优选癌症)的个体，以使用如上述定义的通式I化合物或其可药用衍生物进行治疗。也可以用此类生物标志物的水平来识别对使用该药物的治疗倾向于响应或不响应的个体。可对个体进行分类，以避免不必要的治疗方案。具体地讲，该生物标志物可用于鉴定其样本相对于一个或一组标准值而言不显示更高水平的磷酸化-Akt的个体，在此基础上可选择所述个体使用如上述定义的通式I化合物或其可药用衍生物进行治疗。 

该生物标志物也可用来帮助确定有关给药量和给药方案的治疗方案。此外，该生物标志物也可用于帮助选择给予个体的药物组合，所述组合包括通式I化合物或其可药用衍生物和其它化疗(细胞毒性)药物。另外，该生物标志物可用于帮助确定个体的治疗策略，包括是否将通式I化合物或其可药用衍生物与靶向治疗、内分泌治疗、放射治疗、免疫治疗或手术介入或这些疗法的组合一起施用。 

也可以使用磷酸化-Akt与其他生物标志物的组合来预测对通式I化合物或其可药用衍生物的响应，以确定治疗方案。它还可与化疗敏感性测试联合使用，以预测耐药性并确定治疗方案。化疗敏感性测试包括将通式I化合物直接施用于取自个体的细胞，例如取自患有血液系统恶性肿瘤或可获取的实体瘤(例如乳腺癌、头颈部癌或黑色素瘤)的个体的细胞，从而确定细胞对该化合物的响应。 

治疗方法 

本发明在某些方面还涉及治疗方法，以及用于治疗方法的磷酸化-Akt，其中首先确定相对于一个或一组标准值的磷酸化-Akt的水平，然后，如果所述样本中的磷酸化-Akt水平不高于标准值或一组标准值，则给予如上定义的通式I化合物或其可药用衍生物。式I化合物或其可药用衍生物可在药物组合物中给药，这是本领域技术人员所公知的。适当的组合物和剂量例如公开在WO2004/103994A1第35-39页中，其特别引入本文作为参考。特别优选适用于温 血动物(尤其是人类)的肠内给药的组合物，如鼻、颊、直肠或特别是口服给药，也特别优选肠胃外给药的组合物，如静脉内、肌内或皮下给药。更特别优选用于静脉内给药的组合物。 

组合物包含活性成分和可药用载体。组合物的实例包括但不限于如下：5000粒软明胶胶囊，每粒包含0.05g作为活性成分的通式(I)化合物之一，按如下方法制备：将250g粉碎的活性成分悬浮于2升Lauroglykol(丙二醇月桂酸酯，GattefosséSA，Saint Priest，法国)中，在湿法粉碎机中研磨以产生颗粒大小为约1-3μm的颗粒。然后使用胶囊灌装机将0.419g混合物填充到软明胶胶囊中。 

本发明在一个方面还涉及治疗肿瘤或自身免疫性疾病(优选癌症)的方法，该方法包括：首先在其样本具有与一个或一组标准值水平相比更高的磷酸化-Akt水平的个体中，降低磷酸化-Akt水平，然后采用如上定义的通式I化合物或其可药用衍生物治疗该个体。可通过直接或间接的化学或遗传方法降低磷酸化-Akt水平。此类方法的实例是采用能够使得磷酸化-Akt水平降低的药物进行治疗，靶向递送病毒、质粒或肽构建物或抗体或siRNA或反义RNA下调磷酸化-Akt水平。例如，可以使用siRNA降低rictor表达水平，这样就降低了mTORC2复合体的形成，从而直接降低了细胞中的磷酸化-Akt水平。该个体然后可采用通式I化合物或其可药用衍生物进行治疗。 

通式I化合物或其可药用衍生物可单独给药，或与一种或多种其它治疗药物联合给药。可能的组合疗法可采取固定组合的形式，或将本发明化合物和一种或多种其它治疗药物交错或彼此独立地给药，或将固定组合与一种或多种其它治疗药物联合给药。此外，通式I化合物或其可药用衍生物可以与化疗(细胞毒治疗)、靶向治疗、内分泌治疗、放射治疗、免疫治疗、手术干预或其组合一起联合施用，尤其用于治疗肿瘤。作为如上所述其他治疗策略背景下的辅助治疗，同样可以进行长期治疗。其他可能的治疗是在肿瘤消退后维持患者的状态的治疗，或甚至是化疗的预防性治疗，例如在有风险的患者中。 

