一种高载药量两性霉素B聚合物复合胶束及其制备方法

摘要

本发明属生物技术领域，具体涉及一种高载药量两性霉素B聚合物复合胶束及其制备方法。本发明使用极具临床应用潜力的聚乙二醇衍生化磷脂与难溶性药物两性霉素B，形成两性霉素B聚乙二醇衍生化磷脂复合胶束。两性霉素B可以与聚乙二醇衍生化磷脂通过静电吸引作用和碳链之间的相互作用结合在，形成高载药量、高包封率和高稳定性的两性霉素B复合胶束。本发明的两性霉素B复合胶束在生理盐水及血浆中稳定、毒性和输液反应较低；可采用生理盐水稀释，极大提高了临床适用范围及方便性。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种高载药量两性霉素B聚合物复合胶束及其制备方法， 具体涉及可静脉注射的两性霉素B的纳米复合胶束制剂及其制备方法。

背景技术

两性霉素B属多烯类广谱抗真菌抗生素，主要用于治疗深部真菌感染，并有很高的疗效， 在临床已使用了近半个世纪，被称为抗真菌感染的“金标准”。

两性霉素B抗真菌的作用机制是与真菌细胞膜上的麦角固醇结合，在细胞膜上形成微孔， 使细胞内物质外渗而导致真菌死亡。由于两性霉素B具有疏水多烯烃结构和亲水多羟基结构， 其在水中的临界聚集浓度非常低（<1.0μg/ml）极容易聚集，并分别以不溶性聚集体、可溶 性聚集体和单体三种形式存在。其中，只有以单体形式存在的两性霉素B才能选择性的作用 于真菌细胞膜上的麦角甾醇，而聚集体的特异性较低，亦能与哺乳动物细胞膜上的胆固醇结 合，引起同样的损伤，故其毒性较大。

由于两性霉素B水溶解性质较差，临床上使用脱氧胆酸钠对其进行增溶，作为临床应用 的普通注射剂。两性霉素B普通注射剂给药时，药物主要经过肾脏排泄，因此肾毒性较大。 此外，两性霉素B普通注射剂在生理盐水中不稳定，会促使红细胞中钾离子渗出，引发各种 输液反应例如寒战、发冷、恶心和呕吐。传统两性霉素B注射剂在临床应用时表现出严重的 毒副作用，极大地限制了它的应用。因此，开发一种新制剂以达到降低两性霉素B的肾脏毒 性和输液反应具有重要的临床意义。

为了降低两性霉素B的毒副作用，国内外研究者一直致力于两性霉素B新制剂的开发， 其中最成功的的制剂是两性霉素B脂质体。两性霉素B脂质体于1991年首先在英国和爱尔兰 上市，也是第一个脂质体剂型药物。目前，国内上市的脂质体主要有“安浮特克”和“锋克 松”。两性霉素B被脂质体包封后，主要分布在肝、脾等网状内皮细胞较丰富的器官中，而在 心脏及肾脏中的分布量减小，从而可以减小药物的肾毒性。但两性霉素B脂质体“锋克松” 处方中仍含有一定量的表面活性剂去氧胆酸钠，具有一定的溶血毒性，在临床使用过程中存 在较大的安全隐患。此外，脂质体制剂存在稳定性差、在储存过程中粒径不稳定、药物包封 率低、易泄漏和易形成较大的粒子堵塞毛细血管等缺点。

两亲性嵌段聚合物胶束作为一种新型疏水性药物递送的载体，具有载药范围广、结构稳 定、优良的组织渗透性、体内滞留时间长、能有效地携带药物到达靶器官等特点。与脂质体 剂型相比，聚合物胶束最明显的优势在于更好的组织渗透性，其原因在于聚合物胶束具有更 小的粒径和更柔软的结构。两性霉素B在临床上用于深部组织真菌感染的治疗，渗透性更好 的胶束制剂比脂质体制剂具有更好的治疗效果。

