水稻PS1蛋白及其编码基因在调节植物衰老中的应用

摘要

本发明公开了一种水稻PS1蛋白及其编码基因在调节植物衰老中的应用。本发明所提供的应用具体为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在调控植物衰老中的应用。本发明利用一个水稻早衰突变体克隆到PS1基因，PS1基因受发育年龄的调控且受脱落酸的特异诱导。转基因实验证明，PS1基因在野生型水稻中过表达可导致衰老的提前发生；而抑制水稻中PS1基因的表达可以一定程度的延迟衰老，提高籽粒千粒重，暗示PS1在提高水稻产量上具有较好的应用潜力。本发明在利用基因工程手段调控植物衰老进行高产分子育种上具有潜在的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种水稻PS1蛋白及其编码基因在调节植物衰老 中的应用。

背景技术

衰老是植物发育过程中必然经历的生命现象，受到精细的遗传调控，它是植物在 长期进化过程中形成的适应性，对植物本身具有重要的生物学意义。植物衰老同时伴 随着营养物质从衰老的器官向新生器官以及生殖器官的转移，因此也被认为是植物营 养物质循环再利用的过程。尽管衰老是植物主动调控的正常生理现象，然而，在农业 生产上，由于一些不利的因素，极其容易导致衰老的提前发生，造成早衰。早衰导致 作物过早丧失光合功能和同化作用，从而显著减少籽粒中干物质的积累，严重影响作 物的产量与品质，如许多优良的水稻品种尤其是以两优培九等为代表的超级杂交稻品 种虽然具有强大的产量优势，但其生育后期普遍存在早衰引起的籽粒充实度低，空秕 率高的现象，严重影响干物质的生产和积累，最终阻碍产量潜力的发挥。理论上推算， 如果水稻叶片推迟1天衰老，可增产2%左右，而实际生产中可达到增产1%左右，可 见早衰是制约水稻产量进一步提高的重要因素。

叶片衰老是一个复杂的遗传发育调控过程，其启动和进程受到发育年龄以及众多 内外源因素的调控。然而，当前人们对于叶片衰老中基本的科学问题的理解仍然十分 肤浅，对叶片衰老研究的思路和方法论仍缺乏统一的认识，对叶片衰老关键基因的克 隆和研究仍然非常的滞后。因此，对作物叶片衰老展开深入系统的研究，从分子水平 阐明叶片衰老的遗传机制，通过调控叶片的衰老进程来改善作物后期光合功能，使得 叶片光合总量和营养物质再动员效率双双趋于最大化，既具有重要的科学意义，也是 挖掘农作物产量潜力保障我国粮食安全的迫切需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻PS1蛋白及其编码基因在调节植物衰老中的应用。

本发明所提供的应用，具体为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质 （PS1蛋白）或其编码基因（PS1基因）在调控植物衰老中的应用。

所述PS1蛋白或其编码基因调控植物衰老具体体现为：促进所述PS1蛋白或其编 码基因的表达，则植物衰老时间提前和/或籽粒千粒重减少；抑制所述PS1蛋白或其编 码基因的表达，则植物衰老时间延迟和/或籽粒千粒重增加。

由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质（PS1蛋白）或其编码基因（PS1 基因）在选育衰老时间延迟和/或籽粒千粒重增加的植物品种中的应用也属于本发明的 保护范围。

在实际应用中，当所选育衰老时间延迟和/或籽粒千粒重增加的植物品种时，需将 所述PS1蛋白表达量较低的植株作为亲本进行杂交。

本发明的再一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，可为如下A）或B）的方法：

A）具体可包括如下a）和b）的步骤：

a）在目的植物中对由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因 （PS1基因）进行抑制表达，得到转基因植物；

b）从步骤a）所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，衰老时间延迟和/或籽 粒千粒重增加的转基因植物；

B）具体可包括如下c）和d）的步骤：

c）向目的植物中导入由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基 因（PS1基因），得到表达所述编码基因的转基因植物；

d）从步骤c）所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，衰老时间提前和/或 籽粒千粒重减少的转基因植物。

在上述的应用或方法中，所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质 的编码基因（PS1基因）是如下（1）至（4）中任一所述的DNA分子：

（1）编码序列为序列表中序列1的DNA分子；

（2）序列表中序列1所示的DNA分子；

（3）在严格条件下与（1）或（2）所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序 列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；

（4）与（1）-（3）任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表 中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。

其中，序列1由1179个核苷酸组成，整个序列1即为所述PS1基因的编码序列 （ORF），编码序列表中序列2所示的蛋白质，序列2由392个氨基酸残基组成。

在所述方法A）中，所述在目的植物中对由序列表中序列2所示的氨基酸序列组 成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，是通过将如下式（I）所示的DNA片段转入所 述目的植物中实现的：

SEQ_正向-X-SEQ_反向   （I）

所述SEQ_正向是序列表中序列1的第457-730位核苷酸；

所述SEQ_反向的序列与所述SEQ_正向的序列反向互补；

所述X是所述SEQ_正向与所述SEQ_反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述 SEQ_正向及所述SEQ_反向均不互补。

在本发明中，所述式（I）所示的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列5的第 1-768位。

序列5由768个核苷酸组成。其中，第1-274位为所述PS1基因的一个片段的正 向序列（对应上述式（1）中的SEQ_正向，与序列表中序列1的第457-730位一致），第 275-487位（第281-481位为GA20-1st内含子核苷酸序列）对应上述式（1）中的X， 第488-768位为所PS1基因的一个片段的反向序列（对应上述式（1）中的SEQ_反向， 为序列表中序列1的第457-730位的反向互补序列）。

