苯丙酮酸还原酶及使用该酶制造光学活性苯基乳酸及4-羟基苯基乳酸的制造方法

摘要

本发明提供一种苯丙酮酸还原酶及对其编码的基因、使用这些物质制造光学活性3-苯基乳酸及光学活性4-羟基苯基乳酸的制造方法，所述苯丙酮酸还原酶及对其编码的基因能高效地得到高纯度的光学活性3-苯基乳酸和4-羟基苯基乳酸。

说明书

技术领域

本发明涉及一种苯丙酮酸还原酶及其基因、使用这些物质制造光学活性苯基乳酸 及光学活性4-羟基苯基乳酸的制造方法。

背景技术

3-苯基乳酸及4-羟基苯基乳酸均为自乳酸菌中分离出来的抗菌物质(非专利文献 1～4)。

3-苯基乳酸的抗菌活性不仅作用于赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、娄地青霉菌 (Penicillium roqueforti)、桔青霉(Penicillium citrinum)等霉菌(非专利文献5)，还广泛地 作用于单核球增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)0157等有害的革兰氏阴性、阳性细 菌(非专利文献1、2、5～7)。该广泛的抗菌活性提示了3-苯基乳酸有用作食品添加物 的可能性。另外，其是有用化合物，还可用作除此以外的医药、农药及其中间体、芳 香族生物聚合物-塑料、液晶等功能性材料、生物适合性(医疗)材料等。

4-羟基苯基乳酸也与3-苯基乳酸同样是来自乳酸菌的，故而不仅提示了其有用作 食品添加物的可能性，还期待其作为除此以外的用途中的抗菌性添加物、以及医药、 农药及其中间体。

关于这些化合物的制造方法，大多数的报告中尝试通过有机化学合成来制造光学 活性3-苯基乳酸(专利文献1)，但就环境问题或成本的观点而言，期待有一种不使用 此类化学物质的新型合成方法。另外，对于4-羟基苯基乳酸来说，尚未确立高纯度且 大量生产的技术，其现状是：利用有机化学合成，消旋体为主要产物，即以D体及L 体混合存在的状态作为试验试剂而少量市售。这种情况下，迫切希望有一种生成效率 更高的合成方法。

作为这些课题的潜在性解决方法，可列举出利用微生物培养或酶来合成光学活性 3-苯基乳酸或4-羟基苯基乳酸的合成方法，其不使用催化剂或有机溶剂等化学物质就 能够大量生产所需化合物。

作为3-苯基乳酸的生产菌，已知有属于子嚢菌的白地丝霉菌(Geotrichum  candidum)(非专利文献2)、属于产丙酸菌的费氏丙酸菌(Propionibacterium  freudenreichii)(非专利文献8)、各种乳酸菌(非专利文献5、9～11)。

然而，关于与3-苯基乳酸的生产有关的酶的分子水平上的研究，于2008年仅仅 是对乳酸杆菌SK007(Lactobacillus.sp SK007)的D,L-乳酸脱氢酶(D,L-Lactate  dehydrogenase)进行了纯化(非专利文献12)。另外，作为对于针对被假设为3-苯基乳 酸的前体的苯丙酮酸具有酶活性的酶的基因进行克隆的例子，仅存在如下两例：来自 植物乳酸杆菌SK002(Lactobacillus plantarum SK002)的重组D,L-乳酸脱氢酶 (D,L-Lactate dehydrogenase)(非专利文献13)、来自埃特里根瘤菌CFN42(Rhizobium  etli CFN42)的重组乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(Glyoxylate  reductase/Hydroxypyruvate reductase)(非专利文献16)，但尚不明确这些是否参与3-苯 基乳酸的生产。

另外，于专利文献2及3中存在关于光学活性3-苯基乳酸生产菌的报告，但这些 中R体与S体混合存在，因此并不理想。

专利文献4中报告有：PF1022物质生产菌的丝状真菌无孢菌群(Mycelia  sterilia)(FERM BP-2671)产生的酶作用于苯丙酮酸而将其还原并转变为(R)-2-羟基-3- 苯基丙酸。

然而，实际状况是仍无法高效地获得高纯度的光学活性3-苯基乳酸。

如上所述，尚未确立可大量地获得高纯度的光学活性3-苯基乳酸及4-羟基苯基 乳酸的制造方法，迫切期待对其进行开发。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2003-192633号公报

专利文献2：日本特开平9-37792号公报

专利文献3：日本特开2000-300284号公报

专利文献4：国际公开2001/81563号小手册

非专利文献

非专利文献1：Lavermicocca,P.;Valerio,F.;Evidente,A.;Lazzaroni,S.;Corsetti,A.; Gobbetti,M.,Appl.Environ.Microbiol.2000664084-4090

非专利文献2：Dieuleveux,V.;Van Der Pyl,D.;Chataud,J.;Gueguen,M.,Appl. Environ.Microbiol.199864800-803

非专利文献3：Paola La et al.,“Purification and characterization of novel antifungal  compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain21B”，Applied and  Environmental Microbiology(2000),66(9),4084-4090.

非专利文献4：Wanmeng Mu et al.,“Production of4-hydroxyphenyllactic acid by  Lactobacillus sp.SK007”fermentation Journal of Bioscience and Bioengineering(2010), 109(4),369-371.

非专利文献5：Ohhira,I.;Kuwaki,S.;Morita,H.;Suzuki,T.;Tomita,S.;Hisamatsu, S.;Sonoki,S.;Shinoda,S.,Biocontrol Sci.2004977-81

非专利文献6：Dieuleveux,V.;Gueguen,M.；J.Food Prot.1998611281-1285

非专利文献7：Dieuleveux,V.;Lemarinier,S.;Gueguen,M.；Int.J.Food Microbiol. 199840177-183

非专利文献8：Thierry,A.;Maillard,M.,20028217-32

非专利文献9：Strom,K.;Sjogren,J.;Broberg,A.;Schnurer,Appl.Environ. Microbiol.2002684322-4327

非专利文献10：Magnusson,J.;Strom,K.;Roos,S.;Sjogren,J.;Schnurer,Microbiol. Lett.2003219129-135

非专利文献11：Valerio,F.;Lavermicocca,P.;Pascale,M.;Visconti,A.,Microbiol. Lett.2004233289-295

非专利文献12：Li,X.;Pan,.Mu,W.&Zhang,T.(2008).,Journal of Agricultural and  Food Chemistry,5672392-399

非专利文献13：Jianghua,J.;Wanmeng,M.;Tao,Z.;Bo.;,Appl.Biochem.Biotechnol. 2009(in press)

非专利文献14：Ishikura,Y.;Tsuzuki,S.;Takahashi,O.;Tokuda,C.;Nakanishi,R.; Shinoda,T.;Taguchi,H.,J.Biochem.2005138,741-749

发明内容

发明要解决的问题

鉴于上述问题及实际状况，本发明欲提供一种可高效得到高纯度的光学活性3- 苯基乳酸及4-羟基苯基乳酸的苯丙酮酸还原酶及对其进行编码的基因、利用这些物质 合成光学活性3-苯基乳酸及4-羟基苯基乳酸的合成方法。

解决问题的技术手段

不仅是对已知的乳酸菌，本发明的发明人还对范围更广的微生物反复地进行了反 复试验，结果发现了由葡萄糖大量生产光学活性苯基乳酸的新型酵母菌。并且，还发 现大量生产光学活性苯基乳酸的这些酵母菌具有新颖且特殊的苯丙酮酸还原酶(以下 也称为“PPR”)，且该PPR为新型酶，其特别地以苯丙酮酸作为底物并对其具有较 高的亲和性且发挥作用而专门生成光学活性苯基乳酸。进而发现：通过针对对该新颖 且特异的PPR进行编码的基因(以下也称为“ppr基因”)进行克隆化并使用其转化体， 能够以基因工程方法制造特异且新颖的PPR。另外，还发现：还可利用该转化体由葡 萄糖获得光学活性苯基乳酸。

进而，本发明的发明人发现：本发明的PPR对于4-羟基苯丙酮酸也具有亲和性， 以4-羟基苯丙酮酸作为底物，由此能够选择性地生产高纯度的光学活性4-羟基苯基 乳酸，具体而言是高纯度的D-4-羟基苯基乳酸。并且，本发明人还发现能够确立一 种即便使用价低且可稳定地获得的D-葡萄糖作为其原材料(底物)也能大量生产高纯 度的光学活性4-羟基苯基乳酸的制造方法。

另外，本发明的PPR是一种新型酶，其与专利文献1所记载的酶仅具有24%的 同源性，且与以往已知的酶也仅具有约40%左右的同源性。并且，如后述实施例所示， 本发明的PPR不属于现存的HPPR或GRHPR家族，其形成了一个新的家族。并且， 与以往的PPR相比，本发明的PPR的酶活性提高了数十倍，产业上的可利用性也是 较高的。另外，还清楚认识到了生产此类特异的酶且由葡萄糖产生光学活性苯基乳酸 的本发明的新型酵母菌也是重要的遗传资源。

即，本发明涉及以下的发明。

[1]一种多核苷酸，其对以苯丙酮酸作为底物而生成D-苯基乳酸的苯丙酮酸还原 酶进行编码，其中，

所述多核苷酸选自由如下多核苷酸所组成的组：

(a)由序列编号5所示的碱基序列构成的多核苷酸；

(b)与由序列编号5所示的碱基序列构成的多核苷酸于严格条件下杂交的多核苷 酸；

(c)由与由序列编号5所示的碱基序列构成的多核苷酸具有60%以上的同源性的 碱基序列构成的多核苷酸；

(d)含有序列编号6、7或8所示的碱基序列的多核苷酸；

(e)对序列编号4所示的氨基酸序列进行编码的多核苷酸；

(f)对序列编号4所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加有1个或多个氨基酸的氨 基酸序列进行编码的多核苷酸；及

