靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠Rosa26位点的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠Rosa26位点的方法及其应用，本发明通过构建的TALEN质粒、小鼠同源重组模板质粒和大鼠同源重组模板质粒，并将该相应的质粒分别转入小鼠或大鼠细胞中，能获得的稳定细胞株，用于表达各种外源基因。获得的稳定细胞株可以稳定传代，遗传背景清晰，准确的表现外源基因的生物学功能。

说明书

技术领域

本发明涉及一种整合外源DNA序列的方法和应用，特别是涉及一种靶向整合外源DNA序列到大鼠或小鼠Rosa26位点的方法及其应用。

背景技术

TALEN（Transcription Activator-like Effector Nuclease）技术是一种崭新的分子生物学工具。利用TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，再通过添加内切酶结构域，TALEN蛋白可以靶向切割基因组DNA【Cermak T,Doyle EL,Christian M,et al.,Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs forDNA targeting.Nucleic Acids Res.2011.39(12):e82.】。在同源模板存在的情况下（Donor质粒），细胞会发生同源重组，从而高效精确地对基因组进行编辑【Zu Y,Tong X,Wang Z,et al.TALEN-mediated precise genomemodification by homologous recombination in zebrafish.Nat Methods.2013.10(4):329-31.】。TALEN技术可以广泛的应用于基因组编辑的各个方面：细胞水平的基因敲除，定点点突变，结构域缺失，定点整合等等，在疾病治疗领域具有广泛的应用前景【Sun N,Zhao H.Transcription activator-like effector nucleases(TALENs):a highly efficient and versatile tool for genome editing.Biotechnol Bioeng.2013.110(7):1811-21.】。

目前TALEN技术主要的缺陷是效率相对较低，一般在5%-20%，无法直接获取100%编辑的细胞，只能通过挑选阳性的单克隆细胞，扩增成为稳定株。

另外，当前在大鼠和小鼠细胞中构建定点整合稳定株还是基本采用如下的传统稳定株筛选方式:

1）线性化质粒筛选单克隆稳定株

2）慢病毒感染细胞筛选混合稳定株

这两种常用的方法都有严重的缺陷：质粒筛选稳定株的周期长，效率低，整合位点不确定，需要一直使用抗生素维持，容易导致非正常的细胞表型；慢病毒筛选稳定株周期较短，但是整合位点不确定且集中与一些高表达的热点区域，需要一直使用抗生素维持，同时慢病毒载体携带的病毒基因对细胞正常生理功能影响巨大。这些缺点使这两种方式筛选到的稳定细胞株不能有效的代表外源整合基因的生物学功能，造成一些实验上的假象，使实验结论没有说服力。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠Rosa26位点的方法及其应用。本发明利用TALEN技术解决了上述传统方法的缺陷。同时本发明还实现了使用同一对TALEN质粒同时对小鼠和大鼠细胞Rosa26位点实现切割，配合各自的同源重组模板，实现对小鼠和大鼠细胞Rosa26位点基因定点整合任意外源DNA序列。

为解决上述技术问题，本发明的第一方面，提供一种用于靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠的TALEN识别Rosa26位点，该TALEN识别Rosa26位点的上游识别序列如SEQ ID NO.1所示，下游识别序列如SEQ ID NO.2所示。

其中，SEQ ID NO.1-2是一对同时存在于大鼠和小鼠Rosa26保守位点的序列。

本发明的第二方面，提供一种一对用于识别上述位点的TALEN质粒，该一对TALEN质粒是上游TALEN质粒和下游TALEN质粒，其中，上游TALEN质粒含有SEQ ID NO.3所示的碱基序列，下游TALEN质粒含有SEQ ID NO.4所示的碱基序列。

所述上游TALEN质粒优选为含有SEQ ID NO.3所示的碱基序列的HY-TALEN-Rosa26-U质粒（表达载体），下游TALEN质粒优选为含有SEQ ID NO.4所示的碱基序列的HY-TALEN-Rosa26-D质粒（表达载体）。

本发明的第三方面，提供一种用于靶向整合外源DNA序列到小鼠的TALEN识别Rosa26位点的小鼠同源重组模板质粒，该质粒含有SEQ ID NO.5所示的碱基序列。