试剂盒和装置 

在一个方面，本发明涉及用于预测响应的试剂盒，在另一个方面涉及用于预测响应的装置，优选用于预测个体疾病对如上述定义的通式I化合物或其可药用衍生物的响应，其中包含测定样本中磷酸化-Akt水平所需的试剂。优选所述试剂包括捕获试剂和检测剂试剂，所述捕获试剂包含磷酸化-Akt的检测剂。 

该试剂盒和装置还优选包含比较器模块，其包括用于将样本中的磷酸化-Akt水平与之进行比较的一个或一组标准值。在优选的实施方案中，比较器模块包含在试剂盒的使用说明中。在另一优选的实施方案中，比较器模块为显示装置的形式，例如颜色或数字编码材料的带状物，其被设计用来置于样本测定的读数器旁边，以指示耐药性水平。标准值或一组标准值可如上所述那样确定。 

该试剂优选为能够选择性结合磷酸化-Akt的抗体或抗体片段。例如，它们可以是一种结合磷酸化-Akt的特异性一抗形式，以及与该一抗结合的二抗，并且二抗本身被标记用于检测。一抗也可以被标记用于直接检测。该试剂盒或装置还可任选含有洗涤溶液，在洗涤后，与其他生物标志物相比，该溶液选择性地允许与捕获试剂结合的生物标志物保留。此类试剂盒可以在ELISA、蛋白免疫印迹法、流式细胞术、免疫组织化学法或其他免疫化学方法中用于检测生物标志物的水平。 

另外，该装置可以包括成像装置或检测装置(例如但不限于荧光检测)，它可以进一步处理检测信号并将其转化为比较器模块中的刻度。 

更优选该试剂盒包含如上述定义的通式I化合物或其可药用衍生物。然后，根据通过包含在试剂盒中的试剂所测得的个体样本中生物标志物的水平，所述化合物可被施用于个体。因此，本发明的试剂盒可以用于如上定义的根据本发明的治疗方法中。在特别优选的实施方案中，该试剂盒包括下式化合物或其可药用盐： 

在特别优选的试剂盒实施方案中，可药用盐是二盐酸盐。另一方面，本发明涉及如上所述的试剂盒的用途。 

在本说明书中，词语“含有”或“包括”或“包含”应被理解为表示包括所述项目或项目组，但不排除任何其他项目或项目组。 

试验方法学 

培养细胞的免疫荧光染色 

将A549人非小细胞肺癌(NSCLC，ATCC参考号CCL-185)细胞、HeLa宫颈癌细胞(ATCC参考号CCL-2)和SKBR3乳腺癌细胞(ATCC参考号HTB-30)以50％的密度接种在圆形显微镜盖玻片上，并在含10％FCS(也称为FBS)的RPMI-1640中、于37℃、以及5％的CO₂中培养24小时。将待测化合物溶解于DMSO中。将细胞培养基替换为含有稀释的化合物(紫杉醇、长春花碱、秋水仙素和诺考达唑均购自Sigma-Aldrich)或溶媒的培养基。在处理如附图说明中所述的时间后，洗涤盖玻片，并在甲醇/丙酮(1∶1)中于室温下固定细胞5分钟，随后在封闭缓冲液中(含0.5％BSA和0.1％TX-100的PBS)于室温下温育30分钟。然后在封闭缓冲液中于室温下将抗α-微管蛋白抗体(Sigma，1∶2000)与样本一起温育1小时。洗涤几次后，室温下用AlexaFluor-488山羊抗小鼠IgG(Molecular Probes，1∶3000)温育细胞1小时，然后用封闭缓冲液洗涤若干次。用ProLong Gold antifade(Molecular Probes)包埋样本，用指甲油密封，采用Leica免疫荧光显微镜检测。用冷却的CCD相机捕捉图像并用ImageJ软件处理。 