(g)对与序列编号4所示的氨基酸序列具有60%以上的同源性的氨基酸序列进行 编码的多核苷酸。

[2]一种苯丙酮酸还原酶，其以苯丙酮酸作为底物而生成D-苯基乳酸，其中，

所述苯丙酮酸还原酶含有如下的任一序列：

(a)序列编号4所示的氨基酸序列；

(b)序列编号4所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加有1个或多个氨基酸的氨 基酸序列；或

(c)与序列编号4所示的氨基酸序列具有60%以上的同源性的氨基酸序列。

[3]一种重组载体，其含有[1]所述的多核苷酸。

[4]一种转化体，其含有[3]所述的重组载体。

[5]如[4]所述的转化体，其中，其宿主为微生物。

[6]如[5]所述的转化体，其中，所述微生物为大肠杆菌、或者苯丙氨酸或酪氨酸 生产性重组微生物。

[7]一种D-苯基乳酸或D-4-羟基苯基乳酸的制造方法，其特征在于，使用苯丙酮 酸还原酶，以苯丙酮酸或4-羟基苯丙酮酸作为底物，生成D-苯基乳酸或D-4-羟基苯 基乳酸，并将其回收，所述苯丙酮酸还原酶由如下(a)、(b)或(c)的蛋白质构成：

(a)由序列编号4所示的氨基酸序列构成的蛋白质；

(b)由序列编号4所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加有1个或多个氨基酸的 氨基酸序列构成的蛋白质；或

(c)由与序列编号4所示的氨基酸序列具有60%以上的同源性的氨基酸序列构成 的蛋白质。

[8]如[7]所述的D-苯基乳酸或D-4-羟基苯基乳酸的制造方法，其中，所述苯丙酮 酸还原酶的反应条件为：反应温度20～40℃、pH6～7。

[9]一种D-苯基乳酸或D-4-羟基苯基乳酸的制造方法，其特征在于，使用含有以 下基因的微生物进行培养，由微生物底物生成D-苯基乳酸或D-4-羟基苯基乳酸，并 将其回收，所述基因对由如下(a)、(b)或(c)的蛋白质构成的苯丙酮酸还原酶进行编码：

(a)由序列编号4所示的氨基酸序列构成的蛋白质；

(b)由序列编号4所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加有1个或多个氨基酸的 氨基酸序列构成的蛋白质；或

(c)由与序列编号4所示的氨基酸序列具有60%以上的同源性的氨基酸序列构成 的蛋白质。

[10]如[9]所述的D-苯基乳酸或D-4-羟基苯基乳酸的制造方法，其中，所述微生 物是威克酵母属酵母或以其为母株的变异株、或者是[4]或[5]所述的转化体。

[11]如[9]所述的D-苯基乳酸或D-4-羟基苯基乳酸的制造方法，其中，所述微生 物底物为选自D-葡萄糖、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、苯丙酮酸及4-羟基苯丙酮酸中的1 种以上的底物。

[12]如[10]所述的D-苯基乳酸或D-4-羟基苯基乳酸的制造方法，其中，威克酵母 属酵母为荧光威克酵母(Wicherhamia fluorescens)。

[13]一种微生物，其被命名为荧光威克酵母TK1(Wicherhamia fluorescens TK1)， 并被保藏为FERM AP-22048。

发明的效果

根据本发明，可高效地获得高纯度的光学活性3-苯基乳酸及4-羟基苯基乳酸。

附图说明

图1为荧光威克酵母TK1菌株的光学显微镜像。

图2为“L-苯基乳酸与D-苯基乳酸的HPLC谱图”，其中，(a)中D-3-苯基乳酸及 L-3-苯基乳酸的样品/L-苯基乳酸于22.4分钟时被作为最初的波峰洗脱出来，D-苯基 乳酸于31.7分钟时被洗脱出来；(b)记载的是荧光威克酵母TK1于MM培养基中培养 后的上清液；(c)记载的是荧光威克酵母TK1于GPAMM培养基中培养后的上清液；

(d)记载的是利用由本菌株所获得的酶处理苯丙酮酸底物所得的物质。

图3中示出了荧光威克酵母TK1菌株于培养中的菌体量及光学活性苯基乳酸的 生产量。

图4中示出了荧光威克酵母TK1菌株于培养中的菌体量、光学活性苯基乳酸(PLA) 的生产量、苯丙酮酸(PPA)的生产量。

图5中示出了荧光威克酵母TK1菌株于培养中的菌体量、光学活性苯基乳酸(PLA) 的生产量、L-苯基丙氨酸(Phe)的生产量。

图6示出了荧光威克酵母TK1菌株每隔一定培养时间(2、12、48小时)的苯丙酮 酸还原酶活性。

图7示出了荧光威克酵母TK1菌株的PPR于各pH值[Tris-HCl缓冲液(pH7、 pH7.5、pH8)、磷酸缓冲液(pH5.5、pH6、pH6.5、pH7)]下的、将pH6.5的PPR活性 设为100时的各PPR活性(相对比)。

图8示出了“PPR的分子量”，其中，(a)为本酶PPR的SDS-PAGE电泳分析(右 侧)；(b)为本酶PPR的凝胶过滤分析(黑色菱形)。

图9为含有本发明的ppr基因(pprA基因)的质粒载体的制作例示。

图10为含有本发明的ppr基因(pprA基因)的转化体的例示。

图11为“对于1个来自PPR的胰蛋白酶肽的MALDI-TOF的MS图谱及 MALDI-QIT-TOF的MS2图谱/来自荧光威克酵母NRRLYB-4819的PPR的阳离子 MALDI-TOF质谱”，其为本发明的内部氨基酸序列的MALDI-TOF的MS图谱。

图12为“对于1个来自PPR的胰蛋白酶肽的MALDI-TOF的MS图谱及 MALDI-QIT-TOF的MS2图谱/面板所示的m/z2000.0(a)及2427.3(b)的质谱离子波峰 的MS/MS图谱”，其为本发明的内部氨基酸序列的MALDI-TOF的MS图谱。(a)为 序列编号2所示的氨基酸序列；(b)为序列编号3所示的氨基酸序列。

图13“巢式PRC(nested PCR)产物的琼脂糖凝胶电泳”，其表示以N末端氨基酸 序列(序列编号1)及内部氨基酸序列(序列编号3)的信息为基础而获得的935bp的 DNA片段的琼脂糖凝胶电泳。1：pprA的PCR产物M：DNA标记。

图14“荧光威克酵母TK1ppr基因的核苷酸序列及其推测氨基酸序列”，其表示 来自荧光威克酵母(W.fluorescens)TK1菌株的ppr基因及其氨基酸序列。以框图示出 由MALDI-QIT-TOF MS分析所确定的PPR的内部氨基酸序列。以箭头表示引物NP 及Oligo dT的位置。以虚线箭头表示巢式引物2427P(nested primer2427P)。以星号表 示终止密码子。

图15“将pprA用作探针的全DNA的southern印迹分析”，其中表现了对于以限 制酶(HindIII、EcoRI、PstI、BamHI)处理的荧光威克酵母TK1菌株的全DNA以含有 pprA基因的序列的DNA片段作为探针的southern杂交。将荧光威克酵母TK1菌株 的全DNA以限制酶HindIII、EcoRI、PstI、BamHI进行消化、电泳，并于Zeta-Probe(注 册商标)印迹膜(Bio-Rad)上进行印迹，再使用探针进行杂交。

图16“苯丙氨酸于PPR活性及基因表达中的效果”，其中示出了将荧光威克酵母 TK1菌株以GPMM培养基(+Phe)、GPAMM培养基(+PPA)、MM培养基(Glc)进行培 养时的PPR活性及ppr基因(pprA基因)表达量。(A)表示于30℃培养10小时的荧光 威克酵母TK1的无细胞提取液中的PPR的比活性。于含有56mM葡萄糖(Glc)、56mM 葡萄糖+5mM苯丙氨酸(+Phe)或56mM葡萄糖+5mM苯丙酮酸(+PPA)的MM培养基 中培养细胞。(B)为pprA转录物的定量的PCR。将萤光威克酵母NRRLYB-4819如上 述那样进行培养。棒状图为由实时PCR所确定的相对表达比率。

图17“纯化rPPR(recombinant PPR，重组PPR)的SDS-PAGE”，其中示出了含 有ppr基因的大肠杆菌生产的酶rPPR的SDS-PAGE的结果。Lane1：纯化rPPR， M:分子量标准(Bio-Rad精确蛋白质标准试剂盒)。将分子量示于左端。

图18“来自荧光威克酵母TK1的PPR与来自其他微生物的PPR的推测氨基酸 序列的多重比对”，其中示出了使用来自荧光威克酵母TK1菌株的酶PPR及来自其他 微生物的酶(DLDH、GRHPR、HPPR)的氨基酸序列的比对解析结果。使用CLUSTALX 进行蛋白质的一级结构的比对。序列为C.dubliniensis(Accession No.:

XP_002418129)、E.coli(P37666)、S.scutellarioide(Q65CJ7)及L.plantarum(BAA14352) 的PPR相关蛋白质。星号表示同一氨基酸。点及冒号表示保守氨基酸的置换。短线 表示计算机生成的空隙。开放框表示NAD结合结构的保守序列。

图19表示荧光威克酵母TK1菌株中的D-3-苯基乳酸的生物合成体系。

图20表示含有ppr基因的苯丙氨酸生产性微生物产生的苯基乳酸。

图21表示含有pprA基因的苯丙氨酸生产性微生物(ATCC31882株/pHSGpprA) 以D-葡萄糖作为底物时的菌体浓度及苯基乳酸生产量。

图22表示含有tyrA基因的表达载体。

图23为4-羟基苯基乳酸的HPLC分析。标准：D,L-4-羟基苯基乳酸(左侧：L-4- 羟基苯基乳酸/右侧；D-4-羟基苯基乳酸)；NST-ldhA菌株的L-4-羟基苯基乳；NST-ldhA 菌株生成的D-4-羟基苯基乳酸。