所述小鼠同源重组模板质粒，优选为含有SEQ ID NO.5所示的碱基序列的HY-HR-mRosa26质粒（HY-HR同源重组载体）。

本发明的第四方面，提供一种用于靶向整合外源DNA序列到大鼠的TALEN识别Rosa26位点的大鼠同源重组模板质粒，该质粒含有SEQ ID NO.6所示的碱基序列。

所述大鼠同源重组模板质粒，优选为含有SEQ ID NO.6所示的碱基序列的HY-HR-rRosa26质粒（HY-HR同源重组载体）。

本发明的第五方面，提供一种定点整合稳定细胞株构建方法，该细胞株构建方法使用一对上述的TALEN质粒和小鼠同源重组模板质粒，或使用一对上述的TALEN质粒和大鼠同源重组模板质粒。

本发明的第六方面，提供一种用于靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠的TALEN识别Rosa26位点的试剂盒，包括：上述的TALEN质粒、小鼠同源重组模板质粒和大鼠同源重组模板质粒。

本发明的第七方面，提供一种用于靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠的TALEN识别Rosa26位点的试剂盒在药物筛选和动物模型制备中的应用，如利用上述的TALEN质粒、小鼠同源重组模板质粒和大鼠同源重组模板质粒等进行药物筛选和动物模型的制备。

通过本发明构建的质粒（TALEN质粒、小鼠同源重组模板质粒和大鼠同源重组模板质粒），并将该相应的质粒分别转入小鼠或大鼠细胞中，能获得的稳定细胞株，而且该细胞株具有以下有益效果：

1）遗传背景清晰，定点整合到Rosa26位点；

2）外源表达稳定，不受到细胞其它基因的干扰；

3）对细胞本身基因的表达无影响；

4）无需抗生素筛选培养；

5）稳定细胞株筛选成功率高；

6）筛选周期缩短。

利用本发明可以高效快速精确地构建大鼠和小鼠的稳定细胞株，用于表达各种外源基因。获得的稳定细胞株可以稳定传代，遗传背景清晰，准确的表现外源基因的生物学功能。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是大鼠和小鼠Rosa26位点的序列图；

图2是HY-TALEN表达载体的示意图；

图3是HY-HR同源重组模板载体的示意图；

图4是小鼠B16FO细胞Rosa26定点整合稳定株的荧光图；其中，a为小鼠B16FO细胞荧光显微镜明场照片,b为小鼠B16FO细胞荧光显微镜照片；

图5是小鼠NIH-3T3细胞Rosa26定点整合稳定株的荧光图；其中，a为小鼠NIH-3T3细胞荧光显微镜明场照片,b为小鼠NIH-3T3细胞荧光显微镜照片；

图6是大鼠C6细胞Rosa26定点整合稳定株的荧光图；其中，a为小鼠C6细胞荧光显微镜明场照片,b为小鼠C6细胞荧光显微镜照片；

图7是大鼠208F细胞Rosa26定点整合稳定株的荧光图；其中，a为小鼠208F细胞荧光显微镜明场照片,b为小鼠208F细胞荧光显微镜照片；

图8是小鼠B16FO细胞Rosa26定点整合稳定株PCR鉴定电泳图；

图9是大鼠C6细胞Rosa26定点整合稳定株PCR鉴定电泳图。

具体实施方式

以下涉及的化学试剂和生物制品，如未特别说明都为商业化产品。另外，其他未注明的实验操作按照常规分子生物学操作方法进行。

实施例1

一、大鼠和小鼠的TALEN识别Rosa26位点

经研究发现，一个能用于靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠的TALEN识别Rosa26位点，该TALEN识别Rosa26位点的上游、下游识别序列分别如下所示：

上游识别序列：5’-agccaataatcaaatt-3’（如SEQ ID NO.1所示）

下游识别序列：5’-agttccttggtaacatt-3’（如SEQ ID NO.2所示）。

其中，详细信息可如图1所示。

二、识别上述位点的一对TALEN质粒的构建

1、TALEN识别Rosa26位点的上游和下游TALEN序列合成及酶切

化学合成以下的上游和下游TALEN序列（CDS编码区），这两个序列的两端带BsmB I位点。对于合成后的序列，使用BsmB I酶进行酶切，胶回收2.9kb片段，分别得到片段一和片段二。