进一步，所述式（I）所示的DNA片段是通过RNA干扰表达载体（PS1RNAi载 体）的形式转入所述目的植物中的；所述RNA干扰表达载体（PS1RNAi载体）上启 动所述式（I）所示的DNA片段转录的启动子为所述Actin1启动子（序列3）。具体 的，所述RNA干扰表达载体（PS1RNAi载体）为在pCAMBIA2300-Actin载体的多 克隆位点（如Sal I和Pst I）之间插入序列表中序列5所示DNA片段后得到的重组质 粒。

具体而言，所述RNA干扰表达载体（PS1RNAi载体）是按照包括如下步骤方法 构建得到的：

（a）用限制性内切酶Xho I和BamH I双酶切“5'-gtca+序列1的第457-730 位+tgac-3'”所示的DNA片段甲，胶回收酶切片段，与经过Xho I和Bgl II双酶 切的pUCRNAi载体骨架片段相连（BamH I和Bgl II为同尾酶），得到中间载体pSRi-1；

（b）用限制性内切酶Xho I和BamH I双酶切所述DNA片段甲，胶回收酶切片段， 与经过BamH I和Sal I双酶切的中间载体pSRi-1骨架片段相连（Xho I和Sal I为同尾 酶），得到中间载体pSRi-2；

（c）用限制性内切酶Xho I和Pst I双酶切中间载体pSRi-2，胶回收酶切片段（反 向重复序列，大小约为768bp），与经过Sal I和Pst I双酶切的pCAMBIA2300-Actin 载体骨架片段相连（Xho I和Sal I为同尾酶），得到的重组质粒即为所述RNA干扰表 达载体（PS1RNAi载体）。

在所述方法B）中，所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编 码基因（PS1基因）是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的 植物中的。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农 杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、 pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生 植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺 苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可 引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转 录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如 花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子（pUbi）、胁迫诱 导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用 本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子， 这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列 的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源 是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或 结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载 体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、 具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因， 直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子可为Actin1启 动子、35S启动子或ADH1启动子。

所述Actin1启动子为水稻内源启动子，其核苷酸序列如序列表中序列3所示；所 述ADH1启动子的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

更为具体的，所述重组表达载体为如下（I）-（III）中任一种：

（I）将所述PS1基因插入到pCAMBIA-2300-Actin载体的多克隆位点Xho I和Sma  I之间后得到的重组质粒（pCAMBIA2300-Actin1-PS1）。在该重组表达载体中，启动 所述PS1基因转录的启动子为所述Actin1启动子。

（II）将所述PS1基因插入到pSAT6-EYFP载体的多克隆位点Xho Ⅰ和Sma Ⅰ之 间后得到的重组质粒（pSAT6-PS1-EYFP），在该重组表达载体中，启动所述PS1基因 转录的启动子为所述35s启动子。

（III）将所述PS1基因插入到pGBKT7载体的多克隆位点Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ之间 后得到的重组质粒（pGBKT7-PS1），在该重组表达载体中，启动所述PS1基因转录 的启动子为所述ADH1启动子。

在上述方法A）或B）中，将携带有所述PS1基因的所述重组表达载体或所述RNA 干扰表达载体（PS1RNAi载体）导入所述目的植物，具体可为：通过使用Ti质粒、 Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物 学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在上述应用或方法中，所述植物可为单子叶植物，如水稻、玉米、小麦等。

在本发明的一个实施例中，所述植物为水稻，具体为水稻品种日本晴。

本发明利用一个水稻早衰突变体，使用SiteFinding-PCR的技术克隆出PS1基因并 进行了功能分析。荧光定量PCR分析表明，PS1基因受发育年龄的调控并特异受植物 激素脱落酸(ABA)的诱导表达；PS1基因编码一个细胞核定位的转录激活类转录因子 其激活活性位于该蛋白Ｃ末端。转基因实验证明，PS1基因在野生型水稻中过表达， 可导致衰老的提前发生，而抑制水稻中PS1基因的表达可以一定程度的延迟衰老，提 高籽粒千粒重，暗示PS1在提高水稻产量上具有较好的应用潜力。本发明利用基因工 程手段调控衰老关键基因的表达水平进行分子育种提高作物产量上具有潜在的应用价 值。

附图说明

图1为突变体水稻和野生型水稻的表型比较。其中，A为野生型和突变体ps1-D 表型；B为野生型和突变体开花后剑叶中叶绿素含量变化比较。

图2为突变体ps1-D中衰老相关基因（SAGs）的表达量的实时荧光定量PCR检 测结果。

图3为PS1基因克隆及T-DNA插入位点上下游100kbp范围内基因表达量的实时 荧光定量PCR检测结果。其中，A为利用SiteFinding-PCR方法克隆PS1基因；B为 T-DNA插入位点上下游100kbp范围内11个基因表达量的实时荧光定量PCR检测结 果。

图4为PS1基因在不同器官和组织中实时荧光定量PCR检测结果。其中，A为 其中为PS1基因在根、茎、叶、叶鞘、幼穗和胚乳中的表达情况；B为PS1基因在种 子不同发育时期的表达情况（Y1：1-2cm幼穗；Y2：10-15cm幼穗）；C为PS1基因 在同一叶片不同发育时期的表达情况（YL：幼叶，约为完全伸展叶大小的一半；NS： 发育完成但尚未衰老的叶片；ES：早衰的叶片，黄花面积﹤10%；LS：衰老中后期叶 片，黄花面积﹥50%）；D为PS1基因在同一株系不同位置叶片的表达情况（F：剑叶； L2：倒二叶；L3：倒三叶；L4：倒四叶；L5：倒五叶）；E为PS1基因在同一叶片不 同部位的表达情况。