具体实施方式

1.本发明的苯丙酮酸还原酶

(1)本发明的PPR的酶学性质

(2)本发明的PPR的氨基酸序列及对其进行编码的基因

(3)本发明的PPR的获取方法

2.光学活性3-苯基乳酸的制造方法

(1)利用本发明的PPR制造光学活性苯基乳酸的制造方法

(2)利用具有对本发明的PPR进行编码的基因的微生物制造光学活性3-苯基乳酸 的制造方法

3.光学活性4-羟基苯基乳酸的制造方法

(1)利用本发明的PPR制造光学活性4-羟基苯基乳酸的制造方法

(2)利用具有对本发明的PPR进行编码的基因的微生物制造光学活性4-羟基苯基 乳酸的制造方法

<1.本发明的苯丙酮酸还原酶>

本发明的苯丙酮酸还原酶为新型酶，其具有以下的酶学性质与氨基酸序列以及对 其进行编码的基因。该PPR优选为形成了同型二聚体的PPR。

根据本发明的PPR，可获得高纯度的D-苯基乳酸或D-4-羟基苯基乳酸。由于可 直接生成光学活性苯基乳酸或4-羟基苯基乳酸，故而还可通过省略以往的有机合成物 那样的将大致等量混合存在的D体L体各自分离或去除其中之一的分离纯化步骤来 改善作业效率，并且高纯度化也较容易。由于容易获得经高纯度化的光学活性苯基乳 酸及羟基苯基乳酸，故而可容易地用于各种用途，尤其是医药、食品添加物、农药等 要求有高纯度化的技术领域中。

(1)酶学性质

[作用]

本发明的PPR以苯丙酮酸及4-羟基苯丙酮酸作为底物并对其具有较高亲和性， 作用于该底物而生成光学活性苯基乳酸(D-3-苯基乳酸)及4-羟基苯基乳酸(D-4-羟基 苯基乳酸)。优选为对映选择性地生成D-3-苯基乳酸及D-4-羟基苯基乳酸。

[化1]

另外，底物并不限于苯丙酮酸及羟基丙酮酸，除此以外还优选能还原乙醛酸。其 中，以苯丙酮酸作为底物时，k_cat/K_m值最大。

另外，作为辅酶，可利用NADH及NADPH，但对于NADPH的特异性较高。

较理想的是苯丙酮酸及NADPH的k_cat/K_m值(特异性常数)为300～500s^-1mM^-1(K_m值为0.40±0.07mM)的酶，但并不特别地限于该特异性常数。需要说明的是，特异性 常数k_cat/K_m值表示酶将底物转变为生成物时的效率。

作为此时的测定条件，可列举如下的方法。使用50mM的磷酸缓冲液(pH6.5)、 2mM的苯丙酮酸、0.1mM的NADPH作为酶反应液，向其中添加酶并于温度25℃ 进行反应，使用紫外-可见分光光度计(340nm)进行定量。NADPH对340nm的波长 的吸收的摩尔吸光系数为6.2mM^-1·cm^-1。

另外，优选利用作为底物的苯丙酮酸1mol及作为辅酶的NADPH1mol来生成 光学活性苯基乳酸(D-3-苯基乳酸)。

此时的D-3-苯基乳酸：L-3-苯基乳酸的摩尔比优选为100～90：0～10，更优选 为100～95：0～5，进而优选为100～98：0～2，进而，优选为光学纯度99%以上的 D-3-苯基乳酸(光学活性苯基乳酸)。

另外，该反应优选为不可逆反应。此处，所谓不可逆反应是指在以D-3-苯基乳 酸、L-3-苯基乳酸、NAD⁺、NADP⁺的组合作为底物的情况下，不进行酶反应或检测 不出苯丙酮酸。

[底物]

以选自4-羟基苯丙酮酸、3-苯丙酮酸、乙醛酸及羟基丙酮酸的1种以上作为原料 (底物)，并催化还原反应。需要说明的是，较理想的是不以丙酮酸及草酰乙酸作为底 物。

[最佳反应pH值]

以Tris-HCl缓冲液(pH7～8)及磷酸缓冲液(pH5～7)的缓冲液调整至各pH值(25 ℃)后，除pH值以外，以上述[作用]所记载的测定条件求出酶活性，此情况下，在pH6～ 7、尤其是pH6.5～7下显示出了较高的活性。

[反应温度]

于pH6.5、20～40℃的条件下显示出了良好的苯丙酮酸还原反应。

[分子量]

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Lammli等方法)的测定中，本发明的PPR显示出的分 子量为30,000～50,000道耳顿、尤其是分子量为40,000道耳顿。

另外，凝胶过滤法的测定中，显示出的分子量为70,000～90,000，尤其是分子量 80,000。

此时的凝胶过滤的测定分析中，将酶供给至预先用洗脱缓冲液(10%的甘油、1mM 的二硫苏糖醇(DTT，20mM的磷酸缓冲液、0.15mM的NaCl，pH7)平衡化的Superose 凝胶过滤柱(Superose610/300)中，利用柱容量的1倍的洗脱缓冲液进行洗脱。

作为标准蛋白质，使用牛血清白蛋白(M.W.67,000)、胰凝乳蛋白酶原 (M.W.25,000)、α-淀粉酶(M.W.45,000)、β-淀粉酶(M.W.200,000)。

[金属离子及抑制剂的影响]

2)金属离子及抑制剂的影响

PPR活性受到选自Cu²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、WO²⁺、Hg²⁺中的1种以上的金属离子的强 烈抑制(抑制90～100%左右)。PPR活性受到选自Ni²⁺、Co²⁺中的1种以上的金属离 子较强的抑制(抑制30～40%左右)。PPR活性几乎不受选自Mn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mo²⁺中的1种以上的金属离子的抑制或完全不受抑制(抑制15～0%左右)。

其不太受选自吐温80(吐温：注册商标)、2-疏基乙醇(2-mercaptethanol)的1种以 上的抑制剂的抑制(30～50%)。其几乎不受选自TritonX-100(tritonX)、乙二胺四乙酸 (EDTA)的1种以上抑制剂的抑制(10～20%左右)。

需要说明的是，除了以各物质为1mM的方式同时添加金属离子及抑制剂以外， 以上述[作用]所记载的测定条件求出酶活性。

[部分氨基酸序列]

本发明的PPR优选至少具有以下的N末端氨基酸序列和/或内部氨基酸序列的部 分氨基酸序列。需要说明的是，该部分氨基酸序列也可置换、缺失、添加有1个或多 个氨基酸。

[部分氨基酸序列：N末端氨基酸序列]

N末端侧的氨基酸残基的序列为N末端侧的MKKPQVLILGRI的12氨基酸残基 的序列(序列编号1)。

需要说明的是，N末端侧的氨基酸残基的序列可利用公知的方法(Edman,P.(1950) Acta Chem.Scand.4:283-293)来获得。作为一例，可通过如下方式确定：利用SDS-聚 丙烯酰胺电泳法使酶泳动，使所获得的酶带转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜等电泳， 其后利用蛋白质测序仪进行分析。

[部分氨基酸序列：内部氨基酸序列]

胰蛋白酶消化肽的氨基酸残基的序列为具有NIQAIYGNWGGLASFGGFK的19 氨基酸残基的序列(序列编号2)、及VAFAALDVFEEEPFIHPGLIGR的22氨基酸残基 的序列(序列编号3)。

需要说明的是，胰蛋白酶消化肽利用公知的方法(Shimizu，M.，et al.(2009) Proteomics9，7-19)获得即可。作为一例，将于SDS-PAGE中泳动的经纯化的本发明 的PPR自凝胶中切断，利用胰蛋白酶(温度36～38℃、pH8～9、4～18小时)进行凝 胶内消化而获得。另外，可利用市售品的胰蛋白酶消化肽试剂盒进行，具体而言可列 举Trypsin Profile IGD Kit：凝胶内消化试剂盒(SIGMA-ALDORICH公司)等。

(2)本发明的PPR的氨基酸序列及对其进行编码的基因(碱基序列)

本发明的PPR包含以下(a)、(b)及(c)的蛋白质。

(a)由序列编号4所示的氨基酸序列构成的蛋白质。

(b)由序列编号4所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加有1个或多个氨基酸的 氨基酸序列构成的蛋白质，其具有苯丙酮酸还原活性，且对于苯丙酮酸具有较高的亲 和性。

(c)由与序列编号4所示的氨基酸序列具有60%以上的同源性的氨基酸序列构成 的蛋白质，其具有苯丙酮酸还原活性，且对于苯丙酮酸具有较高的亲和性。

对本发明的序列编号4所示的PPR的氨基酸序列与已知的苯丙酮酸还原酶的氨 基酸序列的同源性进行比较，结果其与任何已知苯丙酮酸还原酶的氨基酸序列的同源 性均极低，为约20%～50%左右，这提示本发明的PPR为新型酶，且形成新的酶组。 另外，本发明的ppr基因由于包含对本发明的PPR进行编码的基因，故而为新型基因。

本发明中，氨基酸序列及碱基序列的同源性可通过Lipman-Person法(Science， 227，1435,(1985))等公知的算法进行计算，另外，可通过比较序列而进行判定。具体 而言，使用遗传信息处理软件Genetyx-ver8.1(软件开发：GENETYX公司)的同源性 解析(Search homology)程序的检索同源性或最大匹配程序，可算出同源性。例如，通 过将比较单元大小(Unit size to compare)(ktup)设为2进行解析而算出。