基于聚乙二醇衍生化磷脂制备的纳米胶束具有的优点包括：1）生物相容性好；2）粒径 小，稳定性好，避免了其他微粒给药系统例如脂质体，易于聚集的缺点；3）能够改变药物体 内分布，降低药物在肝肾中的蓄积，降低药物的毒副作用；4）延长药物的体内循环时间，增 加药物的作用时间和对肿瘤等组织的靶向性。

发明内容

本发明目的是针对目前临床现有的两性霉素B制剂如注射用两性霉素B和注射用两性霉 素B脂质体的肾毒性、溶血毒性和输液反应等问题，提供一种高载药量两性霉素B聚合物复 合胶束给药系统。

本发明采用聚乙二醇衍生化磷脂类作为载体材料，通过与一定比例的难溶性药物两性霉 素B在水溶液中的相互作用力自组装形成复合骨架胶束，从而显著提高两性霉素B水溶液中 的溶解度。其中，载体材料与两性霉素B的摩尔比是0.4～4：1，优选0.5:1～3:1。

其中所述聚乙二醇衍生化磷脂为聚乙二醇分子通过共价键与磷脂分子上的含氮碱基结 合而成。

聚乙二醇衍生化磷脂中磷脂部分的脂肪酸包含10～24个碳原子，脂肪酸链是 饱和的和部分饱和的，优选月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸或亚油酸。所述的磷 脂为磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、二磷脂酰甘油或溶血胆碱磷 脂。

其中聚乙二醇衍生化磷脂的聚乙二醇分子量范围为200～20000，优选 500～10000，更优选2000～4000。

所述的聚乙二醇衍生化磷脂选自：聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇 4000-磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000-磷脂酰胆碱、聚乙二醇6000-磷脂酰胆碱、聚乙二醇2000- 磷脂酰丝氨酸、聚乙二醇4000-磷脂酰丝氨酸、聚乙二醇2000-磷脂酰肌醇、聚乙二醇4000- 磷脂酰肌醇、聚乙二醇6000-磷脂酰肌醇，优选：聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇4000- 磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000-磷脂酰肌醇。

聚乙二醇衍生化磷脂具有安全、无毒、生物相容性好等优点，并具有较低的临界胶束浓 度（10^-6～10^-5mol·L^-1），其形成的胶束经体内血液稀释后仍能保持稳定。因此可以安全地应 用于两性霉素B制剂的制备中。

本发明的聚乙二醇衍生化磷脂与药物两性霉素B的复合胶束，可通过以下方法制备：薄 膜分散法和冻干法。

薄膜分散法包括以下步骤：

（1）将两性霉素B和聚乙二醇衍生化磷脂的混合物溶于有机溶剂中；

（2）将以上混合物在真空中旋转挥干，得聚乙二醇衍生化磷脂的与两性霉素B的混合物薄膜；

（3）加入适量去离子水，复溶即得均匀澄清的胶束溶液。

冻干法包括以下步骤：

（1）将两性霉素B和聚乙二醇衍生化磷脂的混合物溶于有机溶剂中；

（2）加入适量冻干保护剂，经过冷冻干燥去除水分，得干燥的包载疏水抗肿瘤药物两性霉素 B的聚合物胶束；

（3）将制得的冻干胶束按需要量加水，水合振荡后，复原成胶束溶液。

所述去离子水包括：蒸馏水、生理盐水、等渗葡萄糖溶液或缓冲溶液

所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、二甲基亚砜一种或其混合溶剂。

冻干保护剂包括葡萄糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、 聚乙二醇6000或普朗尼克F68。

通过上述方法制备的聚合物胶束组合物可通过高压乳匀、高速均质或超声等工艺减小胶束 的粒径和粒径分布。该聚合物胶束组合物亦可经一定制剂工艺，如冷冻干燥、喷雾干燥、减 压蒸发等进一步制备成适宜制剂，如注射剂、口服制剂等。