图5为PS1蛋白亚细胞定位结果。

图6为PS1基因转录激活分析结果。其中，BD表示转pGBKT7空载的阴性对照； BD-P表示转pGBKT7-GAL4的阳性对照；BD-PS1表示转pGBKT7-PS1载体；BD-PS1 △N表示转pGBKT7-PS1-N载体；BD-PS1△C表示转pGBKT7-PS1-C载体。

图7为PS1基因的表达水平受脱落酸的正调控。其中，A为PS1基因在不同激素 及非生物逆境条件下的实时荧光定量PCR检测结果；B为PS1基因在ABA处理不同 时间实时荧光定量PCR检测结果。

图8为过表达PS1转基因水稻中PS1基因表达水平鉴定及表型。其中，A为野生 型水稻中过表达PS1基因株系OE1、OE2和OE3的表型；B为过表达水稻株系OE1、 OE2和OE3中PS1基因表达量的实时荧光定量PCR检测结果。

图9为过表达PS1转基因水稻的籽粒千粒重测定结果。

图10为PS1基因的RNAi水稻中PS1基因表达水平鉴定及表型。其中，A为野 生型水稻中抑制PS1基因株系Ri1和Ri2的表型；B为抑制PS1基因株系Ri1和Ri2 中PS1基因表达量的实时荧光定量PCR检测结果。

图11为PS1基因的RNAi水稻的籽粒千粒重测定结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

水稻（Oryza.sativa L.）品种日本晴（Nipponbare）：记载于“Sun,C.H.,Fang,J.,Zhao, T.L.,Xu,B.,Zhang,F.T.,Liu,L.C.,Tang,J.Y.,Zhang,G.F.,Deng,X.J.,Chen,F.,Qian,Q., Cao,X.F.and Chu,C.C.(2012)The histone methyltransferase SDG724mediates  H3K36me2/3deposition at MADS50and RFT1and promotes flowering in rice.Plant Cell, 24,3235-3247.”一文。

pCAMBIA2300-Actin载体：记载于“Wang,K.J.,Tang,D.,Wang,M.,Lu,J.F.,Yu, H.X.,Liu,J.F.,Qian,B.X.,Gong,Z.Y.,Wang,X.,Chen,J.M.,Gu,M.H.and Cheng,Z.K. (2009)MER3is required for normal meiotic crossover formation,but not for presynaptic  alignment in rice.J Cell Sci,122,2055-2063.”一文。

pUCRNAi载体：记载于“Wang,K.J.,Tang,D.,Wang,M.,Lu,J.F.,Yu,H.X.,Liu,J.F., Qian,B.X.,Gong,Z.Y.,Wang,X.,Chen,J.M.,Gu,M.H.and Cheng,Z.K.(2009)MER3is  required for normal meiotic crossover formation,but not for presynaptic alignment in rice.J  Cell Sci,122,2055-2063.”一文。

农杆菌AGL1：记载于“Sun,C.H.,Liu,L.C.,Tang,J.Y.,Lin,A.H.,Zhang,F.T.,Fang, J.,Zhang,G.F.and Chu,C.C.(2011)RLIN1,encoding a putative coproporphyrinogen III  oxidase,is involved in lesion initiation in rice.J Genet Genomics,38,29-37.”一文。

表达载体pSAT6-GFP：记载于“Tong H.N.,Liu,L.C.,Jin,Y.,Du,L.,Yin,Y.H.,Qian, Q.,Zhu,L.H.,Chu,C.C.(2012)DWARF AND LOW-TILLERING Acts as a Direct  Downstream Target of a GSK3/SHAGGY-Like Kinase to Mediate Brassinosteroid  Responses in Rice.Plant Cell,24,2526-2577.”一文。

实施例1、与植物衰老相关的PS1蛋白及其编码基因的获得

一、突变体的获得及其表型

从水稻突变体库（来自中国科学院遗传与发育生物学研究所）中发现一个早衰的 突变体。和野生型相比，此突变体表型出明显早衰表型，该突变的表型如图1中A所 示。其中，WT为野生型水稻，ps1-D为上述筛选得到的突变体水稻。此突变体水稻幼 苗期和野生型几乎没有差异。随着发育的进行，进入分蘖期以后老叶片出现衰老加速 的现象，和野生型相比年龄越大的叶片黄花早衰越严重，叶绿素含量也相对越低。进 入灌浆期以后，衰老的表型进一步加剧。以剑叶为例，如图1中B所示，其叶绿素含 量在开花后10天开始出现显著性的差异，25天左右差异达到最大值，突变体叶绿素 含量仅为野生型60%左右，最终导致整株死亡的时间较野生型提前了7-10天。

利用荧光定量PCR方法分析水稻中已报道衰老基因及Marker基因的表达情况。 取野生型和突变体水稻相同部位完全展开叶片，采用Trizol试剂法（Invitrogen）提取 其总RNA，采用购自Promega公司的MMLV逆转录酶并参照相应的使用方法进行反 转录，然后利用实时荧光定量PCR技术，根据厂家（Bio-Rad公司）提供的使用方法， 在PCR体系中加入SYBR green Ⅰ荧光染料，在荧光定量PCR仪C1000^TM Thermal  Cycler（CFX96real-time system,Bio-Rad，USA）上检测衰老相关基因 （Senescence-associated genes，SAGs）的表达情况，SAGs基因信息参见如下文献： Yamatani H.,Sato Y.,Masuda Y.,Kato Y.,Morita R.,Fukunaga K.,Nagamura Y.,Nishimura  M.,Sakamoto W.,Tanaka A.,and Kusaba M(2013)NYC4,the rice orthologs of Arabidopsis  THF1,is involved in the degradation of chlorophyll-protein complexes during leaf  senescence,Plant J74(4):652-662，引物序列如下列表1。以水稻ACTIN1基因为内参， 实验设三次重复。