另外，本发明中，转录起始区域为包含启动子及转录起点的区域，核糖体结合部 位为相当于与起始密码子一起形成翻译起始控制区域的Shine-Dalgarno(SD)序列(Proc. Natl.Acad.Sci.USA74，5463(1974))的部分。

此处，序列编号4所示的氨基酸序列中置换、缺失或添加有1个或多个氨基酸的 氨基酸序列是指分别与序列编号4功能上等价的氨基酸序列，是置换、缺失或添加有 例如1个或多个(优选为1～6个、更优选为1～3个)氨基酸的氨基酸序列，并且该序 列依然具有苯丙酮酸还原活性，且对于苯丙酮酸保持较高的亲和性。另外，添加包括 向两末端添加1个或多个氨基酸(优选为1～6个、更优选为1～3个)。

上述功能上等价的氨基酸是指，只要为至少具有苯丙酮酸还原活性及4-羟基苯丙 酮酸还原活性的酶即可，可进一步具有附加性质。进而，优选对苯丙酮酸具有较高的 亲和性。另外，优选具有与由序列编号5所示的ppr基因所编码的蛋白质实质上相同 的功能，具体而言是具有上述本发明的PPR的功能。

此处，所谓具有苯丙酮酸还原活性及4-羟基苯丙酮酸还原活性，是指如上述路线 1及2那样，使苯丙酮酸及4-羟基苯丙酮酸分别形成为D-3-苯基乳酸及D-4-羟基苯基 乳酸，关于其活性的程度，只要能发挥其功能，则对功能的高低并无特别限制，即不 仅可与序列编号4所示的蛋白质相同程度，也可与其相比程度较高或较低。

另外，所谓附加性质，可列举与由序列编号4所示的氨基酸序列构成的蛋白质相 比稳定性优异的性质、反应温度或pH值不同或范围大的性质等。

另外，优选与序列编号4所示的氨基酸序列具有60%以上、优选为65%以上、 更优选为70%以上、更优选为75%以上、更优选为80%以上、更优选为85%以上、 进而优选为90%以上、进而优选为95%以上、特别优选为98%以上的同源性的氨基 酸序列。

如下述实施例所示，通过发现本发明的PPR而发现了新型酶组，由此可以预知， 只要是与由本发明的序列编号4所示的氨基酸序列构成的蛋白质在功能上等价的酶 (上述那样具有苯丙酮酸还原活性且至少对苯丙酮酸具有较高的亲和性)，并且同源性 在60%左右以上的范围内，则其属于该新型酶组。通常，由于显示60%以上的相同 性的蛋白质大多具有类似的酶的特异性，故而可认为显示此类相同性的酶属于相同酶 组。

本发明的ppr基因为对由序列编号4所示的氨基酸序列构成的蛋白质进行编码的 基因或对由与该氨基酸序列在功能上等价的氨基酸序列构成的蛋白质进行编码的基 因，其还包含如下(a)～(d)的多核苷酸。其中，优选如下(a)～(d)。

(a)由序列编号5所示的碱基序列构成的多核苷酸。

(b)与由序列编号5所示的碱基序列构成的多核苷酸于严格条件下杂交、且对具 有苯丙酮酸还原活性的蛋白质进行编码的多核苷酸。

(c)由与序列编号5所示的碱基序列具有60%以上的同源性的碱基序列构成、且 对具有苯丙酮酸还原活性且与苯丙酮酸具有较高的亲和性的蛋白质进行编码的多核 苷酸。

(d)含有序列编号6、7或8所示的碱基序列、且对具有苯丙酮酸还原活性且与苯 丙酮酸具有较高的亲和性的蛋白质进行编码的多核苷酸。

与序列编号5所示的碱基序列具有优选65%以上、更优选为70%以上、更优选 为75%以上、更优选为80%以上、更优选为85%以上、进而优选为90%以上、进而 更优选为95%以上、特别优选98%以上的同源性的碱基序列是适宜的。

即，序列编号5的碱基序列所示的多核苷酸(DNA等)中，即便是通过变异剂处理、 无规变异、特定部位突然变异、缺损或添加等对其部分性地改变了其碱基序列的多核 苷酸，由这些DNA变异体与序列编号5的碱基序列所示的DNA于严格条件下杂交、 且对至少具有苯丙酮酸还原活性的蛋白质进行编码的多核苷酸构成的基因也包含在 本发明的ppr基因中。例如可列举置换、缺失或添加有1个或多个(例如2～3个)碱基 序列的碱基序列等。另外，添加也包含向两末端的添加。此处，“1个或多个”是指1～ 6个，优选为1～3个左右。

此处，所谓“严格条件”，例如可列举Molecular cloning-a laboratory manual,2^nd  edition(Sambrook et al,1989)中所记载的条件。即，可列举：于含有6×SSC(1×SSC 的组成：0.15M的氯化钠、0.015M的柠檬酸钠、pH7.0)、0.5%的SDS、5×Denhardt 及100mg/mL的鲱鱼精子DNA的溶液中，与探针共同于65℃恒温8～16小时而使其 杂交的条件等。

另外，例如与(a)所示的基因相比，上述(b)～(d)所示的基因还可具有mRNA的表 达量较多、其mRNA的稳定性较高、翻译的蛋白质的稳定性优异等附加性质。

另外，可以在这些(a)～(d)基因的上游结合转录起始控制区域、翻译起始控制区 域或分泌信号区域中的任意1个以上区域。

需要说明的是，本发明中，转录起始区域是包含启动子及转录起点的区域，核糖 体结合部位为相当于与起始密码子共同形成翻译起始控制区域的Shine-Dalgarno(SD) 序列(Proc.Nalt.Acad.Sci.USA74,5463(1974))的部位。

另外，本发明中，所谓基因的上游或下游并非是指自复制起点起的位置，上游表 示与作为对象而捕捉的基因或区域5'侧连接的区域，另一方面，下游表示与作为对象 而捕捉的基因或区域3'侧连接的区域。

(3)本发明的PPR(苯丙酮酸还原酶)的获取方法

(i)本发明的PPR可通过威克酵母属(Wickerhamia)酵母或其变异株、或导入有对 上述PPR进行编码的基因或其片段的转化体(优选为微生物)来生产、获取。

上述威克酵母属酵母为子囊菌酵母，且只要具有对上述酶PPR进行编码的基因， 则并无特别限定，优选具有由苯丙酮酸生产D-3-苯基乳酸的功能和/或由D-葡萄糖经 苯丙酮酸生产光学活性苯基乳酸(D-3-苯基乳酸)的功能。

作为该酵母，例如可列举荧光威克酵母(Wicherhamia fluorescens)、及具有与其相 同的菌学性质及生理学性质的菌。

进而，可列举荧光威克酵母TK1(FERM AP-22048)菌株(以下也称为“酵母菌TK1”) 及与其同等的菌、及其变异株。此处，所谓变异株，可通过对野生株酵母菌TK1株 进行紫外线、电离辐射、亚硝酸、亚硝基胍、甲磺酸乙酯等处理等公知的方法来获得。 需要说明的是，变异株也包含使源自野生株的变异株进一步变异而得到的菌株。

以下，列出上述荧光威克酵母TK1(FERM AP-22048)菌株的菌学性质及生理学性 质。

(a)26S rDNA-Dl/D2碱基序列

编号9所示的碱基序列。

(b)形态学特征

形状：柠檬形、卵形、长卵形

增殖形式：增殖为通过两极出芽，出芽部位增宽而形成伪菌丝。

胞子形成：于子囊中形成运动帽形的子囊胞子。

(c)生理生物化学性状

糖发酵性：D-葡萄糖(+)、蔗糖(+)、D-半乳糖(W)、麦芽糖(-)。

碳源同化性：D-葡萄糖(+)、蔗糖(+)、D-半乳糖(+)、麦芽糖(-)、肌醇(-)。

氮源同化性：硝酸盐(-)。

需要说明的是，上述酵母菌TK1为于2007年11月选取日本茨城县筑波市内的 环境中的40种土壤和水，适当稀释后涂布于YPD琼脂培养基(参照下述实施例1)中。 于28℃培养2～4天后，将出现的菌落适当稀释，其后接种于新的YPD琼脂培养基 中，反复进行上述操作而进行纯化分离。

进而，将分离的菌株1接种环接种于添加有D-葡萄糖的MM液体培养基(参照 表1)中，于28℃培养2至4天。利用公知的方法获取各菌株的培养上清液，并利用 公知的测定法(例如，ODS液体色谱分析、气体色谱分析等)测定该培养上清液中的光 学活性苯基乳酸，将光学活性苯基乳酸的生产量良好的挑选出来，获得自土壤中采集 到的本菌株TK1。

进而，根据本菌株的菌学性质及生理学性质，推测其属于荧光威克酵母，并将本 菌株命名为W.fluorescens TK1株(荧光威克酵母TK1株)。该荧光威克酵母TK1株由 于上述情况而作为新型微生物于2010年12月13日在〒305-8566茨城县筑波市东 1-1-1筑波中心中央第6独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(IPOD) 中保藏为Wickerhamia fluorescens TK1(FERM AP-22048)。

由酵母菌TK1菌株生产本发明的PPR时，只要接种于通常的酵母培养用培养基 中并于适当温度下进行培养即可。可以利用常规方法自培养液生成本发明的PPR。具 体而言，可对培养液进行离心分离，去除菌体后，使用公知的酶分离纯化法自无细胞 提取液中浓缩或回收。作为分离纯化法，例如可列举凝胶过滤层析或超滤膜等过滤法、 以及基于添加硫酸铵的酶沉淀法等。