本发明通过红外光谱法鉴定了载体聚乙二醇衍生化磷脂与药物两性霉素B存在相互作用。 使用红外光谱仪分别对载药胶束、聚乙二醇衍生化磷脂、两性霉素B及其混合物进行扫描， 通过考察化合物特征基团的吸收峰峰位的变化，确证了化合物周围电子环境的变化，确定了 两者之间存在相互作用。推测聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺羰基与两性霉素B的羟基存在氢键物理 相互作用。

本发明通过测定粒径，考察了载药胶束在生理盐水中的稳定性。临床上使用的注射用两 性霉素B和注射用两性霉素B脂质体都只能使用葡萄糖溶液进行稀释，经生理盐水稀释会产 生沉淀。而本发明所制备的产品可在大量生理盐水内，保持长时间的稳定性，提高了临床使 用的范围及方便性。

本发明通过包封率、载药量和粒径考察了载药胶束冻干粉的稳定性。复合胶束在冻干保 护剂的保护作用下，稳定性良好，药物不易泄露，粒子不易聚集。

本发明考察了两性霉素B复合胶束的体外释放情况。两性霉素B复合胶束具有明显的缓 释特点，释药平稳无突释效应。胶束载体可有效包裹两性霉素B，避免制剂在血液循环过程中 药物快速释放，从而降低药物的毒副作用；可以显著延长药物作用时间，达到长效作用。

本发明通过对溶血率的测定考察了载药胶束的体外溶血毒性，与两性霉素B的二甲基亚 砜溶液、注射用两性霉素B和注射用两性霉素B脂质体溶液相比，两性霉素B聚合物复合胶 束溶血毒性显著降低。由于两性霉素B复合胶束能够缓慢释放药物，避免药物聚集而产生溶 血毒性；复合胶束可以使两性霉素B以毒性较低的单体形式释放，降低溶血毒性。

本发明通过液基稀释法测定了载药胶束的MIC₈₀值，考察了体外抗菌活性。其体外抗菌活 性优于两性霉素B的二甲基亚砜溶液和注射用两性霉素B溶液。两性霉素B的二甲基亚砜溶 液和注射用两性霉素B溶液在进行稀释时，部分两性霉素B可能形成聚集体，导致其有效浓 度降低；而复合胶束的耐稀释性较好，药物释放缓慢，不易聚集，因而有效浓度较高。此外， 复合胶束可在一定程度上防止两性霉素B的多烯烃基团氧化，保持药物的活性。

附图说明

图1为聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺的¹H-NMR图谱

图2为两性霉素B的¹H-NMR图谱

图3为两性霉素B与聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺混合物的¹H-NMR图谱

图4为实施例3所制备的复合胶束的¹H-NMR图谱

图5为聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺的IR图谱

图6为两性霉素B的IR图谱

图7为两性霉素B与聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺混合物的IR图谱

图8为实施例3所制备的复合胶束的IR图谱

图9为实施例1～6产品72h内的释放曲线

图10两性霉素B的二甲基亚砜溶液、注射用两性霉素B溶液、注射用两性霉素B脂质体溶液 和实施例3溶液的溶血情况

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描 述的具体物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书 中所详细描述的发明。

实施例1：聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺与两性霉素B的复合胶束制备（摩尔比为0.4:1）

称取8.4mg两性霉素B和10mg聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺溶于20ml甲醇，在50℃水 浴中减压旋转蒸发除去有机溶剂，加入蒸馏水10ml，水化15分钟，过0.22μm微孔滤膜过滤， 即得复合胶束。测得其包封率为95.8%，载药量为44.4%，粒径为57.89nm。

实施例2：聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺和两性霉素B的复合胶束制备（摩尔比为4:1）

称取0.8mg两性霉素B和10mg聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺溶于10ml甲醇-二甲基亚砜 （1:1），在50℃水浴中减压旋转蒸发除去有机溶剂，加入磷酸缓冲盐10ml水化20分钟，过 0.22μm微孔滤膜过滤，加入20mg甘露醇作为冻干保护剂，冷冻干燥。用注射用水复溶，测 得其包封率为99.5%，载药量为7.4%，粒径为60.03nm。

