对虾白斑综合症病毒(WSSV)的LAMP检测引物组及试剂盒

摘要

本发明公开了一种WSSV对虾白斑综合症病毒（WSSV）LAMP检测引物组、检测试剂盒。检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照品；试剂盒还包含显色剂。本发明的试剂盒操作简便快速，适合现场检测；特异性强；检测灵敏度高，可达到1fg/μL；准确率高、可靠，具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种对虾白斑综合症病毒（WSSV）的LAMP检测引物组及检测试剂盒。

背景技术

白斑综合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)是1993年世界范围内对虾暴发性流行病的主要病原，迄今仍然没有能有效控制WSSV疫情的技术措施。国内外学者普遍认为，综合预防是相对有效的方法，即尽早发现疾病并采取诸多措施阻止病毒传播。因此，建立灵敏、准确、快捷、方便的WSSV病原检测方法是减少白斑综合征发生和危害的重要途径。目前WSSV病原的检测方法主要有目视观察法、组织学方法、电子显微技术、生化检验法、免疫学方法和分子生物学方法等。目前检测方法正向更特异、更快速、更便捷、更安全、集成化、微量化、定量化、费用低廉化的方向发展，但这种方法耗时、特异性和灵敏度低，远不能满足日常快速检测工作的需要。自问世以来，PCR 技术凭借灵敏、特异、快速等优点，被普遍应用于水产养殖病原的检测中。但PCR 技术对实验环境和操作要求苛刻，产物容易污染，导致假阳性。与一般PCR 技术相比，荧光PCR 检测技术简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染，减少假阳性的发生。但实时荧光PCR 成本较高，目前在水产养殖动物的常规病原体检测中的应用还不多。建立检测WSSV快速准确的方法，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进中国海洋养殖及其产品的贸易有重要作用。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是NOTOMI等建立的一种新的核酸扩增技术，在60~65 ℃的恒温条件下，历时30~60 min，即可完成核酸扩增反应。LAMP 反应中可形成明显的白色焦磷酸镁沉淀，可通过对浊度的观察或加入荧光染料，直接通过颜色变化来判定反应结果。该技术具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点，已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等病原体的检测研究，并取得了较理想的效果。

德国QIAGEN公司研发的恒温反应及检测仪器ESE-Quant tube scanner通过吸收荧光来实时判断反应的进行。比传统LAMP终点判断产物的浊度或颜色变化更客观可靠。由于过程的数据化和自动化，可用于科研，开发新的检测方法。由于其便携、易操作，比起定量PCR仪，节约了大量成本，适合基层推广检测，符合疾病检测的快速、准确的诊断需要。

由于ESE-Quant tube scanner通过吸收荧光来判断反应是否进行，前期研究发现，常用的荧光显色剂SYBR Green I过于灵敏，在ESE-Quant tube scanner上常造成阴性反应孔出现非特异性的扩增曲线，影响结果判断。尤其在样品不纯的情况下。此反应对模板纯度要求较高，如果样品杂质含量较多，ESE-Quant tube scanner上的扩增曲线将呈现不集中，倾斜向上等。SYTO-9作为SYBR Green I的下一代产品荧光显色剂可以避免上述缺陷。

对于WSSV病毒DNA的提取可采用研磨法提取上清中的病毒核酸，而不采用蛋白酶消化组织的方法。样品为成年虾的，主要采集消化腺、前足等，虾苗则直接研磨。对于虾仁的检测，先用匀浆机对数个虾仁进行匀浆，再取少量虾肉进行研磨提取。这样节省了蛋白酶作用的时间，更重要的是消除了大量杂质及色素，减少了对后续LAMP反应的抑制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对虾白斑综合症病毒的LAMP检测引物组。

本发明的另一个目的在于提供一种对虾白斑综合症病毒的LAMP检测试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供对虾白斑综合症病毒的LAMP检测方法。