本发明的PPR可如上述那样由自然界中获得，也可自上述微生物(优选为子囊酵 母菌)的染色体DNA中克隆其基因，大量地生产、回收该PPR。

作为ppr基因的克隆方法，例如可采用将该基因导入宿主中，从而使其生产本发 明的PPR的方法，所述宿主能够通过使该基因连结于能使该基因稳定地扩增的DNA 载体上的方法或将其导入到可维持于该基因上的染色体DNA上的方法等而对编码本 发明的PPR的DNA稳定地扩增，进而能稳定且高效地表达该基因。

需要说明的是，本发明的ppr基因可利用公知的方法(例如，参照“Sambrook,J.， Fritch,E.F.，and Maniatis,T.(1989)in Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Vol.2, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY”)来获取。作为一例，自 PPR产生菌株中提取基因组DNA，利用适当的限制酶切断后，使用噬菌体载体制作 由PPR产生菌株的基因组DNA构成的基因库。或者，自PPR产生菌株中提取全RNA， 利用以Oligo dT作为引物的逆转录酶反应制备与mRNA对应的cDNA后，使用噬菌 体载体制作由PPR产生菌株的cDNA构成的基因库。

对于如上所述的N末端氨基酸序列及内部氨基酸序列，均合成适当的引物，使 用该引物，以来自PPR产生菌株的基因组DNA或cDNA作为模板，进行聚合酶链反 应(PCR)，将ppr基因的DNA片段扩增。使用该DNA片段作为探针，进行基因组基 因库或cDNA基因库的筛选。以此类方式，可将ppr基因的全区域或表达所必需的区 域分离出来。确定这些DNA片段的碱基序列后，通过PCR等方法于翻译起始密码子 的上游及翻译终止密码子的下游导入适合的限制酶切断部位，从而可获得含有仅由本 发明的ppr基因构成的多肽的基因片段。

[重组载体及其制作方法]

另外，根据本发明，可使用含有对PPR进行编码的多核苷酸或ppr基因的重组载 体。由此可获得转化体，并通过该转化体的培养等而以基因工程学方法制造PPR。

本发明的重组载体的构筑顺序及方法可使用基因工程领域中惯用的顺序和方法 (Sambrook，J.，Fritch,E.F.，and Maniatis,T.(1989)in Molecular Cloning:A Laboratory  Manual,Vol.2，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)。

作为可用于本发明中的载体，可列举：组入到宿主染色体DNA中的载体，或使 具有可自我复制的自主复制序列的载体以质粒状态存在于宿主细胞内。作为该质粒载 体，例如以大肠杆菌为宿主的情况下，可列举pUC18、pBR322(TAKARA BIO)等， 使用棒状杆菌的情况下，可列举pPK4等。需要说明的是，存在于宿主细胞内的基因 的拷贝数可为1个或2个以上。

关于本发明的重组载体，例如，分别可动地在对PPR进行编码的多核苷酸序列 的上游连结启动子(控制区域)，并于下游链接终止子，有时可以通过可动地连结标记 基因和/或其他控制序列来制作。

启动子或终止子向本发明的基因的连结及表达单元向载体的插入可利用公知的 方法(Sambrook,J.,Fritch,E.F.，and Maniatis,T.(1989)in Molecular Cloning:A  Laboratory Manual,Vol.2,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY) 来进行。

此处，对本发明中所使用的启动子及终止子并无特别限定，例如可列举：3-磷甘 油酸激酶、戊二醛-3-磷酸脱氢酶等糖酵解系酶基因的控制序列；色氨酸合成酶等氨 基酸合成系酶基因的控制序列；淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等水解酶基因的 控制序列；硝酸还原酶、乳清苷-5'-磷酸脱水酶、醇脱水酶等氧化还原酶基因的控制 序列等。需要说明的是，各控制序列是指于各控制区域中可发挥所需功能的多核苷酸。

另外，还可使本发明的基因与对其他蛋白质的翻译区域进行编码的外来基因连结 而表达为融合蛋白质。

另外，关于标记基因向重组载体的导入，例如可通过如下方式进行：利用PCR 法向控制序列中导入适当的限制酶切断部位，将其插入质粒载体后，连结耐药性基因 和/或营养缺陷型互补基因等选择标记基因。

选择标记可根据转化体的选择方法而适当选择，例如可使用编码耐药性的基因或 弥补营养缺陷型的基因。

作为该耐药性基因，可列举针对越霉素、苯菌灵(Benomyl)、寡霉素、潮霉素、 G418、博莱霉素、草铵膦、氨苄青霉素、卡那霉素等药物的基因。

另外，作为该弥补营养缺陷型的基因，可列举argB基因、pyr4基因、trpC基因、 TRP1基因、niaD基因、LEU2基因、URA3基因等。

[导入有本发明的重组载体的转化体]

根据本发明，可使用以上述方式获得的重组载体使宿主(优选为微生物)转化而获 得转化体。

对所使用的宿主没有特别限定，可以是可用作基因重组的宿主，优选为微生物。 作为可使用的宿主，例如可列举任意的细菌类或真菌类等微生物，其中优选使用大肠 杆菌、棒状杆菌、乳酸菌、放线菌、酵母、丝状真菌，具体而言适合使用属于大肠杆 菌(Escherichia)属、假单孢菌(Pseudomonas)属、黄杆菌(Flavobacterium)属、芽孢杆菌 (Bacillus)属、沙雷菌(Serratia)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、短杆菌(Brevibacterium) 属、土壤杆菌(Agrobacterium)属、乙酸杆菌(Acetobacter)属、葡萄杆菌(Gluconobacter) 属、乳酸杆菌(Lactobacillus)属、链球菌(Streptococcus)属或链霉菌(Streptomyces)属的 微生物及这些的变异株等。从重组较容易的方面而言，更优选为大肠杆菌或其变异株。

此时，这些微生物优选为以容易生产光学活性苯基乳或4-羟基苯基乳酸的方式实 施基因的置换、添加、缺失、灭活等变异的重组微生物，作为该重组微生物，优选苯 丙氨酸产生菌(苯丙氨酸生产性重组微生物)及酪氨酸产生菌(酪氨酸生产性重组微生 物)。

作为使如上所述的基因产生变异的方法，例如可列举：重组PCR法[PCR  Technology,Stockton press(1989)]、定点突变法[Kramer，W.and Frits,H.，J.Methods in  Enzymology,154,350(1987)]、使用通过SOE(splicing by overlap extension，重迭延伸拼 接)-PCR法[Gene，77，61,(1987)]所制备的DNA片段的双重交叉法、进行化学药物 处理(N-甲基-N'-亚硝基胍、亚硝酸等)的方法、化学合成目标基因的方法等。

另外，苯丙氨酸生产菌只要为使用公知技术按照可大量生产L-苯丙氨酸(优选为 以D-葡萄糖作为底物而大量生产L-苯丙氨酸)的方式使基因变异而得到的微生物即 可。作为该苯丙氨酸生产性重组微生物，可列举：通过含有对解除反馈抑制的3-脱氧 -D-阿拉伯庚糖酸-7-磷酸合成酶及预苯酸脱氢酶进行编码的DNA片段的重组载体而 转化的缺失tryR基因及tyrA基因的大肠杆菌属微生物等。

作为更具体的微生物，例如可列举：ATCC31882株、ATCC3188株3、ATCC31884 株(美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection)分售)，或AJ12740株 (FERM P-12999)、AJ12741株(FERM P-13000)(日本特开1993-344881号公报)等苯丙 氨酸生产性重组大肠杆菌等；作为其他苯丙氨酸生产性重组微生物，还可列举谷氨酸 棒状杆菌(Corynebacteirum glutamicum)等。

另外，酪氨酸生产菌优选为使用公知技术按照可大量生产L-酪氨酸(优选为以D- 葡萄糖作为底物而大量生产L-酪氨酸)的方式使基因变异得到的微生物。作为该酪氨 酸生产性重组微生物，可列举：利用公知的方法于苯丙氨酸生产菌(例如，大肠杆菌 ATCC31882(自ATCC获得))中导入tyrA基因(序列编号24：YP_002927556)而获得的 重组大肠杆菌；具有L-酪氨酸生产能力，且保持解除了L-反馈抑制的变异型预苯酸 脱氢酶的大肠杆菌属微生物等(例如，参照日本特开2006-311833号公报及日本特开 2007-325592号公报等)。

本发明的转化体(微生物)可通过将以上述方式制作的基因表达用重组载体依据 常规方法导入上述宿主中而获得。

作为该导入法，例如可列举：电穿孔法、聚乙二醇法、土壤杆菌法、感受态细胞 法、乙酸锂法及氯化钙法等。根据使用的宿主细胞适当选择即可。

原本对利用已知的苯丙酮酸还原酶生成的苯基乳酸的光学异构的认识就极少。另 外，其中报告有生成的苯基乳酸为消旋体。根据这种状况，可认为：工业上难以高浓 度地获得光学活性苯基乳酸，即难以获得经高纯度化的光学活性苯基乳酸。

这种状况下，本发明的PPR可非常高纯度地生成光学活性苯基乳酸，且对映体 彼此间生理活性不同的可能性也是极低的或几乎是不存在的。并且，由于是不可逆的 反应，故而还可高浓度地蓄积光学活性苯基乳酸，因此从回收效率方面而言也是较为 有利的。进而，本发明的PPR对苯丙酮酸具有较高的亲和性，并且除此以外可以以 4-羟基苯丙酮酸、乙醛酸、羟基丙酮酸等广泛的物质作为底物。

另外，由于本发明的PPR的k_cat/K_m值高达已知的苯丙酮酸还原酶的k_cat/K_m值的 数十倍，所以本发明的PPR还可大量生成光学活性苯基乳酸。

进而，本发明的PPR可利用使用了对其进行编码的基因的转化体大量生产该酶， 故而还可进一步使用所获得的PPR于工业上大量生产光学活性苯基乳酸。

<2.光学活性3-苯基乳酸的制造方法>

关于本发明的光学活性3-苯基乳酸的制造方法，只要至少具有可由苯丙酮酸生成 D-3-苯基乳酸的制造步骤(酶反应体系：参照上述路线1)即可。

进而，具有由D-葡萄糖或L-苯丙氨酸等原料生成苯丙酮酸的制造步骤时因为制 造成本或容易获得而是优选的。

作为由D-葡萄糖生成苯丙酮酸的制造步骤，对其并无特别限定，可列举有机合 成法或发酵法(生物合成反应)等，例如可列举莽草酸途径(Shikimate pathway)。