实施例3：聚乙二醇4000-磷脂酰乙醇胺和两性霉素B的复合胶束制备（摩尔比为0.5:1）

称取6.6mg两性霉素B和10mg聚乙二醇4000-磷脂酰乙醇胺溶于18ml甲醇，在60℃水 浴中减压旋转蒸发除去有机溶剂，加入蒸馏水10ml水化15分钟，过0.22μm微孔滤膜过滤， 即得复合胶束。测得其包封率为98.7%，载药量为39.8%，粒径为62.02nm。

实施例4：聚乙二醇2000-磷脂酰肌醇和两性霉素B复合胶束的制备（摩尔比为3:1）

称取1.1mg两性霉素B和10mg聚乙二醇2000-磷脂酰肌醇胺溶于18ml甲醇，在60℃水浴中 减压旋转蒸发除去有机溶剂，加入蒸馏水10ml水化15分钟，过0.22μm微孔滤膜过滤，即 得复合胶束。测得其包封率为99.8%，载药量为9.9%，粒径为63.42nm。

实施例5：聚乙二醇4000-磷脂酰乙醇胺和两性霉素B的复合胶束制备（摩尔比为1:1）

称取3.3mg两性霉素B和10mg聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺溶于10ml甲醇-二甲基亚砜（1:1）， 在50℃水浴中减压旋转蒸发除去有机溶剂，加入磷酸缓冲盐10ml水化20分钟，过0.22μm 微孔滤膜过滤，加入20mg甘露醇作为冻干保护剂，冷冻干燥。用注射用水复溶，测得其包封 率为99.5%，载药量为24.8%，粒径为58.62nm。

实施例6：聚乙二醇4000-磷脂酰乙醇胺和两性霉素B的复合胶束制备（摩尔比为2:1）

称取1.7mg两性霉素B和10mg聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺溶于10ml甲醇，在50℃水浴中 减压旋转蒸发除去有机溶剂，加入蒸馏水10ml，水化15分钟，过0.22μm微孔滤膜过滤，即 得复合胶束。测得其包封率为99.8%，载药量为14.5%，粒径为56.89nm。

实施例7：按实施例3法制备的载药胶束，冷冻干燥后，称取1.0mg溶于0.5ml氘水中，使用 Mercury Plus400MHz核磁共振波谱仪鉴定，获得核磁共振图谱（如图4）。分别称取1.0mg 的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺、两性霉素B和两者的混合物（mol:mol1:2）溶于0.5ml氘 代二甲基亚砜中，使用Mercury Plus400MHz核磁共振波谱仪鉴定，获得核磁共振图谱（如 图1、2和3）。如图可知，形成载药胶束后，聚合物磷脂端的核磁振动吸收峰消失，只显示了 聚乙二醇端的吸收峰，表明聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺形成了稳定的核壳结构；两性霉素B 的核磁振动吸收峰消失，表明两性霉素B被包载在胶束核内。

实施例8：按实施例3法制备的载药胶束，冷冻干燥后，采用Brukervector22型红外光谱仪 分别测定聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺、两性霉素B、实施例3制备的冻干粉的红外光谱，方 法是固体样品和溴化钾粉末混合研磨，进行压片，然后直接进行测试。扫描所得红外图谱如 5～8，由图可知聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺位于1738cm^-1处(-C=O)的吸收峰位移至1730cm^-1，两性 霉素B位于3411cm处(-OH)的吸收峰位移至3419cm^-1，表明两者之间具有相互作用。

实施例9：复合胶束包封率和载药量的测定方法

精密吸取0.5ml实施例1～6的产品溶液，缓缓加于葡聚糖凝胶柱上，以3000r/min离心2 分钟，收集前三管滤液，合并，甲醇稀释，采用紫外分光光度计测定，按下式计算包封率和 载药量：

