一种链霉菌及其在冬枣轮纹病防治中的应用

摘要

本发明公开了一种链霉菌及其在冬枣轮纹病防治中的应用。该菌种命名为BK，分类命名：链霉菌(Streptomyces sp.)，其保藏编号：CGMCC No.7489，保藏日期：2013年04月19日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明首次从黄河三角洲贝壳堤土样中分离筛选到一株链霉菌，实验证明，该链霉菌有显著拮抗作用，抗菌谱广。该菌株在高氏一号固体培养基上生长，形成的菌落特征为菌落呈白色，菌落为圆形、边缘不规则、表面干燥、不透明，革兰氏染色阳性。本发明还公开了其核苷酸序列。该菌株对冬枣轮纹病病菌及其它多种植物病原真菌都具有明显的抑制作用，如对苹果杆腐病病菌、黄瓜枯萎病病菌及番茄立枯病病菌等都具有明显的拮抗作用，具有很好的应用前景。

说明书

【技术领域】本发明属于生物技术和农业病害防治技术领域，具体地说，它涉及一种链霉菌Streptomyces sp.及其在防治冬枣轮纹病中的应用。

【背景技术】冬枣口感鲜嫩多汁，风味酸甜适口，是鲜食品种中的佼佼者，自推广种植以来给广大种植户带来了巨大的经济利益，但是随着栽培面积的迅速增加，冬枣病害的发生愈来愈重，其中冬枣轮纹病是较为常见和危害严重的真菌病害，冬枣轮纹病不仅直接造成冬枣产量下降与品质降低，而且病原真菌可分泌产生对人畜有害的毒素与代谢物，对人们的健康构成极大威胁。目前，冬枣轮纹病的防治主要是通过喷洒化学药物来防治，但长期不合理使用化学农药产生了诸多问题。如：化学农药的高毒、高残留对人、畜的健康造成了危害，对土壤、水体、大气造成了严重污染，破坏了生态平衡；病原菌药性的不断增强，农药的使用量和使用频度不断加大，出现了用药量与病害相互递增的恶性循环。因此开发对人类和环境友好、并具良好防治效果的、新的植物病害防治办法迫在眉睫。

随着人们对食品安全的日益重视，可持续控制病虫害发展的需要，生物防治受到各国政府和植物保护专家的重视。生物防治以生态学为基础来控制有害生物，是综合防治体系中一个必不可缺少的组成部分。它避免了化学农药使用带来的一系列植保、环境和能源方面的问题，避免了农药残留对人畜的危害。应用生物农药取代化学农药已逐渐成为一种趋势。 

放线菌是一类具有重要经济价值的微生物资源，是抗生素、酶制剂和免疫调节剂等多种生物活性物质的主要生产者，目前农业和临床使用的抗生素有四分之三是由放线菌生产的。可以说放线菌为人类健康做出了巨大贡献。然而，随着放线菌研究工作的广泛开展，新放线菌的发现越来越难，大量放线菌和活性产物被多次重复发现和描述。现在要从普通生态环境中发现新的放线菌越来越困难。一些学者建议从海洋、动植物内生环境、原始森林、盐湖、极地等特殊生态环境采样，这些生态环境，由于经过长期自然选择，微生物生态多样性特殊，发现新放线菌的可能性更大因为这些环境经过千百万年的自然进化，微生物生态多样性特殊，存在新菌种几率大。新微生物菌种意味着新基因、新代谢途径的存在，获得新结构次级代谢产物的可能性也大。 

贝壳堤是由生活在潮间带的贝类死亡之后的壳体及碎屑，经波浪搬运，在高潮线附近堆积而成的。黄河三角洲滨州市无棣、沾化海岸近五六千年以来成陆过程中形成的贝壳堤，生态环境独特，与美国易斯安娜州和南美苏里南的贝壳堤并称为世界三大古贝壳堤。而且是世界上规模最大、惟一的新老并存的贝壳堤。贝壳堤独特的生态环境赋予了该地区特有的生物资源，为发掘新的放线菌和开发生物农药提供了良好的资源。加快生物农药的研发和应用， 符合我国农业发展的需要，对于保障人们的饮食健康具有重要意义，发展前景广阔。 

【发明内容】本发明的目的在于针对冬枣轮纹病日益严重的问题，提供一种链霉菌（Streptomyces sp.）BK和该菌在冬枣轮纹病防治中的应用。

本发明提供的链霉菌（Streptomyces sp.）BK菌株，于2013年04月19日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”（北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所），其保藏号为CGMCC No.7489。 

链霉菌Streptomyces sp.BK CGMCC No.7489的筛选 

取黄河三角洲贝壳堤土样5g，100℃干热处理1h放入装有50mL无菌水的三角瓶中，加入一定量的玻璃珠放入摇床上震荡1h，用无菌水梯度稀释（最终稀释10000倍），涂布于高氏一号培养基（培养基组成：可溶性淀粉20g；KNO₃1g；K₂HPO₄0.5g；MgSO₄·7H₂O0.5g；NaCl0.5g；FeSO₄·7H₂O0.01g；琼脂20g；水1000mL；pH7.2～7.4)，28℃恒温培养6天。培养获得的放线菌根据菌落形态和颜色进行分类和编号，并经反复划线进行纯化。分离获得的菌株以冬枣轮纹病病菌、黄瓜枯萎病病菌为指示菌，通过平板对峙培养法进行筛选，最终获得抑菌效果最好的Streptomyces sp.BK。 