上游TALEN序列（如SEQ ID NO.3所示）：

5’-ATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGATGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGGCATTCACCGCGGGGTACCTATGGTGGACTTGAGGACACTCGGTTATTCGCAACAGCAACAGGAGAAAATCAAGCCTAAGGTCAGGAGCACCGTCGCGCAACACCACGAGGCGCTTGTGGGGCATGGCTTCACTCATGCGCATATTGTCGCGCTTTCACAGCACCCTGCGGCGCTTGGGACGGTGGCTGTCAAATACCAAGATATGATTGCGGCCCTGCCCGAAGCCACGCACGAGGCAATTGTAGGGGTCGGTAAACAGTGGTCGGGAGCGCGAGCACTTGAGGCGCTGCTGACTGTGGCGGGTGAGCTTAGGGGGCCTCCGCTCCAGCTCGACACCGGGCAGCTGCTGAAGATCGCGAAGAGAGGGGGAGTAACAGCGGTAGAGGCAGTGCACGCCTGGCGCAATGCGCTCACCGGGGCCCCCTTGAACCTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCGAACATTGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCAAATAATAACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCGCATGACGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCAGCCATGATGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCGAACATTGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCAAGCAACATCGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCCAACGGTGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCTCCAATATTGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCGAACATTGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCAAGCAATGGGGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCGCATGACGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCTCCAATATTGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCGAACATTGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCAAGCAACATCGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCCAACGGTGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTCTGACACCCGAACAGGTGGTCGCCATTGCTTCTAATGGGGGAGGACGGCCAGCCTTGGAGTCCATCGTAGCCCAATTGTCCAGGCCCGATCCCGCGTTGGCTGCGTTAACGAATGACCATCTGGTGGCGTTGGCATGTCTTGGTGGACGACCCGCGCTCGATGCAGTCAAAAAGGGTCTGCCTCATGCTCCCGCATTGATCAAAAGAACCAACCGGCGGATTCCCGAGAGAACTTCCCATCGAGTCGCGGGATCCCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAACAAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTCAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTTTAA-3’；

下游TALEN序列（如SEQ ID NO.4所示）：

5’-ATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGATGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGGCATTCACCGCGGGGTACCTATGGTGGACTTGAGGACACTCGGTTATTCGCAACAGCAACAGGAGAAAATCAAGCCTAAGGTCAGGAGCACCGTCGCGCAACACCACGAGGCGCTTGTGGGGCATGGCTTCACTCATGCGCATATTGTCGCGCTTTCACAGCACCCTGCGGCGCTTGGGACGGTGGCTGTCAAATACCAAGATATGATTGCGGCCCTGCCCGAAGCCACGCACGAGGCAATTGTAGGGGTCGGTAAACAGTGGTCGGGAGCGCGAGCACTTGAGGCGCTGCTGACTGTGGCGGGTGAGCTTAGGGGGCCTCCGCTCCAGCTCGACACCGGGCAGCTGCTGAAGATCGCGAAGAGAGGGGGAGTAACAGCGGTAGAGGCAGTGCACGCCTGGCGCAATGCGCTCACCGGGGCCCCCTTGAACCTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCGAACATTGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCAAATAATAACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCCAACGGTGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCTCGAATGGCGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCACATGACGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCATCCCACGACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCCAACGGTGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCTCGAATGGCGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGAACAATAATGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCAAATAATAACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCCAACGGTGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCTCCAATATTGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCGAACATTGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCATCCCACGACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCGAACATTGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCTCGAATGGCGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACACCCGAACAGGTGGTCGCCATTGCTTCTAATGGGGGAGGACGGCCAGCCTTGGAGTCCATCGTAGCCCAATTGTCCAGGCCCGATCCCGCGTTGGCTGCGTTAACGAATGACCATCTGGTGGCGTTGGCATGTCTTGGTGGACGACCCGCGCTCGATGCAGTCAAAAAGGGTCTGCCTCATGCTCCCGCATTGATCAAAAGAACCAACCGGCGGATTCCCGAGAGAACTTCCCATCGAGTCGCGGGATCCCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAACAAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTCAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTTTAA-3’。