本发明所采用的技术方案如下：

一种对虾白斑综合症病毒（WSSV）的LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

WSSV-F3：ACAACACTGTGACCAAGAC（SEQ ID NO:1）；

WSSV-B3：GTTCCACACCTTGAATGTTC（SEQ ID NO:2）；

WSSV-FIP：CCCAAGGTGTCGCTGTCAACTGTGACTGCTGAGGTTG（SEQ ID NO:3）；

WSSV-BIP：CCGCAATGGAAAGTCTGATGCCACGGGAGTGATGACAAG（SEQ ID NO:4）；

WSSV-LF：CAGTCATCTTGAAGTAGCCTGA（SEQ ID NO:5）；

WSSV-LB：ATGAAGGAAGAAGATGCGGAT（SEQ ID NO:6）。

一种对虾白斑综合症病毒（WSSV）的LAMP检测试剂盒，包括上述3对检测引物组。

上述检测试剂盒，还包括DNA聚合酶、LAMP反应液、阳性对照和阴性对照。

上述检测试剂盒，其引物组中外引物、内引物、环引物的摩尔比为1︰8︰4。

上述检测试剂盒，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

上述检测试剂盒，所述LAMP反应液由10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO₄水溶液三者按体积比8︰5︰2组成。

上述检测试剂盒，所述阳性对照为含有对虾白斑综合症病毒（WSSV）囊膜蛋白基因片段的T载体，阴性对照为超纯水。

上述检测试剂盒中还可以含有显色剂，所述显色剂为荧光染料SYTO-9。

上述的试剂盒检测对虾白斑综合症病毒（WSSV）的方法，包括如下步骤：

1）待检样品DNA的提取：采用病毒DNA提取试剂盒提取样品DNA；

2）恒温基因扩增反应：25μl反应体系含有：WSSV-F3 0.2μM，WSSV-B3 0.2μM，WSSV-FIP 1.6μM，WSSV-BIP 1.6μM，WSSV-LF 0.8μM，WSSV-LB 0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶10U，待检DNA 1~100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于浊度仪上63℃反应30～60min，并在80℃持续2min；

3）结果判断：通过浊度仪软件自行分析反应管中的浊度变化来判断反应扩增结果。浊度仪软件界面出现“S”形扩增曲线为阳性，否则为阴性。

在上述试剂盒中含有显色剂的情况下，其LAMP检测方法包括如下步骤：

1）待检样品DNA的提取：采用病毒DNA提取试剂盒提取样品DNA；

2）恒温基因扩增反应：25μl反应体系含有：WSSV-F3 0.2μM，WSSV-B3 0.2μM，WSSV-FIP 1.6μM，WSSV-BIP 1.6μM，WSSV-LF 0.8μM，WSSV-LB 0.8μM，LAMP反应液12.5μL，DNA聚合酶10U，待检DNA 1~100ng，10×SYTO-9 0.5μL，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于浊度仪上63℃反应30～60min，并在80℃持续2min；

3）将反应管中置于ESE-Quant Tube Scanner中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。

本发明的有益效果是：

1）快速高效：整个扩增只用30～60min即可完成，扩增产量可达10⁹～10¹⁰个拷贝；

2）操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较温和；

3）高特异性：本发明对病毒 IHHNV（infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus）、副溶血弧菌（Vibrio Parahemolyticus）、创伤弧菌（Vibrio vulnificus）、O1群霍乱弧菌（Vibrio cholera O1）、O139群霍乱弧菌（Vibrio cholera O139）的 DNA均不发生扩增。

本发明设计的六条特异性引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；

4）高灵敏度：本发明的最低检测极限可达到2fg /反应；

5）鉴定简便：本发明可通过是否存在焦磷酸镁沉淀，或者加入SYTO-9，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。

附图说明

图1为LAMP检测方法对WSSV病毒的特异性实验图；

图2为LAMP检测方法对WSSV病毒的灵敏度实验图，从左到右的曲线依次为10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL 、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL、10ag/μL、1ag/μL的阳性标准品的扩增结果； 

图3为不同检测方法对WSSV病毒检测灵敏度的比较，A为本发明的LAMP检测方法对不同稀释倍数的WSSV病毒DAN样品检测的灵敏度，B为现有Real-time PCR检测方法对不同稀释倍数的WSSV病毒DAN样品检测的灵敏度，C为现有巢式PCR检测方法对不同稀释倍数的WSSV病毒DAN样品检测的灵敏度，D、E、F、G分别为现有不同的LAMP检测方法对不同稀释倍数的WSSV病毒DAN样品检测的灵敏度。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