链霉菌（Streptomyces sp.）BK CGMCC No.7489菌落特征：在高氏一号培养基平板上培养7天的菌落直径4～6mm，气丝为白色，表面致密、干燥、多皱、不易挑起。 

链霉菌（Streptomyces sp.）BK CGMCC No.7489的细胞形态特征：革兰氏阳性菌，菌丝细长，枝多，孢子呈椭圆形表面光滑，孢子丝呈螺旋形。 

链霉菌（Streptomyces sp.）BK CGMCC No.7489的生理生化特征：生长温度22℃～40℃，pH4～10，NaCL耐受性1%～3%。硝酸盐还原、淀粉水解试验、纤维素水解试验、明胶液化实验均为阳性，不凝固但胨化牛奶，能够利用D-半乳糖、甘油、L-鼠李糖、麦芽糖、葡萄糖、D-木糖、蔗糖、乳糖、山梨糖，不能利用木糖、肌糖、L-阿拉伯糖。 

链霉菌（Streptomyces sp.）BK CGMCC No.7489的16S rDNA基因序列特征：CGMCC No.7489接种于高氏一号培养基，120rpm，8℃震荡培养24小时，离心收集菌体，悬浮后加入溶菌酶和SDS破壁，采用酚—氯仿法提取基因组DNA，用正相引物27F（5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），和反向引物1541R(5’-AAGGAGGTGATC CAGCC-3’)，对其16S rDNA基因进行PCR扩增，将扩增的产物由北京三博公司进行测序。PCR条件为：94℃，10min；94℃，45s；55℃，45s；72℃，90s；30个循环；4℃保存。16S rDNA基因序列长度为1406bp，在GenBank中的登陆号为KF111562，与Streptomyces purpureus(HQ650808)相似性为99%，其16S rDNA如序列表所示。 

参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol.Ⅷ的内容，根据其形态特征和生理生化特征，以及16S rDNA基因序列结果，经多相分类鉴定BK为一新菌，属于链霉菌属 （Streptomyces sp.BK）。 

链霉菌Streptomyces sp.BK CGMCC No.7489可以在营养培养基，如：高氏一号培养基、LB和营养琼脂培养基中生长，也可以在添加葡萄糖的无机盐培养基中生长。 

该链霉菌对冬枣轮纹病病菌及其它多种植物病原真菌都具有明显的抑制作用。 

本发明的优点和积极效果： 

本发明提供的CGMCC No.7489菌，是一种优良的生防链霉菌，该菌株液体发酵能够产生对植物真菌病害病原菌如冬枣轮纹病、苹果杆腐病病菌、黄瓜枯萎病病菌及番茄立枯病病菌等有抑制作用的活性代谢产物，对冬枣轮纹病的生防效果达80%以上，具有很好的应用前景。 

【附图说明】：

图1是Streptomyces sp.BK CGMCC No.7489菌对冬枣轮纹病病菌的抑制作用； 

图2是Streptomyces sp.BK CGMCC No.7489菌对黄瓜枯萎病病菌的抑制作用； 

图3是Streptomyces sp.BK CGMCC No.7489菌的菌落形态； 

图4是Streptomyces sp.BK CGMCC No.7489菌发酵液对冬枣轮纹病病菌菌丝生长的抑制（a为对照）； 

图5是不同温度处理对Streptomyces sp.BK CGMCC No.7489菌发酵液抑菌活性的影响； 

图6是不同pH处理对Streptomyces sp.BK CGMCC No.7489菌发酵液抑菌活性的影响。 

【具体实施方式】

实施例1： 

本发明提供的Streptomyces sp.BK菌株的分离筛选。 

取黄河三角洲贝壳堤土样5g，100℃干热处理1h放入装有50mL无菌水的三角瓶中，加入一定量的玻璃珠，放入摇床上震荡1h，用无菌水梯度稀释（最终稀释10000倍），涂布于高氏一号培养基（培养基组成：可溶性淀粉20g；KNO₃1g；K₂HPO₄0.5g；MgSO₄·7H₂O0.5g；NaCl0.5g；FeSO₄·7H₂O0.01g；琼脂20g；水1000mL；pH7.2～7.4)，28℃恒温培养6d。培养获得的放线菌根据菌落形态和颜色进行分类和编号，并经反复划线进行纯化。分离获得的菌株以冬枣轮纹病病菌、黄瓜枯萎病病菌为指示菌，通过平板对峙培养法进行筛选，最终获得抑菌效果最好的BK菌株，结果如图1，图2所示。 