2、HY-TALEN质粒酶切

对如图2所示的HY-TALEN质粒（和元公司）使用BsmB I酶切，胶回收6.4kb的载体片段。

3、将片段一和片段二与载体片段分别连接，按照摩尔比（质粒:片段=1:7）进行混合，在20μl体系下，进行连接转化DH5α大肠杆菌，在含有Amp抗性（工作浓度为100微克/毫升）的平铺上均匀涂布，筛选得到阳性克隆，挑取克隆，37℃摇菌16个小时，抽提质粒，获得HY-TALEN-Rosa26-U(识别上游位点)和HY-TALEN-Rosa26-D(识别下游位点)质粒。

4、测序

选择Amp抗性的阳性克隆，并测序证实序列正确。

三、同源重组模板质粒构建

1、引物设计

1）以小鼠基因组DNA为模板，设计以下引物序列：

A、mRosa26ARM1调取引物mRosa26-ARM1-1和mRosa26-ARM1-2：

mRosa26-ARM1-1：

5’-AACGACGGCCAGTGATATCCAATAGATGTATTGAGAATCCAAC-3’（如SEQ ID NO.7所示）；

mRosa26-ARM1-2：

5’-TATACGAAGTTATGTTAACCATATTGGAACAAACACAAAG-3’（如SEQ ID NO.8所示）

PCR扩增产物预计854bp。

B、mRosa26ARM2调取引物mRosa26-ARM2-1和mRosa26-ARM2-2：

mRosa26-ARM2-1：

5’-AAGTAGCTTGGCGGCGGCCGCGAAGTGTAACTGTGGACAGAGG-3’（如SEQ ID NO.9所示）；

mRosa26-ARM2-2：

5’-ACCATGATTACGCCACTAGTGGAGGGACTCATTTAATATTAGTC-3’（如SEQ ID NO.10所示）；

PCR扩增产物预计850bp。

2）以大鼠基因组DNA为模板，设计以下引物序列：

A、rRosa26ARM1调取引物rRosa26-ARM1-1和rRosa26-ARM1-2：

rRosa26-ARM1-1：

5’-AACGACGGCCAGTGATATCGTACACTTTGTTGATTCTTTGCC-3’（如SEQ ID NO.11所示）；

rRosa26-ARM1-2：

5’-TATACGAAGTTATGTTAACCATGTTGGAACAATACAAACAG-3’（如SEQ ID NO.12所示）；

其PCR扩增产物预计843bp。

B、rRosa26ARM2调取引物rRosa26-ARM2-1和rRosa26-ARM2-2：

rRosa26-ARM2-1：

5’-AAGTAGCTTGGCGGCGGCCGCGAAGTGTAACTGTGGACAGAGG-3’（如SEQ ID NO.13所示）；

rRosa26-ARM2-2：

5’-ACCATGATTACGCCACTAGTATTCCCAACCCCACCCAG-3’（如SEQ ID NO.14所示）；

其PCR扩增产物预计871bp。

2、分别以小鼠和大鼠基因组模板PCR获取上游和下游同源臂

1）小鼠ARM1的调取

使用高保真的PrimeSTAR酶（Takara公司）扩增小鼠ARM1，反应体系和条件如下：按照以下比例混合50μl反应体系：小鼠基因组模板100ng,mRosa26-ARM1-1(10μM)1μl，mRosa26-ARM1-2引物(10μM)1μl，dNTP mixture(2.5mM)各4μl，PrimeStar Buffer10μl。按照以下程序进行PCR反应：98℃10秒，55℃15秒，72℃1分钟，重复30个循环。把目的基因条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书。

2）小鼠ARM2的调取

使用高保真的PrimeSTAR酶（Takara公司）扩增小鼠ARM2，反应体系和条件如下：按照以下比例混合50μl反应体系：小鼠基因组模板100ng，mRosa26-ARM2-1(10μM)1μl，mRosa26-ARM2-2引物(10μM)1μl，dNTP mixture(2.5mM)各4μl，PrimeStar Buffer10μl。按照以下程序进行PCR反应：98℃10秒，55℃15秒，72℃1分钟，重复30个循环。把目的基因条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书。