实施例1：

一、对虾白斑综合症病毒LAMP检测试剂盒的建立

对虾白斑综合症病毒的LAMP检测试剂盒，包括LAMP引物组、LAMP反应液、BstDNA聚合酶、阳性对照和阴性对照。

1）LAMP引物设计：根据从Genbank上检索到的对虾白斑综合症病毒（WSSV）的核酸序列，选取保守序列，设计用于检测WSSV的特异性引物，其序列见下表1： 

表1 引物序列表

2）LAMP反应液：将10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO₄水溶液三者按体积比8︰5︰2混合。

3）阳性对照为含有靶序列片段的T载体，其制备方法为：以分离鉴定的对虾白斑综合症病毒DNA为模板，利用表1中的外引物（SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2）对WSSV DNA进行扩增，所得基因片段长度为290bp，序列如SEQ ID NO:7所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为阳性对照。

4）阴性对照为超纯水。

二、使用浊度仪的对虾白斑综合症病毒LAMP检测

利用本发明试剂盒检测对虾白斑综合症病毒，包括如下步骤：

1） 待检样品DNA的提取：采用病毒DNA提取试剂盒提取样品DNA；

2）恒温基因扩增反应：25μL反应体系含有：0.2μM WSSV-F3，0.2μM WSSV-B3，1.6μM WSSV-FIP，1.6μM WSSV-BIP，0.8μM WSSV-LF，0.8μM WSSV-LB，LAMP反应液12.5μL，BstDNA聚合酶10U，待检DNA 1~100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于浊度仪上63℃反应30～60min，并在80℃持续2min；

3）结果判断：通过浊度仪软件自行分析反应管中的浊度变化来判断反应扩增结果。浊度仪软件界面出现“S”形扩增曲线为阳性，否则为阴性。

三、使用ESE-Quant tube scanner的对虾白斑综合症病毒LAMP检测

利用本发明试剂盒（选用SYTO-9荧光显色剂）检测对虾白斑综合症病毒，包括如下步骤： 

1）待检样品DNA的提取：采用病毒DNA提取试剂盒提取纯化待测样品DNA；

2）恒温基因扩增反应：25μL反应体系含有：0.2μM WSSV-F3，0.2μM WSSV-B3，1.6μM WSSV-FIP，1.6μM WSSV-BIP，0.8μM WSSV-LF，0.8μM WSSV-LB，LAMP反应液12.5μL，BstDNA聚合酶10U，10×SYTO-9 0.5μL，待检DNA1~100ng，用超纯水补齐到25μL；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，于63℃反应60min，并在80℃持续2min；

3）结果判断：将反应管放置在ESE-Quant tube scanner中进行反应，观察ESE-Quant tube scanner软件判断扩增结果，如果出现“S”型曲线则为阳性，无“S”型曲线则为阴性。

四、特异性实验

为了检测本发明试剂盒的特异性，采用上述3中的LAMP检测方法，分别对病毒WSSV、IHHNV、Vibrio Parahemolyticus、Vibrio vulnificus、Vibrio cholera O1和Vibrio cholera O139进行检测，分析本试剂盒对WSSV病毒和对虾其他常见病毒的检测情况。

检测结果表明：仅病毒WSSV 样品出现正常扩增，阴性对照（超纯水）及病毒IHHNV、Vibrio Parahemolyticus、Vibrio vulnificus、Vibrio cholera O1和Vibrio cholera O139样品均未出现扩增（如图1所示）。上述结果说明，本发明LAMP检测试剂盒能特异性扩增出病毒WSSV中的靶序列，而不与其它病毒核酸发生交叉反应。说明本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阳性。

五、灵敏度实验

提取阳性质粒（含有靶序列片段的T载体），并用紫外分光光度计测量阳性质粒的浓度，并将其分别稀释到10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL 、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL、10ag/μL、1ag/μL。采用上述3中的LAMP检测方法，分别对稀释后不同浓度的阳性标准品进行扩增检测。