集落生长测定 

制备源自患者的肿瘤异种移植物(保持在裸鼠中)的单细胞悬浮液。为测定集落生长，根据Hamburger&Salmon介绍的试验方法(人类肿瘤干细胞的主要生物测定法，Science，1977，197：461-463)，将细胞涂布于24-孔板的软琼脂中。将在0.2mL含有0.4％琼脂的介质中的2×10⁴-6×10⁴个细胞涂布在0.75％琼脂的底层。将试验化合物分散在0.2mL培养基中。每个24-孔板均含有未处理的对照和样本，一式三份。将培养物于37℃和7.5％CO²温育5-28天。在开始测定前24小时，采用可代谢的四唑盐染色有活性的集落(Alley MC等，Life Sci.1982，31：3071-3078)，采用自动影像分析系统(Omnicon 3600，Biosys GmbH)计数。 

通过处理板和对照板中集落的平均数的比值反映药物的相对作用。以化合物浓度对相对集落数作图确定IC₇₀-值。 

蛋白提取物 

在冰冷的缓冲液中提取肿瘤，所述缓冲液含有50mM HEPES(pH 7.5)、150mM NaCl、25mM β-甘油磷酸酯、25mM NaF、5mM EGTA、1mM EDTA、0.1％NP40、15mM焦磷酸盐、2mM原钒酸钠、10mM钼酸钠、亮抑肽酶(10μg/mL)、抑肽酶(10μg/mL)和1mM PMSF(每45mg获得1mL提取量)。采用Polytron均化后，将溶解产物调节至1％的NP40中，在冰上培养20分钟。通过离心使得溶解产物澄清，于-80℃冷冻。 

免疫印迹/蛋白印迹 

采用每条泳道20μg总蛋白进行免疫印迹。采用BCA蛋白分析(Pierce)测定蛋白浓度。在10％的SDS-凝胶上分离蛋白质，采用Wet Blotting转移至PVDF膜(45min，250mA/凝胶)。用于免疫印迹的一级抗体如下： 

磷酸化-Akt(丝氨酸473)(获自Cell Signalling，参考号9271)来源：兔多克隆抗体，1∶1000稀释，缓冲液条件：含有0.5％牛奶/0.1％吐温的PBS； 

Akt蛋白(获自Epitomics，参考号1085-1)来源：单克隆抗体，1∶2000稀释，缓冲液条件：含有0.5％牛奶/0.1％吐温的PBS； 

肌动蛋白(获自Chemicon，参考号MAB1501)来源：小鼠，单克隆，1∶5000稀释，缓冲液条件：含有0.5％牛奶/0.1％吐温的PBS。 

用于免疫印迹的二级抗体为过氧化物酶-共轭的山羊抗-兔或山羊抗-小鼠抗体(获自Jackson ImmunoResearch Laboratories INC：参考号111-035-144JIR和115-035-146JIR)，1∶5000稀释，缓冲液条件：0.5％的牛奶在PBS/0.1％吐温中。采用Raytest Stella 3200高效成像系统显现标记的条带。 

免疫组织化学法 

于室温下，在含有4％甲醛的10％中性缓冲的福尔马林液中将源自患者的肿瘤异种移植物(保持在裸鼠中)固化20-28小时。固化的样本保存在70％的乙醇溶液中最多一周的时间，然后根据标准方法脱水并用石蜡包埋，采用下列条件： 

处理顺序 时间(小时) 70％EtOH 1 80％EtOH 2 99％EtOH 1 100％异丙醇 0.5 100％异丙醇 1

[0354] 

二甲苯 0.5 二甲苯 1 二甲苯 1 石蜡 1 石蜡 2 石蜡 2

切出约2μm的石蜡切片，采用自动免疫染色Benchmark(Roche)，通过标准处理步骤处理。采用浓度为5mg/mL的DAB(3，3-二氨基联苯胺)作为显色底物，完成特异性抗体染色的可视化。采用下列一级抗体和处理条件染色： 

详细的实施例 

实施例1：由通式I化合物诱导的独特有丝分裂表型 

用化合物A(BAL27862)或化合物B或化合物C处理，在所有测试的肿瘤细胞系中诱导高度可重现的和独特的微管表型(图1显示了BAL27862在A549细胞、HeLa细胞和SKBR3细胞中的作用；图2显示了化合物C和化合物B在A549细胞中的作用)。在分裂的细胞中，发生了可见的有丝分裂纺锤体断裂，从而形成点状结构(图1)。该表型显示了不同于用传统的微管靶向药物如微管稳定剂紫杉醇和微管去稳定剂长春花碱和秋水仙素(图3)以及诺考达唑(图4)所观察到的表型。 