3）大鼠ARM1的调取

使用高保真的PrimeSTAR酶（Takara公司）扩增大鼠ARM1，反应体系和条件如下：按照以下比例混合50μl反应体系：小鼠基因组模板100ng，rRosa26-ARM1-1(10μM)1μl，rRosa26-ARM1-2引物(10μM)1μl，dNTP mixture(2.5mM)各4μl，PrimeStar Buffer10μl。按照以下程序进行PCR反应：98℃10秒，55℃15秒，72℃1分钟，重复30个循环。把目的基因条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书。

4）大鼠ARM2的调取

使用高保真的PrimeSTAR酶（Takara公司）扩增大鼠ARM2，反应体系和条件如下：按照以下比例混合50μl反应体系：小鼠基因组模板100ng，rRosa26-ARM2-1(10μM)1μl，rRosa26-ARM2-2引物(10μM)1μl，dNTP mixture(2.5mM)各4μl，PrimeStar Buffer10μl。按照以下程序进行PCR反应：98℃10秒，55℃15秒，72℃1分钟，重复30个循环。把目的基因条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书。

3、HY-HR质粒酶切

分别进行两步构建：

第一步为对如图3所示的HY-HR质粒（和元生物）和调取的小鼠和大鼠ARM1片段(mRosa26-ARM1和rRosa26-ARM1)分别使用EcoR V和Hpa I双酶切后，按照摩尔比（质粒:片段=1:7）进行混合，在20μl体系下，进行连接转化DH5α大肠杆菌，在含有Amp抗性（工作浓度为100微克/毫升）的平铺上均匀涂布，筛选得到阳性克隆，挑取克隆，37℃摇菌16个小时，抽提质粒，得到HY-HR-mRosa26-ARM1和HY-HR-rRosa26-ARM1质粒；

第二步为HY-HR-mRosa26-ARM1和HY-HR-rRosa26-ARM1质粒和调取的小鼠和大鼠ARM2片段(mRosa26-ARM2和rRosa26-ARM2)使用Not I和SpeI双酶切后，按照摩尔比（质粒:片段=1:7）进行混合，在20μl体系下，进行连接转化DH5α大肠杆菌，在含有Amp抗性（工作浓度为100微克/毫升）的平铺上均匀涂布，筛选得到阳性克隆，挑取克隆，37℃摇菌16个小时，抽提质粒，得到小鼠同源重组模板质粒(HY-HR-mRosa26)和大鼠同源重组模板质粒(HY-HR-rRosa26)。

小鼠同源重组模板质粒(HY-HR-mRosa26)，是应用于小鼠的可插入外源DNA序列的带有同源臂序列的的小鼠同源重组模板质粒；大鼠同源重组模板质粒(HY-HR-rRosa26)是应用于大鼠的可插入外源DNA序列的带有同源臂序列的大鼠同源重组模板质粒。

其中，小鼠同源重组模板质粒(HY-HR-mRosa26)，含有SEQ ID NO.5所示的碱基序列（左侧同源臂-CMV-EGFP-IRES-Puromycin-右侧同源臂）。该序列中同源臂部分使用PCR引物从小鼠基因组模板获取。

大鼠同源重组模板质粒(HY-HR-rRosa26),含有SEQ ID NO.6所示的碱基序列（左侧同源臂-CMV-EGFP-IRES-Puromycin-右侧同源臂）。该序列中同源臂部分使用PCR引物从大鼠基因组模板获取。