实施例2： 

本发明提供的Streptomyces sp.BK菌株的形态特征和生理生化特征。 

参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol.Ⅷ的试验方法进行，检测其革兰氏染色，菌落大小和形态，生长温度，pH范围，NaCL耐受性，硝酸盐还原、淀粉水解、纤 维素水解、明胶液化，以及利用D-半乳糖、甘油、L-鼠李糖、麦芽糖、葡萄糖、D-木糖、乳糖、山梨糖，蔗糖、肌糖、L-阿拉伯糖试验。 

结果表明，该菌为革兰氏阳性菌，菌丝细长，分枝多，孢子呈椭圆形表面光滑，孢子丝呈螺旋形。在高氏一号培养基平板上培养7d的菌落直径4～6mm，气丝为白色，表面致密、干燥、多皱、不易挑起（图3）。生长温度22℃～40℃，pH4～10，NaCL耐受性1%～3%。硝酸盐还原、淀粉水解试验、纤维素水解试验、明胶液化实验均为阳性，不凝固但胨化牛奶，能够利用D-半乳糖、甘油、L-鼠李糖、麦芽糖、葡萄糖、D-木糖、蔗糖、乳糖、山梨糖，不能利用木糖、肌糖、L-阿拉伯糖。 

实施例3： 

本发明提供的Streptomyces sp.BK菌株的16S rDNA基因的PCR扩增和序列测定。将该菌株接种于高氏一号培养基，120rpm，28℃震荡培养36h，离心收集菌体，悬浮后加入溶菌酶和SDS破壁，采用酚—氯仿法提取基因组DNA，用正相引物27F(5’-GAGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3’)，和反向引物1541R(5’-AAGG AGGTGATCCAGCC-3’)，对其16S rDNA基因进行PCR扩增，将扩增的产物由北京三博公司进行测序。PCR条件为：94℃，10min；94℃，45s；55℃45s；72℃，90s；30个循环。4℃保存。16S rDNA基因序列长度为1406bp，在GenBank中的登陆号为KF111562，与Streptomyces purpureus(HQ650808)相似性为99%。其结果如序列表所示。 

实施例4： 

本发明提供的Streptomyces sp.BK菌株的发酵培养。 

将BK菌株接种在高氏一号琼脂培养基上，28℃下活化培养3d，加无菌水，制成孢子悬液。按10%的接种量将孢子悬液接种于装有100mL高氏一号液体培养基的250mL三角瓶中进行摇瓶发酵，温度为28℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为7d。将发酵产物经10000r min^-1离心20min，得到发酵上清液，备用。 

实施例5： 

本发明提供的Streptomyces sp.BK菌株对各种真菌菌丝的抑制作用。 

采用含毒介质法，在18mLPDA培养基中加入2mL BK的发酵液上清（同实例4），倒PDA平板，用打孔器取直径为5mm的病原真菌菌丝块，移入平板中心处，28℃培养4d测量菌丝生长直径(mm)，重复3次，计算抑菌率。抑菌率=[(对照菌丝生长直径—试验处理菌丝生长直径)/对照菌丝生长直径]×100%。结果表明（表1），BK菌株发酵液对多种植物病原真菌都有较强的抑制作用，抑菌率都在50%以上，其中对对冬枣轮纹病病菌的抑菌率最高，为72.3%（见图4）。 

表1BK菌株发酵液对不同植物病原真菌菌丝生长的抑制作用 

实施例6： 

本发明提供的Streptomyces sp.BK菌株发酵液的理化性质—热稳定性。 

将BK菌株发酵液上清（同实例4）于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃下分别处理30min，以冬枣轮纹病病菌为指示菌，未经热处理的发酵液作对照，含毒介质法（同实例5）测定活性。结果如图5所示，BK发酵液具有较强的热稳定性。50-80℃各处理30min，抑菌活性均维持在对照的85%以上，100℃处理60min，活性为对照的79.6%。 

实施例7： 

本发明提供的Streptomyces sp.BK菌株发酵液的理化性质—pH稳定性。 

将BK菌株发酵液上清（同实例4）分别用1mol/L HCl和1mol/L NaOH处理至pH值4、5、6、7、8、9、10，静止2h，然后将pH调回发酵液的自然pH值，以冬枣轮纹病病菌为指示菌，未经酸碱处理的发酵液作对照，含毒介质法（同实例5）测定活性。结果如图6所示，在pH5～pH10之间都有一定抑菌率，随着pH的升高，抑菌率呈逐渐下降趋势，但差别不显著，在pH为6时，抑菌效果最好，达72%。 

实施例8 

本发明提供的Streptomyces sp.BK菌株在冬枣试验田中的应用。 

通过发酵液能够防治冬枣轮纹病，具体过程为：对BK进行发酵，发酵液稀释50倍喷雾，在枣树落花后第1次喷雾施药，以后间隔15～20天施药1次，共4次，整个生育期施药5次，其生防效果可达80.3%。发酵培养条件为：将BK菌株接种在高氏一号琼脂培养基上，28℃下活化36h，然后将活化的BK菌株转接到液体培养基中进行发酵发酵，温度为28℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为7d。其中发酵培养基组成为g/L：可溶性淀粉20；KNO₃1；K₂HPO₄0.5；MgSO₄·7H₂O0.5；NaCl0.5；FeSO₄·7H₂O0.01；水1000mL；pH7.2～7.4。