另外，作为由D-葡萄糖生成L-苯丙氨酸的制造步骤，对其没有特别限定，例如 可列举：日本特开平5-344811号公报或美国专利4681852号公报等公知的方法。另 外，对于由L-苯丙氨酸生成苯丙酮酸的制造步骤，可举出使用氨基转移酶的酶反应 体系。

此时，优选使本发明的光学活性3-苯基乳酸制造方法中包含可由D-葡萄糖或L- 苯丙氨酸等原料生产苯丙酮酸的制造步骤(例如利用酶或微生物等的反应体系)。

即，优选使用本发明的PPR和/或本发明的微生物由基质生产光学活性3-苯基乳 酸并回收学活性3-苯基乳酸。

此时，只要使用的物质至少含有本发明的PPR的酶即可，例如可使用培养了本 发明的微生物的培养液或其后去除微生物的培养液、微生物裂解液或除去了裂解物的 无细胞提取液等。这些之中还可含有用于莽草酸途径的反应的一系列酶组(具体而言， 7-磷-2-脱氢-3-脱氧阿拉伯庚糖酸醛缩酶、3-脱氢奎尼酸合成酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、 莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶、3-磷莽草酸1-羧基乙烯基转移酶(5-烯醇式丙酮酰莽草酸 -3-磷酸合成酶)、分支酸合成酶、分支酸歧化酶等)、或苯丙氨酸合成系酶组(具体而 言，预苯酸脱氢酶、酪氨酸氨基转移酶等)等。

另外，作为辅酶，优选使用NADPH和/或NADH，其中，NADPH由于光学活性 苯基乳酸的产率高而优选。

本发明对光学活性3-苯基乳酸制造方法的反应形式并无特别限定，可以以分批式 进行，还可以以连续流通式进行。

另外，本发明的PPR或本发明的微生物还可被固定化。该固定化的方法只要为 公知的方法则对其并无特别限定，例如可举出：通过物理性吸附、离子键、共价键而 使微生物、酶固定在水不溶性的载体上的载体结合法；以戊二醛等具有二价官能基的 试剂使其交联固定化的交联法；于具有网状结构的凝胶或半透性膜中封入微生物、酶 的包埋法等。

另外，反应所使用的溶剂可为极性或非极性溶剂的任意一种，但优选为水和/或 水溶性溶剂，特别优选为90～100质量％的水。此处，所谓水溶性有机溶剂，优选容 易使具有苯环的化合物溶解的水性有机溶剂，例如可列举出直链或支链等的醇类或酮 等。作为该低级醇类(优选为碳数1～5)，例如可列举：甲醇、乙醇、丙醇等一元醇类， 1,3-丁二醇等二元或多元醇类，还可将这些适当组合。

(1)通过本发明的酶PPR制造光学活性苯基乳酸的方法

可使用本发明的PPR由酶底物生产光学活性3-苯基乳酸并将其回收。需要说明 的是，还可如上所述那样通过并用PPR以外的酶来连续地获得光学活性3-苯基乳酸。

此处，采用苯丙酮酸作为酶底物是由于光学活性苯基乳酸的产率较高，故而是优 选的。

另外，适合的反应温度优选设为5～50℃，更优选设为10～40℃，进而优选设为 20～40℃。

另外，适合的反应时间(1轮)优选设为12小时～1周，更优选设为2～4天。

另外，适合的反应pH值优选设为5～8，更优选设为6～7。此时的pH值调整可 利用磷酸缓冲液等公知的pH值调整剂来进行。

(2)通过具有对本发明的PPR进行编码的基因的微生物制造光学活性3-苯基乳酸 的方法

本发明的光学活性苯基乳酸的制造方法优选使用包含对由如下(a)、(b)或(c)的蛋 白质构成的苯丙酮酸还原酶进行编码的基因的微生物进行培养，由微生物底物生成光 学活性苯基乳酸并将其回收。

(a)由序列编号5所记载的氨基酸序列构成的蛋白质，

(b)由序列编号5所记载的氨基酸序列中置换、缺失、添加有1个或多个氨基酸 的氨基酸列构成的蛋白质，其具有苯丙酮酸还原活性，且对于苯丙酮酸具有较高的亲 和性，

(c)由与序列编号5所示的氨基酸序列具有60%以上的同源性的氨基酸序列构成 的蛋白质，其具有苯丙酮酸还原活性，对于苯丙酮酸具有较高的亲和性。

此处，该微生物是指上述野生株(TK1菌株)及其变异株或上述转化体等，可为好 氧、厌氧的任意类型。

此时，作为微生物底物，优选选自D-葡萄糖、L-苯丙氨酸、苯丙酮酸等中的1 种以上。

另外，将D-葡萄糖作为微生物底物的情况下，由于可廉价地获得，且可大量生 产光学活性苯基乳酸，因此是优选的，并且发现可由单纯的糖的葡萄糖大量生产芳香 族化合物且大量生产光学活性的3-D-苯基乳酸的ppr基因，其于产业上极为有益。这 种情况下，优选将对本发明的PPR进行编码的基因导入L-苯丙氨酸生产性微生物中 所获得的重组微生物。

需要说明的是，利用微生物制造光学活性苯基乳酸的情况下，除上述含有对苯丙 酮酸还原酶进行编码的基因的微生物以外，为了生产上述微生物底物，还可利用具有 对用于莽草酸途径反应的一系列酶组进行编码的基因的微生物、或具有对苯丙氨酸合 成系酶组进行编码的基因的微生物等生产上述微生物底物的微生物。

例如可列举：使用生产上述微生物底物的微生物进行预培养后，使用本发明的微 生物进行正式培养的方法；同时使用这些微生物进行培养的方法；等等。

作为微生物培养中所使用的培养基，优选在各微生物的生长发育所使用的营养培 养基中至少含有上述微生物底物。此时，培养基中上述微生物底物设为优选0.01～ 20%(质量/容量)、更优选0.1～3%(质量/容量)、进而优选1～2%(质量/容量)是适宜的。

作为上述营养培养基，例如微生物为酵母的情况下，可列举如下的MM培养基： 培养基1L中含有D-葡萄糖1～30g、除葡萄糖以外的微生物底物0～5g、NaNO₃5～ 7g、KCl0.4～0.6g、MgSO₄·7H₂O0.4～7g、KH₂PO₄1～2g、汉氏微量元素(Hutner's  Trace elements)1～3mL、蒸馏水。汉氏微量元素如下述实施例所述。另外，还可适当 加入酵母浸膏0～3%、聚蛋白胨0～2%。

另外，例如微生物为大肠杆菌的情况下，可列举如下的M9培养基：培养基1L 中含有D-葡萄糖1～30g、葡萄糖以外的微生物底物0～5g、Na₂PO₄5～7g、KH₂PO₄2～4g、NaCl9～11g、NH₄Cl5～7g、MgSO₄·7H₂O0.4～7g、CaCl₂·H₂O0.02～0.04g、 盐酸硫胺0.04～0.05g、胰蛋白酶0.2～0.4g、色氨酸0.2～0.4g、汉氏微量元素1～3 mL、蒸馏水。

另外，大肠杆菌的情况下，可列举如下的苯基乳酸生产培养基：培养基1L中含 有D-葡萄糖1～30g、葡萄糖以外的微生物底物0～5g、Na₂HPO₄11～13g、KH₂PO₄5～7g、NaCl0.4～0.6g、NH₄Cl0.9～1.1g、MgSO₄·7H₂O0.2～0.4g、CaCl₂·H₂O0.01～ 0.02g、盐酸硫胺0.01～0.02g、胰蛋白胨9～11g、5.00g/L的酵母浸膏4～6g、微量 元素21～3mL、蒸馏水。

需要说明的是，汉氏微量元素及微量元素2如下述实施例所述(参照表2及表12)。

进而，优选添加胰蛋白酶9～11g、酵母浸膏4～5g。

培养条件可根据使用的微生物而适当设定。

培养温度优选设为5～50℃、更优选设为10～40℃、进而优选设为20～40℃时， 微生物生长发育良好并且不使底物及生成物析出，因此是优选的。

另外，培养时间(1轮)设置为优选0.5天～2周左右、更优选1周左右、进而优选 3～5天左右是适宜的。

另外，合适的培养pH值优选设为4～9，更优选的是，酵母的情况下设为6～7， 大肠杆菌的情况下设为6～8。培养pH值的调整只要利用适当的pH值调整剂进行控 制以使其位于特定范围内即可。

另外，搅拌以优选100～1000rpm、更优选400～600rpm进行是适宜的。

另外，使用空气进行透气培养的情况下，合适的是优选设为0.01～1L/min，更 优选设为0.1～0.3L/min。

进而，关于上述培养底物于培养期间内在培养基中的浓度，从生产效率方面而言， 优选以成为特定浓度内的方式进行调整，例如，可以连续地或不连续地添加500g/L 的D-葡萄糖溶液，优选以0.1～5g/L/h、更优选以1～2g/L/h添加。

作为3-D-苯基乳酸的回收法，对其并无特别限定，使用公知的分离纯化方法即 可。作为菌体的去除方法，可举出离心分离或过滤等公知的方法。另外，作为3-D- 苯基乳酸的分离、纯化方法，可列举出晶析、超滤、离子交换、活性碳处理、层析分 离等公知的方法。