SEQ ID NO.5所示的碱基序列：

5’-CAATAGATGTATTGAGAATCCAACCTAAAGCTTAACTTTCCACTCCCATGAATGCCTCTCTCCTTTTTCTCCATTTATAAACTGAGCTATTAACCATTAATGGTTTCCAGGTGGATGTCTCCTCCCCCAATATTACCTGATGTATCTTACATATTGCCAGGCTGATATTTTAAGACATTAAAAGGTATATTTCATTATTGAGCCACATGGTATTGATTACTGCTTACTAAAATTTTGTCATTGTACACATCTGTAAAAGGTGGTTCCTTTTGGAATGCAAAGTTCAGGTGTTTGTTGTCTTTCCTGACCTAAGGTCTTGTGAGCTTGTATTTTTTCTATTTAAGCAGTGCTTTCTCTTGGACTGGCTTGACTCATGGCATTCTACACGTTATTGCTGGTCTAAATGTGATTTTGCCAAGCTTCTTCAGGACCTATAATTTTGCTTGACTTGTAGCCAAACACAAGTAAAATGATTAAGCAACAAATGTATTTGTGAAGCTTGGTTTTTAGGTTGTTGTGTTGTGTGTGCTTGTGCTCTATAATAATACTATCCAGGGGCTGGAGAGGTGGCTCGGAGTTCAAGAGCACAGACTGCTCTTCCAGAAGTCCTGAGTTCAATTCCCAGCAACCACATGGTGGCTCACAACCATCTGTAATGGGATCTGATGCCCTCTTCTGGTGTGTCTGAAGACCACAAGTGTATTCACATTAAATAAATAAATCCTCCTTCTTCTTCTTTTTTTTTTTTTTTAAGAGAATACTGTCTCCAGTAGAATTTACTGAAGTAATGAAATACTTTGTGTTTGTTCCAATATGGTTAACATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATACGCGTGATATACTGAGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCAATTTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATGCAACGTGACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACCGTTCTCGAGCCAATACACGTCAATGGGAAGTGAAAGGGCAGCCAAAACGTAACACCGCCCCGGTTTTCCCCTGGAAATTCCATATTGGCACGCATTCTATTGGCTGAGCTGCGTTCTACGTGGGTATAAGAGGCGCGACCAGCGTCGGTACCGTCGCAGTCTTCGGTCTGACCACCGTAGAACGCAGATCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGCTTAAGGACTACAAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAATAATCTAGAAAATTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATAATACCATGGCCACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCCGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGACCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCTCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCTGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAACCGCGTCTGGAACAAGAGCTTATCGATAATCAACCTCTGGATTACTCGACTTCGAGCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCGTCTAGCATCGAAGATCCAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAAGTAGCTTGGCGGCGGCCGCGAAGTGTAACTGTGGACAGAGGAGCCATAACTGCAGACTTGTGGGATACAGAAGACCAATGCAGACTTTAATGTCTTTTCTCTTACACTAAGCAATAAAGAAATAAAAATTGAACTTCTAGTATCCTATTTGTTTAAACTGCTAGCTTTACTTAACTTTTGTGCTTCATCTATACAAAGCTGAAAGCTAAGTCTGCAGCCATTACTAAACATGAAAGCAAGTAATGATAATTTTGGATTTCAAAAATGTAGGGCCAGAGTTTAGCCAGCCAGTGGTGGTGCTTGCCTTTATGCCTTTAATCCCAGCACTCTGGAGGCAGAGACAGGCAGATCTCTGAGTTTGAGCCCAGCCTGGTCTACACATCAAGTTCTATCTAGGATAGCCAGGAATACACACAGAAACCCTGTTGGGGAGGGGGGCTCTGAGATTTCATAAAATTATAATTGAAGCATTCCCTAATGAGCCACTATGGATGTGGCTAAATCCGTCTACCTTTCTGATGAGATTTGGGTATTATTTTTTCTGTCTCTGCTGTTGGTTGGGTCTTTTGACACTGGGCTTTCTTTAAAGCCTCCTTCCTGCCATGTGGTCTCTTGTTTGCTACTAACTTCCCATGGCTTAAATGGCATGGCTTTTTGCCTTCTAAGGGCAGCTGCTGAGATTTGCAGCCTGATTTCCAGGGTGGGGTTGGGAAATCTTTCAAACACTAAAATTGTCCTTTAATTTTTTTTTTAAAAAATGGGTTATATAATAAACCTCATAAAATAGTTATGAGGAGTGAGGTGGACTAATATTAAATGAGTCCCTCC-3’