检测结果如图2所示，从左到右的曲线依次为10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL 、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL、10ag/μL、1ag/μL的阳性标准品的扩增结果，从中可以看出本发明的LAMP试剂盒检测的灵敏度可达1fg/μL，精确性优于普通PCR检测方法，表明本发明的LAMP试剂盒和检测方法对病毒WSSV的诊断具有高度的灵敏性。

六、不同检测方法的灵敏度比较

为了进一步明确本发明LAMP检测灵敏度的优越性，提取WSSV的DNA，并以10的倍数进行系列稀释，即10⁰至10⁷倍稀释的样品，以所有稀释倍数的样品分别为模板，分别用本发明的LAMP检测方法、Real-time PCR法（Zhu et al., 2012：Zhu F, Quan H. A new method for quantifying white spot syndrome virus: Experimental challenge dose using TaqMan real-time PCR assay. J Virol Methods, 2012,184(1-2):121-124）、巢式PCR法（OIE，2009：OIE. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals. 2012, 177-190）及另外4种已报道的LAMP方法进行病毒WSSV的检测（如图3所示），比较各种检测方法的灵敏度。其中，4种已报道的LAMP方法分别源自文章Kono et al., 2004：Kono T, Savan R, Sakai M, Itami T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification [J]. J Virol Methods. 2004 Jan;115(1):59-65；Mekata et al., 2009：Mekata T, Sudhakaran R, Kono T, et al. Real-time quantitative loop-mediated isothermal amplification as simple method for detecting white spotsyndrome virus [J]. Lett Appl Microbiol, 2009, 48(1):25-32；Jaroenram et al., 2009：Jaroenram W, Kiatpathomchai W, Flegel TW. Rapid and sensitive detection of white spot syndrome virus by loop-mediated isothermalamplification combined with a lateral flow dipstick [J]. Mol Cell Probes, 2009, 23(2):65-70；Chou et al., 2011：Chou PH, Lin YC, Teng PH, et al. Real-time target-specific detection of loop-mediated isothermal amplification for white spot syndrome virus using fluorescence energy transfer-based probes. J Virol Methods, 2011, 173(1):67-74。

从图3所示的检测结果中，可获知本发明的LAMP检测方法可检测出稀释到10⁵倍的样品（如图3 A）；Real-time PCR方法（Zhu et al., 2012）也能检测出稀释到10⁵倍的样品（如图3 B），其中，扩增目的片段长度为154bp，反应在Applied Bio systems 7500实时定量PCR仪进行；巢式PCR方法（OIE，2009）能检测出稀释到10⁴倍的样品（如图3 C），其中，外引物扩增目的片段为l447bp，内引物扩增目的片段为941bp，PCR反应结束后取5μL产物，在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析；Kono et al., 2004和 Jaroenram et al., 2009的LAMP方法均能检测出稀释到10⁴倍的样品（如图3 D和E），而Mekata et al., 2009和 Chou et al., 2011的LAMP方法均只能检测出稀释到10³倍的样品（如图3 F和G）。

综合上述的检测结果，本发明的LAMP检测方法与Real-time PCR检测方法具有相同的灵敏度，但LAMP检测方法只需在恒温条件下进行，对设备要求低，且不需要荧光标记的探针，与荧光定量Real-time PCR相比，节约了大量成本，更适合水产养殖的检测；本发明的LAMP方法对WSSV检测的灵敏度均高于巢式PCR和4种现有LAMP检测方法的灵敏度（如图3所示）。

七、本发明LAMP检测试剂盒在临床实际应用中的评估

采用本发明试剂盒进行临床盲检的实验，检测66份对虾样品，采用上述3中的LAMP检测方法。同时应用巢式PCR检测方法对66份样品的检测作为对比。

结果显示，本发明试剂盒标本检测阳性率为7.57%（66份样品中有5份阳性），巢式PCR方法的阳性率为6.06%（66份样品中有4份阳性），两种检测结果中的4份阳性结果相同，存在一个阳性结果不同，对这个样品DNA进PCR扩增并测序，测序结果显示该样品为阳性。说明本发明的LAMP检测试剂盒具有更高的准确率。

本发明的LAMP检测试剂盒经过多次不同的重复实验证实，具有良好的重复性和稳定性。

<110>  广州迪澳生物科技有限公司

 

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