作为层析分离，例如可列举出使用ODS柱层析的方法等。另外，作为晶析，可 列举出有机溶剂的提取及重结晶的方法等。作为优选的一例，优选利用甲醇及己烷 (=2：1～1：2)的混合溶剂：水=2：1～1：2的溶液进行提取。

<3.光学活性4-羟基苯基乳酸的制造方法>

本发明的光学活性4-羟基苯基乳酸(D-4-羟基苯基乳酸)的制造方法只要至少具有 可由4-羟基苯丙酮酸生成光学活性4-羟基苯基乳酸的制造步骤(酶反应体系：参照上 述路线2)即可。

底物4-羟基苯丙酮酸为苯丙氨酸及酪氨酸的代谢中间体之一，故而只要进行利用 这些代谢体系的制造步骤即可。

进而，具有由D-葡萄糖或L-酪氨酸等原料生成光学活性4-羟基苯基乳酸的制造 步骤时，从制造成本或容易获得的方面出发其是优选的。

作为由D-葡萄糖生成L-酪氨酸的制造步骤，对其并无特别限定，例如可列举日 本特开2006-311833号公报等公知的方法。另外，关于由L-苯丙氨酸生成酪氨酸、继 而生成4-羟基苯丙酮酸的制造步骤，可列举出使用苯丙氨酸羟化酶或酪氨酸氨基转移 酶等的酶反应体系。作为由D-葡萄糖生成4-羟基苯丙酮酸的制造步骤，对其并无特 别限定，可列举出有机合成法或发酵法(生物合成反应)等，例如可列举出莽草酸途径 (Shikimate pathway)。

此时，优选使上述光学活性4-羟基苯基乳酸制造法中包括可由D-葡萄糖或L-酪 氨酸等原料生成4-羟基苯丙酮酸的制造步骤(例如通过酶或微生物等的发酵法的反应 体系)。

即，优选使用上述生物催化剂(优选为酶和/或微生物)，由底物生产光学活性4- 羟基苯基乳酸，其后回收光学活性4-羟基苯基乳酸(优选为D-4-羟基苯基乳酸)。

此时，只要使用至少含有上述酶的物质即可，例如可使用培养了上述微生物的培 养液或其后去除微生物的培养液、微生物裂解液或除去了裂解物的无细胞提取液等。 这些之中，还可含有用于莽草酸途径反应的一系列酶组(具体而言，7-磷-2-脱氢-3-脱 氧阿拉伯庚糖酸醛缩酶、3-脱氢奎尼酸合成酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、 莽草酸激酶、3-磷莽草酸1-羧基乙烯基转移酶(5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶)、 分支酸合成酶、分支酸歧化酶等)、苯丙氨酸合成为酶组(具体而言，预苯酸脱氢酶、 酪氨酸氨基转移酶等)、苯丙氨酸羟化酶等。

另外，作为辅酶，优选使用NADPH和/或NADH，其中，NADPH由于光学活性 4-羟基苯基乳酸的产率高而优选。

本发明的光学活性4-羟基苯基乳酸制造法的反应形式并无特别限定，可以以分批 式进行，还可以以连续流通式进行。

另外，上述酶或上述微生物还可被固定化。该固定化的方法只要为公知的方法则 对其并无特别限定，例如可列举出：通过物理性吸附、离子键结、共价键而使微生物、 酶固定在水不溶性的载体上的载体结合法；以戊二醛等具有二价官能基的试剂使其交 联固定化的交联法；于具有网状结构的凝胶或半透性膜中封入微生物、酶的包埋法等。

另外，反应所使用的溶剂可为极性或非极性溶剂的任意一种，但优选为水和/或 水溶性溶剂，更优选为90～100质量％的水。此处，所谓水溶性有机溶剂，优选容易 使具有苯环的化合物溶解的水性有机溶剂，例如可列举出直链或支链的低级醇类或酮 等。作为该低级醇类，例如可列举出甲醇、乙醇、丙醇等一元醇类(优选为碳数为1～ 3)，1,3-丁二醇等二元或多元醇类，并且这些醇类可适当组合。

(1)通过本发明的酶PPR制造光学活性4-羟基苯基乳酸的制造方法

可使用本发明的PPR由酶底物生产光学活性4-羟基苯基乳酸并将其回收。需要 说明的是，还可如上所述那样通过并用本发明的PPR以外的酶来连续地获得光学活 性4-羟基苯基乳酸。

此处，采用4-羟基苯丙酮酸作为酶底物是由于光学活性4-羟基苯基乳酸的产率 较高，故而是优选的。

另外，适合的反应温度优选设为5～50℃，更优选设为10～40℃，进而优选设为 20～40℃。

另外，适合的反应时间(1轮)优选设为12小时～1周，更优选设为2～4天。

另外，优选的反应pH值优选设为5～8，更优选设为6～7。此时的pH值调整可 利用磷酸缓冲液等公知的pH值调整剂来进行。

(2)通过具有对本发明的PPR进行编码的基因的微生物制造光学活性4-羟基苯基 乳酸的方法

本发明的光学活性4-羟基苯基乳酸的制造方法优选使用含有对本发明的PPR进 行编码的基因的微生物进行培养，由微生物底物生成光学活性4-羟基苯基乳酸并将其 回收。

此处，该微生物是指上述野生株及其变异株或上述转化体等，可为好氧、厌氧的 任意类型。例如可列举出：含有对4-羟基苯丙酮酸还原酶进行编码的基因的菌株、含 有对PPR酶进行编码的基因的菌株、及ATCC菌株等。

此时，作为微生物底物，优选选自D-葡萄糖、L-酪氨酸、4-羟基苯丙酮酸中的1 种以上。另外，使用本发明的酶时，还可组合其他酶来生产光学活性4-羟基苯基乳酸。

另外，将D-葡萄糖作为微生物底物的情况下，由于可廉价地获得，且可大量生 产光学活性4-羟基苯基乳酸，因此是优选的，并且着眼于可由单纯的葡萄糖选择性地 大量生产高纯度的芳香族化合物、及D-4-羟基苯基乳酸的ppr基因并加以利用，这在 产业上极为有益。这种情况下，优选经由载体等将对上述酶进行编码的基因导入L- 酪氨酸生产菌所获得的重组微生物。

需要说明的是，利用微生物制造光学活性4-羟基苯基乳酸的情况下，除上述含有 对上述酶进行编码的基因的微生物以外，为了生产上述微生物底物，还可利用具有对 用于莽草酸途径反应的一系列酶组进行编码的基因的微生物，或具有对苯丙氨酸合成 系酶组进行编码的基因的微生物等生产上述微生物底物的微生物。

例如可列举出：使用生产上述微生物底物的微生物进行预培养后，使用本发明的 微生物进行正式培养的方法；同时使用这些微生物进行培养的方法；等等。

作为微生物培养所使用的培养基，优选在各微生物的生长发育所使用的营养培养 基中至少含有上述微生物底物。此时，培养基中上述微生物底物设为优选0.01～ 20%(质量/容量)、更优选0.1～3%(质量/容量)、进而优选1～2%(质量/容量)是适宜的。

关于上述营养培养基，例如微生物为酵母的情况下，可列举出如下的MM培养 基：培养基1L中含有D-葡萄糖1～30g、葡萄糖以外的微生物底物0～5g、NaNO₃5～ 7g、KCl0.4～0.6g、MgSO₄·7H₂O0.4～7g、KH₂PO₄1～2g、汉氏微量元素1～3mL、 蒸馏水。汉氏微量元素如下述实施例所述。另外，还可适当加入酵母浸膏0～3%、聚 蛋白胨0～2%。

另外，例如微生物为大肠杆菌的情况下，可列举如下的M9培养基：培养基1L 中含有D-葡萄糖1～30g、葡萄糖以外的微生物底物6～24g、Na₂HPO₄3～12g、 KH₂PO₄0.5～1g、NaCl0.5～2g、NH₄Cl0.05～0.05g、MgSO₄·7H₂O0.015～0.030g、 CaCl₂·H₂O0.015～0.050g、盐酸硫胺0.050～0.10g、色氨酸汉氏微量元素1～2mL。

另外，可列举如下羟基苯基乳酸生产培养基(苯基乳酸生产培养基)：培养基1L 中含有D-葡萄糖1～30g、葡萄糖以外的微生物底物6～24g、Na₂HPO₄3～12g、 KH₂PO₄0.5～1g、NaCl0.5～1.0g、NH₄Cl0.05～1g、MgSO₄·7H₂O0.015～0.03g、 CaCl₂·H₂O0.015～0.05g、盐酸硫胺1～10g、胰蛋白胨0～1.5g、5.00g/L的酵母浸膏 0.5～5g、微量元素21～3mL、蒸备水。

进而，优选添加胰蛋白胨5～20g(优选为9～11g)、酵母浸膏4～7g。

培养条件可根据使用的微生物而适当设定。

培养温度优选设为5～50℃、更优选设为10～40℃、进而优选设为20～40℃时， 微生物生长发育良好并且未使底物及生成物析出，因此是优选的。

另外，培养时间(1轮)设置为优选0.5天～2周左右、更优选1周左右、进而优选 3～5天左右是适宜的。

另外，合适的培养pH值优选设为4～9，更优选酵母的情况下设为6～7，大肠 杆菌的情况下设为6～8。培养pH值的调整可利用适当的pH值调整剂进行控制以使 其位于特定范围内。

另外，搅拌以优选100～1000rpm、更优选400～600rpm进行是适宜的。

另外，使用空气进行透气培养的情况下，设为优选0.01～1L/min、更优选0.1～ 0.3L/min是适宜的。

进而，从生产效率方面而言，上述培养底物于培养期间内在培养基中的浓度优选 以成为特定浓度内的方式进行调整，例如可以优选连续地或不连续地添加500g/L的 D-葡萄糖溶液，优选为0.1～5g/L/h、更优选为1～2g/L/h。