其中，扩增内参ACTIN1的引物序列为：

ACTIN1上游引物：5'-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3'；

ACTIN1下游引物：5'-GTACCCTCATCAGGCATCTG-3'。

数据处理采用Comparative Ct的方法，即Ct值为PCR管中荧光信号达到设定的 域值时所经历的循环数，ΔCt=Ct(SAGs)-Ct(ACTIN1)，以2^-ΔCt值衡量基因转录水平， 对突变体及野生型水稻中SAGs基因的表达进行分析比较。结果如图2所示，所检测 衰老相关基因呈现显著性的上调表达。

以上结果表明，所获水稻突变体是一个典型的早衰突变体。

表1SAGs基因的引物序列

二、采用SiteFinding-PCR技术克隆PS1基因

对上述步骤1获得的突变体水稻进行遗传分析，结果表明，此突变体早衰表型和 T-DNA紧密连锁，而且受到单基因显性调控。利用SiteFinding-PCR分离T-DNA侧翼 序列，具体的克隆方法参见如下文献：Wang H.,Fang J,Liang C.,He M.,Li Q.,Chu C (2011)Computation-assisted SiteFinding-PCR for isolating flanking sequence tags in rice, BioTechniques51:421-423。分析发现T-DNA插入到第三号染色体长臂端。在基因组 上设计引物和T-DNA左右边界引物组合PCR扩增，测序分析发现T-DNA插入到一个 注释为NAC家族蛋白的编码基因启动子区域，如图3中A所示，距其起始密码子ATG 约250bp，将此基因命名为PS1基因。PS1基因含有三个外显子及两个内含子，其开 放阅读框序列（ORF）如序列表中的序列1所示，其编码的蛋白（PS1蛋白）氨基酸 序列如序列表中的序列2所示。利用荧光定量PCR方法对T-DNA插入位点上下游各 50kbp范围内11个基因表达进行分析，引物序列如下列表2，检测方法以及数据处理 同步骤1，结果如图3中B所示，T-DNA特异的激活PS1基因上调表达约20倍。

表2T-DNA插入位点上下游50kbp内基因引物序列

实施例2、PS1基因正调控水稻衰老

一、PS1基因在不同组织中的表达情况

取野生型水稻（Oryza.sativa L.）品种日本晴不同器官或组织，以及同一器官不同 时期样本，分别提取其RNA进行PS1基因组织表达特性分析，具体检测方法、数据 处理、内参引物序列以及PS1基因检测引物序列同实施例1，实验设三次重复。PS1 基因在不同器官或组织，以及同一器官不同时期中的表达情况如图4所示，纵轴表示 各器官和组织中PS1基因与ACTIN1基因的表达量之比。其中，图4中A为PS1基因 在根、茎、叶、叶鞘、幼穗和胚乳中的表达情况，图4中B为PS1基因在种子不同发 育时期的表达情况，图4中C为PS1基因在同一叶片不同发育时期的表达情况，图4 中D为PS1基因同一株系不同位置叶片的表达情况，图4中E为PS1基因在同一叶片 不同部位的表达情况。

结果表明，PS1基因在叶、叶鞘和胚乳中的表达量相对较高，在根、茎和幼穗中 的表达量较低；在同一叶片中发现，随着发育的进行，PS1基因的表达量逐渐升高； 在同一株系中发现，自上而下的五个叶片随着年龄的增加PS1基因的表达量逐渐升高； 在同一叶片中发现，PS1基因的在最早出现黄花早衰的叶尖部表达量最高，中部次之， 基部最低；在种子中研究发现，PS1基因表达伴随着灌浆的进行逐渐上升，在25天左 右达到峰值。说明PS1基因正调控水稻的衰老。

二、PS1蛋白是细胞核定位的转录激活类转录因子

利用PCR方法，以5'-atATGGTTCTGTCGAACCCGGC-3'（下划线斜体部 分为Xho Ⅰ的识别位点，其后的序列为序列1的第1-20位）为正向引物，以 5'-atGTTCATCCCCATGTTAGAGTG-3'（下划线斜体部分为Sma Ⅰ的识别位点， 其后的序列为序列1的第1156-1176位的反向互补序列）为反向引物，从水稻cDNA 中扩增出PS1基因的开放阅读框序列。在正、反向引物末端分别添加限制性内切酶Xho  Ⅰ和Sma Ⅰ的酶切位点。将PCR产物回收后连接入pMD18-T载体（购自TAKARA公 司）中，经测序确保正确后，利用Xho Ⅰ和Sma Ⅰ进行双酶切，酶切产物连接入瞬时 表达载体pSAT6-GFP中，即得到含有PS1基因的重组表达载体pSAT6-PS1-GFP。重 组表达载体pSAT6-PS1-GFP的结构描述为：在pSAT6-GFP载体的多克隆位点Xho Ⅰ 和Sma Ⅰ之间插入序列表中序列1的第1-1176位后得到的重组质粒。在重组表达载体 pSAT6-PS1-GFP中，启动所述PS1基因转录的启动子为35s启动子。按照文献（Li,C.L., Wang,Y.Q.,Liu,L.C.,Hu,Y.C.,Zhang,F.X.,Mergen,S.,Wang,G.D.,M.R and  Chu,C.C.(2011)A Rice Plastidial Nucleotide Sugar Epimerase Is Involved in Galactolipid  Biosynthesis and Improves Photosynthetic Efficiency.PloS Genet,7,e1002196.）中的方法 将重组表达载体pSAT6-PS1-EGFP转化水稻原生质体，在激光共聚焦显微镜下观察PS1 蛋白的定位情况，结果如图5，从图中可以看出，PS1蛋白特异的定位在水稻细胞核 中。