SEQ ID NO.6所示的碱基序列：

5’-GTACACTTTGTTGATTCTTTGCCTTGATCTTGACTTCAGGTTCTATCACCACCCCCTCAGATGGTGTTCCACACTTGGGCCTATTCACAGTTCAGAGAGCTTTACAACAATAGATGTATTGAGAATCCAACCTAAAGTTCAGCTTTTTACTCCCATGAATGCCTCTTTCCTTTTTCTCCATTTATAAACTGAGCCATTTCCTGTTAATGGTTTACAGATGAATATCTCCTCCCCCAATATCACCTGATGTATCTTACATTTTGCCAGGCTTAGATTGTCTTAAAAGGTACATAAATTAACATGTGAAATTTACTCCTTAATGCTTCAGTGGATTTCATGAGTGCAGTACAGAAGACTGGTAATGGGCTAATAACTTTTATTTCATTATTTCTCATATACTCACTTAACTCTTGAGCTACATGGAATTGATTCCTGCTTACTAAAATCATTATACTCCTCTATAAAAGTTAGTTCCTTCTGGAATGCAGAATATATAAACTCTTAAAGGTTTAGTTGTTTGTCTTTCCTGACCTAAGGTCCAGTGAGCCTGTATTTTTTTCTATTTAAGCGGTGCTTTCTCTTGGACTGGCTTGACTCATGTTCATGTTATTGCTGATTTAAATGTGATTTTGCTAAGTATCTTCTGGACATAATTTTGCTTGACTTGTTGCCAGACACAAGTAAAATGGAGTAAGCAGCAAAAATGTATTTGTGAAGCTTGGTTTTTAGGGTGGTGTGCGCGGGTGCTATCCAGTAGAATTTACTGCAGTAATGGGATACTTTCTGTTTGTATTGTTCCAACATGGTTAACATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATACGCGTGATATACTGAGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCAATTTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATGCAACGTGACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACCGTTCTCGAGCCAATACACGTCAATGGGAAGTGAAAGGGCAGCCAAAACGTAACACCGCCCCGGTTTTCCCCTGGAAATTCCATATTGGCACGCATTCTATTGGCTGAGCTGCGTTCTACGTGGGTATAAGAGGCGCGACCAGCGTCGGTACCGTCGCAGTCTTCGGTCTGACCACCGTAGAACGCAGATCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGCTTAAGGACTACAAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAATAATCTAGAAAATTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATAATACCATGGCCACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCCGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGACCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCTCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCTGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAACCGCGTCTGGAACAAGAGCTTATCGATAATCAACCTCTGGATTACTCGACTTCGAGCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCGTCTAGCATCGAAGATCCAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAAGTAGCTTGGCGGCGGCCGCGAAGTGTAACTGTGGACAGAGGAGCCATAGCTGCAGACTTAAAAAAGCAATAAATAAAAATTGAACCTCTGGTAGACTATTTGTTTAAGCTGTTTGTTTTACTTAATTTTTGTTCTTCATCTATTCTAAGCGGAAAGCTTGTTTTCCATTACTAAACATGGAAGCAAGAACTGATGAACTTGGATTTCAAAAATTTAGGGCCAGAGTTTGGCCAGCCAGTGGTGGTGCATGCCTTTAATCCTTTATGCCTTTAATTTCAGCACTCTGGAGGCAGACACAGGCAGATCTCTGAGTTTGAGCCCAGCCTGGTCTACAGATGGAGTTCTATCTAGGACAGCCAGTGATACCCAGAGAAACCCTGCTATAAGAAAACAGAAAATTTAGGGAGCTGAGATTTCATAAAACTATAATTGAGGCAATTCCTACGAGCCACTGTGGAATTTTGCTAAATCTGCCTATCTTTCTGAGGTCTGGGTATTCTTTTTTTTTTTCTGTCTCTGCTGCTGGTCAAGTTAATTGACTCTTTTGACACTTTGTCTTTCTTTAAAGCCTCCTTCCCACCATGTGGTCTCCTGTTTGCCACATGTCTAACTTCCCATGGCTTAAATGGCATGGCTTTTTTGCCTTCTAAGGGCAGCTGCTGAGATTTGCAGCCTGATTTCCTGGGTGGGGTTGGGAAT-3’。

5、测序

选择Amp抗性的阳性菌落，接种在LB中，37℃震荡培养16小时后，送测序证实序列正确。

四、定点整合检测实验

1、细胞的培养:小鼠NIH-3T3细胞、小鼠B16FO细胞、大鼠C6细胞、大鼠208F细胞（均来源于ATCC）。上述细胞系培养于37℃，5%CO2恒温培养箱。对数生长期的细胞用胰酶消化脱壁后，加入适量培养液并反复吹打以混匀细胞；将得到的细胞悬液移入15ml离心管中，1500rpm离心3min；去上清；用5ml无菌1×PBS将细胞悬起，吹打混匀；加约1ml细胞悬液于装有5ml新鲜培养基的新培养瓶中，放入37℃、5%CO2培养箱中培养，约2天左右传代1次（主要查看细胞有无铺满培养瓶），细胞转染前16个小时铺在24孔板中，使其转染时汇合密度为80%。