其中，W₁为包裹在胶束中的药物质量；W₂为投药量，W₃为载体材料质量。测得实施例1～6所制备的 产品的包封率和载药量如表1。表中数据表明。

表1实例1～6产品的包封率和载药量

实施例10：两性霉素B复合胶束在生理盐水中的稳定性研究

将实施例1～6所制备的产品分别用100ml生理盐水进行稀释，使用马尔文粒径测定仪分 别于0.5、1、2、4、6、12、24小时后测定其粒径。粒径测定结果如表2。

表2.两性霉素B复合胶束在生理盐水中的稳定性

实施例11：两性霉素B复合胶束冻干粉末稳定性的研究

将实施例3所制备的两性霉素B复合胶束，加入冻干保护剂，冷冻干燥后于室温放置， 分别于1、2、4、6、8、10、20、30天用注射用水复溶，并测定其包封率、载药量和粒径。 测定结果如表3。

表3.两性霉素B复合胶束冻干粉的稳定性

实施例12：两性霉素B胶束体外释放的考察

取实施例1～6所制备的两性霉素B胶束各2ml，置于透析袋（分子量12000～15000）内，再 放入装有200mL pH10.0PBS释放介质的锥形瓶内。将锥形瓶置于恒温振荡器内，于37℃、100r/min 的条件上进行释药实验。分别于0.5、1、2、4、6、12、24、36、48、72h取透析外液，同时 补加等量的相同温度的释放介质。使用紫外分光光度计测定药物释放量，绘制释放曲线如图9。

结果表明，两性霉素B复合胶束具有非常明显的缓释特征。

实施例13：两性霉素B复合胶束体外溶血性的考察

取健康新西兰大耳兔1只，耳缘静脉取血，置于经肝素处理的试管内，加入适量0.9%氯化 钠注射液洗涤。2000r/min离心10min,弃去上清液。重复上述操作数次,直至离心后上清液 呈无色透明。弃去上清液，将所得红细胞加入0.9%氯化钠注射液进行稀释，配制成2%的红细胞 混悬液，备用。

将实施例3所制备的载药胶束、注射用两性霉素B、注射用两性霉素B脂质体和两性霉素B 的游离溶液使用生理盐水稀释，配制浓度范围为2～256μg/ml的系列浓度溶液。精密吸取上述溶 液2.5ml，置于试管中，然后加入2%红细胞混悬液2.5ml，混匀，于37℃下培养3h后，将样品 溶液置于冰浴中，终止溶血反应，以2000r/min离心10min,吸取上清液,于540nm处测定其吸光 度，按下述公式计算溶血率:

四种溶液在3h时的溶血情况如图10。实施例3所制备胶束制剂溶血率显著低于其他三种溶液。 实施例14：两性霉素B复合胶束体外抗菌效果的考察

采用RPMI1640液体培养基稀释白色念珠菌溶液，配制成浓度约0.5～2.5×10³CFU/mL的接 种菌液。将实施例3所制备的胶束，注射用两性霉素B和两性霉素B的游离溶液用RPMI1640液 体培养基进行倍比稀释。将药物溶液与空白对照溶液分别加入96孔板中，再加入0.1mL含菌 培养液。将96孔板置于恒温培养箱中35℃培养48h，观察结果。用酶联免疫监测仪在540nm处 测定96孔板各孔的光密度值。计算MIC值如表3。

表3三种溶液的体外抗真菌结果

综上所述，两性霉素B复合胶束与现有普通注射剂和脂质体相比，具有明显的优势，主要体 现在如下几个方面：1.载药量高，本发明的两性霉素B聚合物胶束制剂中药物的浓度可达 1.2mg/ml，显著高于普通注射液、两性霉素B脂质体；2.本发明的两性霉素B聚合物胶束制 剂溶血性明显小于普通注射液和两性霉素B脂质体；3.本发明的两性霉素B聚合物胶束制剂 的体外抗真菌效果明显好于普通注射液；4.本发明的两性霉素B聚合物胶束制剂缓释效果明 显好于两性霉素B脂质体。