利用PCR方法，以5'-cgctATGGTTCTGTCGAACCCGGCGA-3'为正向引物 （下划线斜体部分为NdeI的识别位点，其后的序列为序列1的第1-22位），以 5'-ggtggTCAGTTCATCCCCATGTTAGAG-3'为反向引物（下划线斜体部分为EcoRI 的识别位点，其后的序列为序列1的第1158-1179位的反向互补序列），从水稻cDNA 中扩增出PS1基因的开放阅读框序列。在正、反向引物末端分别添加限制性内切酶NdeI 和EcoRI的酶切位点。将PCR产物回收后连接入pMD18-T载体（购自TAKARA公 司）中，经测序确保正确后，利用Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ进行双酶切，酶切产物连接入酵母 表达载体pGBKT7（购买自Clontech,Cat.No.630489,www.clontech.com）中，即得到 含有PS1基因的重组表达载体pGBKT7-PS1。重组表达载体pGBKT7-PS1的结构描述 为：在pGBKT7载体的多克隆位点Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ之间插入序列表中序列1的第 1-1179位后得到的重组质粒。在重组表达载体pGBKT7-PS1中，启动所述PS1基因转 录的启动子为ADH1启动子。所述ADH1启动子的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

将上述构建的重组表达载体按照Clontech（www.clontech.com）的方法转化酵母 细胞Y2HGold（购买自Clontech,Cat.No.630489,www.clontech.com），Trp-/His-双缺培 养基筛选结果表明PS1蛋白在酵母中具有转录激活活性（图6）。为了详细分析PS1 蛋白转录激活结构域，分别以5'-cgctATGGTTCTGTCGAACCCGGCGA-3'（下划 线斜体部分为Nde I的识别位点，其后的序列为序列1的第1-22位）为正向引物，以 5'-ggtggtcaCTGCTCGTGGTCGGAGAGCGGC-3'（下划线斜体部分为EcoR I的识 别位点，大写字母部分的序列为序列1的第549-570位的反向互补序列）为反向引物， 扩增PS1蛋白N端1-190氨基酸残基编码序列，利用 5'-cgctGCCGTGCCGCCGCTCTCCGACC-3'（下划线斜体部分为Nde I的识别位 点，其后的序列为序列1的第541-562位）为正向引物，以 5'-ggtggTCAGTTCATCCCCATGTTAGAG-3'（下划线斜体部分为EcoR I的识别位 点，其后的序列为序列1的第1158-1179位的反向互补序列）为反向引物，扩增PS1 蛋白C端181-392氨基酸残基编码序列，同上述步骤构建酵母表达载体pGBKT7-PS1-N 和pGBKT7-PS1-C，同上述步骤转化酵母细胞，分析表明PS1蛋白C末端具有转录激 活活性而N末端不具有转录激活活性（图6）。

因此，PS1蛋白是细胞核定位的转录激活类转录因子，其激活结构域位于C末端。

三、PS1基因特异受脱落酸正调控

分别用不同植物激素：10μM油菜素内酯(BR)，10μM赤霉素(GA₃)，10μM生长 素(IAA)，10μM细胞分裂素(6-BA)，10μM乙烯(ACC)，10μM茉莉酸(JA)，10μM水 杨酸(SA)，10μM脱落酸(ABA)，以及不同的非生物逆境：低温（4℃），碱性逆境 (pH=11)，干旱(10%PEG6000)，高盐(200mMNaCl)（以上试剂均购自Sigma公司）， 对生长7天的野生型品种日本晴幼苗进行处理，以水处理作为对照（Mock）。处理4 小时后取材，提取其RNA，反转录后利用定量PCR技术进行检测PS1基因的表达， 详细步骤、数据处理以及引物同实施例1，实验设三次重复，不同处理条件下PS1基 因的表达情况如图7中A所示。结果表明，不同处理条件下，PS1基因特异受植物激 素脱落酸诱导，处理4h后，其表达水平上调了约4倍，而其他激素及逆境环境并没有 对PS1基因的表达差生显著的影响。

为了进一步确定PS1基因和ABA的关系，本发明的发明人检测了在ABA不同处 理时间下PS1基因的表达变化，以超纯水处理作为对照（Mock）。结果如图7中B所 示，PS1基因可以被ABA迅速的诱导，并且这种诱导随着时间的延迟而逐渐增强，说 明PS1基因调控了ABA介导的衰老信号途径。

实施例3、PS1过表达水稻的获得及功能鉴定

本实施例中所涉及的基因为实施例1获得的来源于水稻（Oryza.sativa L.）品种日 本晴的PS1基因，其编码序列为序列表中序列1，编码序列表中序列2所示的蛋白质 （命名为PS1蛋白）。序列1共由1179个核苷酸组成，序列2共由392个氨基酸组成。