2、三质粒转染目的细胞

使用HY-TALEN-Rosa26-U、HY-TALEN-Rosa26-D和HY-HR-mRosa26三种质粒等比例混合，按照lipofectamine2000说明书转染小鼠NIH-3T3细胞、小鼠B16FO细胞。

使用HY-TALEN-Rosa26-U、HY-TALEN-Rosa26-D和HY-HR-rRosa26三种质粒等比例混合，按照lipofectamine2000说明书转染大鼠C6细胞、大鼠208F细胞。

转染6小时后弃去转染液，换完全培养液；转染48小时后，观察荧光，将细胞传入6孔板中，并使用puromycin（sigma公司，作用终浓度2微克/毫升）药物处理3天后，将细胞以适当密度（约每盘200-400个细胞）铺盘于10cm Dish中，使细胞之间保持适当距离，便于形成单个克隆。在不含puromycin的培养基中正常培养3-4周后，挑选有荧光的阳性单克隆转入24孔板继续培养，最终获得单克隆稳定细胞株。

最终可获得小鼠B16FO细胞Rosa26定点整合稳定株、小鼠NIH-3T3细胞Rosa26定点整合稳定株、大鼠C6细胞Rosa26定点整合稳定株、大鼠208F细胞Rosa26定点整合稳定株(见图4-7，为最终筛选得到的定点整合稳定株)。

3、PCR扩增及测序鉴定

1）针对小鼠B16FO细胞，分别使用交换臂上下游两对引物检测。每对引物都分别位于基因组和外源插入基因上，这样只有整合到基因组的序列才会扩增到PCR产物。

50μl体系PCR反应：Premix Taq（Takara公司）25ul，DNA模板2微升，引物各1微升灭菌蒸馏水21ul；

PCR反应条件为：94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，重复30个循环）。

PCR产物取10微升电泳，电泳结果如图8所示。

其中，小鼠细胞插入位点上游引物（目的条带约976bp）如下：

Forward Primer：5’-CCTATTCTCAGTCCAGGGAGTT-3’（如SEQ ID NO.15所示）；

Reverse Primer：5’-CAATGGGACTTTCCTGTTGATTC-3’（如SEQ ID NO.16所示）；

小鼠细胞插入位点下游引物（目的条带约1018bp）如下：

Forward Primer5’-GCAATAGCATCACAAATTTC-3’（如SEQ ID NO.17所示）；

Reverse Primer：5’-CTGATTAAGCGATGCAACAG-3’（如SEQ ID NO.18所示）。

2）针对大鼠C6细胞，分别使用交换臂上下游两对引物检测。每对引物都分别位于基因组和外源插入基因上，这样只有整合到基因组的序列才会扩增到PCR产物。

50μl体系PCR反应：Premix Taq（Takara公司）25ul，DNA模板2微升，引物各1微升灭菌蒸馏水21μl；

PCR反应条件为：94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，重复30个循环。

PCR产物取10微升电泳，电泳结果如图9所示。

其中，大鼠细胞插入位点上游引物（目的条带约967bp）如下：

Forward Primer：5’-CCAGACAGATTAGTTTCATACAC-3’（如SEQ ID NO.19所示）；

Reverse Primer：5’-CAATGGGACTTTCCTGTTGATTC-3’（如SEQ ID NO.20所示）。

大鼠细胞插入位点下游引物（目的条带约859bp）如下：

Forward Primer：5’-GCAATAGCATCACAAATTTC-3’（如SEQ ID NO.21所示）；

Reverse Primer：5‘-CATTTAACATTAGTCCCACCTCAC-3’（如SEQ ID NO.22所示）。

结果显示，所得PCR引物送测序公司测序，测序结果与预期结果完全一致。

从图片4-7中可以看到，所有的细胞都均匀表达EGFP。同时PCR扩增得到的产物进行测序可以发现外援插入的序列和基因组固有的序列在同一个产物上，由此证明外源的DNA序列已经整合到了目的细胞的基因组中，并可以稳定遗传。