实施例2：BAL27862以优势方式克服了传统微管靶向药物诱导的微管表型 

为显示其对微管的活性的独特性，使用A549细胞，对BAL27862与长春花碱、秋水仙素和紫杉醇(图5)以及诺考达唑(图6)进行联合测试。用长春花碱、秋水仙素、紫杉醇或诺考达唑单独处理诱导了这些药物特有的有丝分裂微管表型。然而，在最后4小时与BAL27862联合处理后，导致微管结构的破坏；产生了与仅用BAL27862处理相一致的表型，尽管长春花碱、秋水仙素、紫杉醇或诺考达唑还继续存在。与此相反，先用BAL27862处理，然后与长春花碱、秋水 仙素、紫杉醇或诺考达唑联合处理4小时，对所观察到的微管表型没有任何影响，与用BAL27862处理一致。 

这些数据表明，式I化合物一致性地但以不同于传统微管靶向药物的方式影响微管生物学。 

本发明详细实施例 

实施例3：与获自患者的对BAL27862治疗有耐药性的肿瘤细胞相关的高磷酸化-Akt表达水平 

根据集落生长分析，采用源自8个肿瘤患者的肿瘤细胞(在小鼠中以异种移植物保存)，自胃癌、结肠直肠癌、黑素瘤和肺癌识别出BAL27862-敏感性或耐药性肿瘤细胞(参见表1)。表1中显示了相对于对照所观察到的能够达到70％生长抑制的浓度(IC₇₀)。在该表中，BAL27862-敏感性肿瘤细胞是其IC₇₀值在较低的纳摩尔范围内的那些细胞，而BAL27862-耐药性肿瘤细胞的IC₇₀值＞600纳摩尔。采用相同的离体试验，可以自8个肿瘤模型中的7个获得紫杉醇和长春花碱的数据。在这7个模型中，所有的模型均对紫杉醇的治疗有耐药性，而其中6个模型对长春花碱的治疗敏感。 

表1 

进行免疫印迹分析以测定相同以异种移植物保存的肿瘤中磷酸化-Akt(采用能够识别磷酸化丝氨酸-473的抗体)和Akt蛋白的水平。肌动蛋白水平也包含在免疫印迹上，作为上样对照(loading control)。 

磷酸化-Akt水平的分析表明，磷酸化-Akt水平根据肿瘤的不同而改变(图7)。 

根据集落生长分析和相同的IC₇₀标准，在紫杉醇或长春花碱的耐药性和高磷酸化-Akt表达水平之间没有关联(比较图7与表1)。这在例如胃癌模型中是明显的。尽管GXF 251和GXF 97均对紫杉醇有耐药性，对于GXF 251而言，磷酸化-Akt水平几乎是不可测的，而对于GXF 97而言，该水平无疑是较高的。长春花生物碱(长春花碱)在胃癌模型中也存在同样的关联缺乏，因为这两种肿瘤均对长春花碱敏感。该关联缺乏同样出现在黑素瘤和结肠直肠癌模型中。因此，磷酸化-Akt水平不适合在源自患者的肿瘤模型中作为对常规微管药物(紫杉醇和长春花碱)耐药性的可靠生物标志物。 

令人惊奇的是，相反，当将BAL27862耐药性数据(如集落生长分析所定义)与磷酸化-Akt水平比较时，显示磷酸化-Akt的表达仅在耐药性肿瘤中较高，而在源自相同肿瘤组织型的敏感肿瘤中不高(比较图7与表1)。因此，表达水平的提高一致性地说明对BAL27862的耐药性。因此，磷酸化-Akt水平可以作为对本发明化合物BAL27862耐药性的生物标志物。 

实施例4：胃癌肿瘤异种移植物的免疫组织化学分析 

在胃癌肿瘤异种移植物中进行免疫组织化学分析(图8)，它在肿瘤模型GXF97中显示了较高的磷酸化-Akt水平。在较高的磷酸化-Akt水平和对BAL27862的耐药性之间具有明显的相关性(肿瘤模型GXF 97具有BAL27862-耐药性，而肿瘤模型GXF 251具有BAL27862-敏感性；如集落生长分析所定义-表1)。因此，再次说明磷酸化-Akt水平可以作为对本发明化合物BAL27862耐药性的生物标志物。 

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