一、PS1过表达水稻的获得

1、重组表达载体pCAMBIA2300-Actin-PS1的构建

（1）水稻总RNA的提取及cDNA的获得

水稻总RNA提取采用Trizol试剂法（Invitrogen）。具体过程如下：将1-2g水稻 （Oryza.sativa L.）品种日本晴的叶片置于预冷的研钵中，迅速用液氮将其磨成粉末， 称取0.2g至液氮预冷的2ml离心管中；每管加入1ml Trizol试剂，充分混匀后加入 200μl氯仿，于涡旋震荡器上震荡1min，室温静置10min后于4℃，12,000rpm离 心10min；小心吸取600μl上清液至1.5ml无RNA酶离心管中，加入等体积的异丙 醇，室温放置5min后于4℃，12,000rpm离心10min，小心弃去上清液。沉淀用无 RNA酶的70%乙醇洗2次，待乙醇完全挥发后，将RNA沉淀溶于50μl DEPC-H₂O中， 备用。

取2μg总RNA进行逆转录。反应体系为：总RNA2μg、Oligo（dT）1μl、加 DEPC-H₂O至10μl后于70℃下反应5min，迅速将反应产物拿出并置于冰上2min。 然后加入：5×Reaction buffer5μl、dNTPs（10mM）1.25μl、RNA酶抑制剂0.625μl、 反转录酶1μl、并加入DEPC-H₂O至终体积25μl。充分混匀后于42℃下反应60min。 得到cDNA。

（2）重组表达载体pCAMBIA2300-Actin-PS1的构建

以步骤（1）所得cDNA为模板，通过引物1与引物2进行PCR扩增，反应结束 后对其产物进行纯化，表明扩增得到约1197bp片段，测序表明，该片段具有序列表中 序列1所示PS1基因的编码序列（ORF）。

引物1：5'-cccATGGTTCTGTCGAACCCGGC-3'（下划线斜体部分为Sma  Ⅰ的识别位点，其后的序列为序列1的第1-20位）

引物2：5'-tagTCAGTTCATCCCCATGTTAG-3'（下划线斜体部分为Xba I 的识别位点，其后的序列为序列1的第1160-1179位的反向互补序列）

用限制性内切酶Sma Ⅰ和Xba I双酶切以上所得PCR产物，胶回收酶切片段，与 经过同样双酶切的pCAMBIA2300-Actin载体骨架大片段相连，得到重组质粒。将所述 重组质粒送样测序，将经测序表明在pCAMBIA2300-Actin载体的酶切位点Sma Ⅰ和 Xba I之间插入序列表中序列1所示DNA片段的重组质粒命名为 pCAMBIA2300-Actin-PS1。在重组表达载体pCAMBIA2300-Actin-PS1中，启动所述 PS1基因转录的启动子为水稻内源的Actin1启动子，其核苷酸序列如序列表中序列3 所示。

在重组表达载体pCAMBIA2300-Actin-PS1的构建过程中，也可以人工合成的序列 表的序列1所示的PS1基因为模板。

2、PS1过表达水稻的获得

将步骤1构建的重组表达载体pCAMBIA2300-Actin-PS1，通过农杆菌AGL1（购 自ATCC）导入到水稻（Oryza.sativa L.）品种日本晴的愈伤组织中，具体的转化筛选 方法参见文献“易自力,曹首云,王力,何锶洁,储成才,唐祚舜,周朴华,田文忠.提 高农杆菌转化水稻频率的研究.遗传学报,2001,28(4):352-358”一文。同时设置转入 pCAMBIA2300-Actin空载体的对照。最终获得两种转基因苗，即转入 pCAMBIA2300-Actin-PS1的水稻植株和转入pCAMBIA2300-Actin空载体的水稻植株 （T₀）。

3、PS1过表达水稻的鉴定

（1）PCR初步鉴定

从步骤2获得的T₀代转入pCAMBIA2300-Actin-PS1的转基因水稻，以及转入 pCAMBIA2300-Actin空载体的对照植株中分别提取基因组DNA。用新霉素磷酸转移 酶(NPT II)引物F1和R1（引物序列如下）进行PCR鉴定，经鉴定表明含有NPT II基 因的（PCR产物大小约为522bp）植株即为转基因阳性的植株。

F1：5’-AATATCACGGGTAGCCAACG-3’；

R1：5’-GGTGCCCTGAATGAACTCC-3’。

经上述PCR分子鉴定，将鉴定阳性的其中3个转入pCAMBIA2300-Actin-PS1的 转基因水稻株系分别记作OE-1、OE-2、OE-3。

（2）转录水平分析（RNA表达量）

以步骤（1）获得的T₀代PS1转基因水稻株系OE-1、OE-2、OE-3，转入 pCAMBIA2300-Actin空载体的对照植株，以及未转基因的野生型水稻日本晴为实验材 料。采用如步骤一所述方法提取各材料的总RNA并反转录得到cDNA。进而以所得 cDNA为模板，针对PS1基因进行实时定量荧光PCR，检测各材料中PS1基因在转录 水平上的表达量。实验重复3次，结果取平均值。

实时定量荧光PCR使用C1000^TM Thermal Cycler（CFX96real-time system,BioRad, USA）进行。PCR反应体系（20μl）按照产品使用说明书进行（Biorad公司SsoFast  EvaGreen supermix，货号172-5201）具体体系如下：10μl SsoFast EvaGreen supermix， 2μl上下游引物混合物（上下游引物浓度均为5μM），7μl RNase-free water，1μl cDNA 模板。具体反应程序如下：酶热激活95℃30s，1个循环；变性95℃5s，延伸56℃5s， 共40个循环。

其中，扩增PS1基因的引物序列为：

PS1上游引物：5'-CAAGAAGCCGAACGGTTC-3'（序列1的第1062-1079位）；

PS1下游引物：5'-GTTAGAGTGGAGCAGCAT-3'（序列1的第1147-1164位的反 向互补序列）。

以ACTIN1作为内参基因，扩增内参ACTIN1的引物序列为：

ACTIN1上游引物：5'-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3'；

ACTIN1下游引物：5'-GTACCCTCATCAGGCATCTG-3'。

数据的处理采用Comparative Ct的方法，即Ct值为PCR管中荧光信号达到设定 的域值时所经历的循环数，ΔCt=Ct(PS1)-Ct(ACTIN1)，以2^-ΔCt的值衡量基因转录水 平，对各材料中PS1基因的表达进行分析比较。

各实验材料中PS1基因表达量的实时定量荧光PCR检测结果如图8中B所示， PS1基因的表达均为相对值。从图中可以看出：相比未转基因的野生型水稻日本晴， 步骤（1）获得的T₀代PS1转基因水稻株系OE-1、OE-2、OE-3中PS1基因的表达量 在转录水平上显著提高，而对于转入pCAMBIA2300-Actin空载体的对照植株，其PS1 基因的表达量在转录水平与未转基因的野生型水稻日本晴相比基本一致，无统计学差 异。

二、PS1过表达水稻衰老表型鉴定

以步骤一3（1）获得的T₀代PS1转基因水稻株系OE-1、OE-2、OE-3，转入 pCAMBIA2300-Actin空载体的对照植株，以及未转基因的野生型水稻日本晴（WT） 为实验材料。将各实验材料的水稻种子去壳后，在75%的乙醇中浸泡2min，之后转 移至无菌的三角瓶中，加入终浓度为2%（v/v）的次氯酸钠溶液消毒2次，每次20min。 用无菌水清洗6～8次，然后在超净工作台吹干后播种在1/2MS培养基上，置于光照培 养箱中培养，培养条件为白天30℃，12h光照，晚上28℃，12h光照。观察各水稻株 系的植株表型。其中，1/2MS培养基的配方如下：1L培养基中加入MS盐2g，蔗糖 20g，调节pH至5.8，加入琼脂8g，121℃灭菌20min后备用。实验重复三次，结果 取平均值。

结果如图8中A所示，相同生长时间，未转基因的野生型水稻日本晴植株仍青绿， 但步骤一3（1）获得的T₀代PS1转基因水稻株系OE-1、OE-2、OE-3已干黄，表现 出明显的早衰，且结合步骤一中的各水稻株系的PS1基因转录水平分析结果，发现各 水稻株系表型出现的衰老程度与PS1基因表达水平呈现正相关。而对于转入 pCAMBIA2300-Actin空载体的对照植株，其衰老表型与未转基因的野生型水稻日本晴 相比基本一致，无统计学差异。

三、PS1过表达水稻籽粒千粒重测定

以步骤一3（1）获得的T₀代PS1转基因水稻株系OE-1、OE-2，转入 pCAMBIA2300-Actin空载体的对照植株，以及未转基因的野生型水稻日本晴为实验材 料。按照实施例2步骤二中的方法将各实验材料的种子播种后培养。各实验材料分别 收获完全成熟的水稻籽粒，65℃烘箱烘烤至恒重，测定种子千粒重变化。实验设置十 个重复，结果取平均值，

结果如图9所示，和未转基因的野生型水稻日本晴相比较，T₀代PS1转基因水稻 株系OE-1、OE-2的籽粒千粒重明显降低。而对于转入pCAMBIA2300-Actin空载体的 对照植株，其籽粒千粒重与未转基因的野生型水稻日本晴相比基本一致，无统计学差 异。

实施例4、PS1基因的RNAi水稻的获得及功能鉴定

一、PS1基因的RNAi水稻的获得

1、PS1RNAi载体的构建

（1）水稻总RNA的提取及cDNA的获得

同实施例3步骤一。

（2）PS1RNAi载体的构建

通过序列比对，在PS1基因的编码区找出一段特异片段设计引物3与引物4。以 步骤（1）所得cDNA为模板，通过引物3与引物4进行PCR扩增，反应结束后对其 产物进行纯化，表明扩增得到约274bp片段，测序表明，该片段具有序列表中序列1 的第457-730位。

引物3：5'-gtcaATGAAGTTCCGCAACACCTC-3'（下划线斜体部分为Xho I 的识别位点，其后的序列为序列1的第457-476位）

引物4：5'-gtcaTGGAAGGGATCTTCTGCATC-3'（下划线斜体部分为BamH  I的识别位点，其后的序列为序列1的第711-730位的反向互补序列）

用限制性内切酶Xho I和BamH I双酶切以上所得PCR产物，胶回收酶切片段， 与经过Xho I和Bgl II双酶切的pUCRNAi载体骨架大片段相连（BamH I和Bgl II为同 尾酶），得到中间载体pSRi-1。之后用限制性内切酶Xho I和BamH I双酶切以上所得 PCR产物，胶回收酶切片段，与经过BamH I和Sal I双酶切的中间载体pSRi-1骨架大 片段相连（Xho I和Sal I为同尾酶），得到中间载体pSRi-2。最后用限制性内切酶Xho  I和Pst I双酶切中间载体pSRi-2，胶回收酶切片段（反向重复序列，大小约为768bp）， 与经过Sal I和Pst I双酶切的pCAMBIA2300-Actin载体骨架大片段相连（Xho I和Sal  I为同尾酶），得到重组质粒。将所述重组质粒送样测序，将经测序表明在 pCAMBIA2300-Actin载体的酶切位点Sal I和Pst I之间插入序列表中序列5所示DNA 片段的重组质粒命名为PS1RNAi。在重质粒PS1RNAi中，启动所述序列5所示DNA 片段转录的启动子为水稻内源的Actin1启动子，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。 序列5由768个核苷酸组成。其中，第1-274位为所述PS1基因的一个片段的正向序 列（与序列表中序列1的第457-730位一致），第281-481位为GA20-1st内含子核苷 酸序列，第488-768位为所述PS1基因的一个片段的反向序列（为序列表中序列1的 第457-730位的反向互补序列）。正向序列和反向序列之间由一段内含子（intron）序 列隔开以维持载体的稳定性；该系统在植物细胞中转录产生带发夹结构（hairpin）的 dsRNA，引发RNAi，从而抑制目的基因的表达。

在重组质粒PS1RNAi的构建过程中，也可以人工合成的序列表的序列1所示的 PS1基因为模板。

2、PS1基因的RNAi水稻的获得

将步骤1构建的重组质粒PS1RNAi，通过农杆菌AGL1（购自ATCC）导入到水 稻（Oryza.sativa L.）品种日本晴的愈伤组织中，具体的转化筛选方法参见文献“易自 力,曹首云,王力,何锶洁,储成才,唐祚舜,周朴华,田文忠.提高农杆菌转化水稻频 率的研究.遗传学报,2001,28(4):352-358”一文。同时设置转入pCAMBIA2300-Actin 空载体的对照。最终获得两种转基因苗，即转入PS1RNAi载体的水稻植株和转入 pCAMBIA2300-Actin空载体的水稻植株（T₀）。

3、PS1基因的RNAi水稻的鉴定

（1）PCR初步鉴定

从步骤2获得的T₀代转入PS1RNAi载体的转基因水稻，以及转入 pCAMBIA2300-Actin空载体的对照植株中分别提取基因组DNA。用新霉素磷酸转移 酶(NPT II)引物F1和R1（引物序列如下）进行PCR鉴定，经鉴定表明含有NPT II基 因的（PCR产物大小约为522bp）植株即为转基因阳性的植株。

F1：5’-AATATCACGGGTAGCCAACG-3’；

R1：5’-GGTGCCCTGAATGAACTCC-3’。

经上述PCR分子鉴定，将鉴定阳性的其中2个PS1基因的RNAi水稻株系分别记 作Ri-1和Ri-2。

（2）转录水平分析（RNA表达量）

以步骤（1）获得的T₀代PS1基因的RNAi水稻株系Ri1、Ri2，转入 pCAMBIA2300-Actin空载体的对照植株，以及未转基因的野生型水稻日本晴为实验材 料。按照实施例3步骤一中的方法针对各实验材料中PS1基因进行实时定量荧光PCR 检测。

各实验材料中PS1基因表达量的实时定量荧光PCR检测结果如图10中B所示， PS1基因的表达均为相对值。从图中可以看出：相比未转基因的野生型水稻日本晴， 步骤（1）获得的T₀代PS1基因的RNAi水稻株系Ri1和Ri2中PS1基因的表达量在 转录水平上显著降低。而对于转入pCAMBIA2300-Actin空载体的对照植株，其PS1 基因的表达量在转录水平与未转基因的野生型水稻日本晴相比基本一致，无统计学差 异。

二、PS1基因的RNAi水稻的衰老表型鉴定

以步骤一3（1）获得的T₀代PS1基因的RNAi水稻株系Ri1、Ri2，转入 pCAMBIA2300-Actin空载体的对照植株，以及未转基因的野生型水稻日本晴（WT） 为实验材料。按照实施例3步骤二中的方法将各实验材料的种子播种后培养。观察各 水稻株系的植株表型。实验重复三次，结果取平均值。

结果如图10中A所示，相同生长时间，未转基因的野生型水稻日本晴植株已干 黄，但步骤一3（1）获得的T₀代PS1基因的RNAi水稻株系Ri1、Ri2仍青绿，表现 出明显的迟衰，且结合步骤一中的各水稻株系的转录水平分析结果，发现各水稻株系 表型出现的衰老程度与PS1基因表达水平呈现正相关。而对于转入 pCAMBIA2300-Actin空载体的对照植株，其衰老表型与未转基因的野生型水稻日本晴 相比基本一致，无统计学差异。

三、PS1基因的RNAi水稻的籽粒千粒重测定

以步骤一3（1）获得的T₀代PS1基因的RNAi水稻株系Ri1、Ri2，转入 pCAMBIA2300-Actin空载体的对照植株，以及未转基因的野生型水稻日本晴为实验材 料。按照实施例3步骤二中的方法将各实验材料的种子播种后培养。各实验材料分别 收获完全成熟的水稻籽粒，65℃烘箱烘烤至恒重，测定种子千粒重变化。实验设置十 个重复，结果取平均值，

结果如图11所示，和未转基因的野生型水稻日本晴相比较，步骤一3（1）获得 的T₀代PS1基因的RNAi水稻株系Ri1、Ri2的籽粒千粒重明显提高。而对于转入 pCAMBIA2300-Actin空载体的对照植株，其籽粒千粒重与未转基因的野生型水稻日本 晴相比基本一致，无统计学差异。