另外，pH值为6～8附近即可。

作为利用上述制造方法所获得的光学活性4-羟基苯基乳酸的回收法，对其并无特 别限定，使用公知的分离纯化方法即可。作为菌体的去除方法，可列举离心分离或过 滤等公知方法。另外，作为光学活性4-羟基苯基乳酸(D-4-羟基苯基酸)的分离、纯化 方法，可列举出晶析、超滤、离子交换、活性碳处理、层析分离等公知的方法。

作为层析分离，例如可列举出使用ODS柱层析的方法。

另外，作为晶析，可列举出有机溶剂的提取及重结晶的方法等。作为一例，优选 利用乙酸乙酯及己烷(=2：1～1：2)的混合溶剂：水=2：1～1：2的溶液进行提取。此 时，优选通过利用盐酸等酸使pH值为2～4等而进行酸化。

需要说明的是，若使用本发明的制造方法，则可获得高纯度的D-4-羟基苯基乳 酸而并非消旋体，还可简化分离纯化的步骤，因此本技术适于工业生产。并且，由于 可容易地获得对其适合的酶及微生物，故而从该方面出发，本技术也适于工业生产。

需要说明的是，作为高纯度，任意一方的比例较高的情况较有利，优选为85% 以上、更优选为90%以上、进而优选为95%以上、进而更优选为98%以上，这种情 况下是有利的。

实施例

以下对具体实施例进行说明，但本发明并不限于此。

<实施例1>D-3-苯基乳酸生产菌的筛选及其所生产的苯丙酮酸还原酶(PPR)的纯 化

(1)生产D-3-苯基乳酸的TK1菌株的获取

于数十处采集日本茨城县筑波市内环境中的土壤或水，适当稀释后涂布于YPD 琼脂培养基(2%的酵母浸膏、1%的聚蛋白胨、1%的D-葡萄糖/蒸馏水1L)上。于28 ℃培养2天至4天后，适当稀释出现的菌落，其后接种于新YPD琼脂培养基中，由 此进行纯化分离。进而将经分离的菌株1接种环接种于表1所示的基本培养基 (Minimum medium，以下也称为“MM”)液体培养基中，于好氧条件下且在28℃培 养2天至4天。

利用以下测定方法挑选光学活性苯基乳酸的产量良好的菌株，并将其中之一作为 TK1菌株。

[表1]

基本培养基(蒸馏水1L)

[表2]

*(汉氏)微量元素

[3-苯基乳酸的定性及定量方法]

(1)使用气相色谱质谱仪(GC/MS)的3-苯基乳酸的定性

使试样完全悬浮于1%的NaOH200μL、甲醇167μL、吡啶34μL中。向其中添 加氯甲酸甲酯20μl并剧烈搅拌，由此使试样甲基化。重复进行添加氯甲酸甲酯并搅 拌的操作后，添加氯仿400μL并进行搅拌。接着，添加50mM的碳酸氢钠并去除搅 拌后的水层。通过向所获得的氯仿层中添加0.1g硫酸钠而使氯仿层完全脱水，使用 GC/MS(GCMS-QP2010Plus、Shimadzu)对所获得的溶液中所含的有机酸进行测定。 以下列出该GC/MS分析的条件。

需要说明的是，分析培养液的情况下，使用1%的NaOH将培养液5mL的pH值 调整为9至10，使用离心蒸发器进行减压干燥，并将其用作试样。

分析器：GC/MS-QP2010Plus(Shimadzu)

柱：DB-5(0.32mm×30m)

柱温度：60℃(2min)-8℃/min-180℃(5min)-40℃/min-220℃(5min)

界面温度：230℃

离子源温度：250℃

载气：He

流量：30mL/min

(2)使用高速液体层析仪(HPLC)的3-苯基乳酸的定量

使用HPLC并利用以下的分析条件对试样中的3-苯基乳酸进行定量。

需要说明的是，对培养液进行分析的情况下，将通过过滤或离心分离等而去除菌 体的培养上清液用作试样。

分析器：HP-1100(Hewlett-Packard)

柱：TSKgel ODS-80(注册商标)(4.6×150mm、Tosoh、Tokyo,Japan)

柱温度：28℃

流速：1.0mL/min

流动相：20mm磷酸钾缓冲液(pH2.5)：甲醇(6：4、v/v)

3)使用HPLC的手性分析

使用HPLC并于以下分析条件下确定试样(酶反应液)中的3-苯基乳酸的光学异 构。需要说明的是，对培养液进行分析的情况下，将通过过滤或离心分离等自培养液 中去除菌体的培养上清液用作试样。

分析器：HP-1100(Hewlett-Packard)

柱：Nucleosil Chiral-1(Macherey-Nagel)

柱温度：60℃

流速：1.2mL/min

流动相：0.5mM的CuSO₄

(2)TK1菌株的鉴定

自预先使菌体生长发育的YPD琼脂培养基取出菌体1接种环并接种于分注于总 容量50mL的试管中的YPD培养基10mL中，于30℃以120rpm振荡培养2天。

自预培养液2.5mL中离心分离菌体来进行集菌，以生理食盐水清洗该沉淀。将 其接种于10mL的MM液体培养基的总容量50mL的试管中，并于30℃以120rpm 振荡培养2天。需要说明的是，于厌氧条件下培养时，以氮气置换试管的气体并塞入 丁基橡胶栓，将其于30℃以120rpm振荡培养6天。

[26S rDNA-Dl/D2碱基序列解析]

自提取至循环测序为止的操作依照DNA提取(物理性破坏及Marmur(1961))、 PCR(puReTaq Ready-To-Go PCR beads(Amersham Biosciences，NJ，USA))、循环测序 BigDye Terminator v3.1试剂盒(Applied Biosystems，CA，USA)、使用引物(NL1及 NL4(0'Donnell，1993))、序列(ABI PRISM3130x1基因分析系统(Applied Biosystems， CA，USA))、相同性检索及简易分子系统解析(软件Apollon2.0(TechnoSuruga  Laboratory)、数据库Apollon DB-FU3.0(TechnoSuruga Laboratory)、国际碱基序列数 据库(GeneBank/DDBJ/EMBL))的各实验计划。

[生理性状试验]

试验方法以Barnett et al.(2000)及Kurtzman and Fell(1998)为基准，除耐温性试验， 培养于25℃进行。进行表3所示的生理性状的试验。将其结果示于表3中。

[表3]

菌株TK1的培养特性与生化特性

A：同化；F：发酵；+：阳性；L：延迟阳性；W：弱阳性；S：慢阳性；-：阴 性

[简易形态观察]

使用光学显微镜(BX Olympus、东京)进行简易形态观察。将其结果示于图1中。 需要说明的是，比例条为5μm。

[TK1菌株的鉴定]

使用针对Apollon DB-FU的BLAST(Altschul，S.F.et al.,J.Mol.Biol.215:403～ 410.)的碱基序列的相同性检索的结果为：Strain TK1菌株的26S rDNA-Dl/D2碱基序 列与属于子囊菌酵母的一种的荧光威克酵母的标准株NRRL YB-4819显示100%的相 同性。于针对GenBank/DDBJ/EMBL等国际碱基序列数据库的相同性检索中，Strain  TK1菌株的26S rDNA-Dl/D2碱基序列相对于荧光威克酵母的NRR YB-4819菌株也 显示100%的高相同性。

另外，根据简易形态观察的结果确认：Strain TK1菌株的营养细胞为柠檬形、卵 形、长卵形，增殖为通过两极出芽而出芽部位增宽并形成伪菌丝(图1)。另外，培养 开始第19天时，可确认子囊中形成运动帽形的子囊胞子。这些的形态学观察与荧光 威克酵母的形态学特征一致(Kurtzman C.P.,Fell J.W.The Yeasts:A Taxonomic  Study,4th edition Elsevier,Amsterdam,Netherlands.)。

生理、生物化学性状试验的结果为：Strain TK1菌株显示糖发酵性，不使作为碳 源的肌醇同化，不使作为氮源的硝酸盐同化(表3)。这些与威克酵母属的特征一致 (Kurtzman C.P.,Fell J.W.The Yeasts:A Taxonomic Study,4th edition.Elsevier,Amsterdam, Netherlands.)

以上生理性状试验、简易形态观察的结果支持26S rDNA-Dl/D2碱基序列的结果。 因此，推测Strain TK1菌株属于荧光威克酵母，并将本菌株命名为W.fluorescens  TK1(荧光威克酵母TK1)。作为新型微生物，2010年12月13日于〒305-8566茨城县 筑波市东1-1-1筑波中心中央第6、独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏 中心(IPOD)保藏为Wickerhamia fluorescens TK1(FERM AP-22048)。

(3)荧光威克酵母TK1菌株所生产的3-苯基乳酸的光学异构

确定荧光威克酵母TK1菌株所生产的3-苯基乳酸的光学异构。将培养上清液供 于上述的手性分析(Nucleosil Chiral-1柱)中(图2)。其结果为，所生产的3-苯基乳酸显 示与D-3-苯基乳酸相同的保留时间，形成与L-3-苯基乳酸不同的波峰。由此，明确 了荧光威克酵母TK1菌株对映选择性地生产D-3-苯基乳酸(图2)。

需要说明的是，图2(a)为D-3-苯基乳酸及L-3-苯基乳酸的样品；(b)为本菌株的 MM培养基培养后的上清液；(c)为本菌株的GPAMM培养基培养后的上清液；(d)为 利用由本菌株所获得的酶处理苯丙酮酸的底物的结果。

(4)使用MM培养基(基本培养基)培养荧光威克酵母TK1菌株时的D-3-苯基乳酸 的生产性

使初始菌体浓度为0.2(O.D.600)并使用MM培养基于好氧条件下将荧光威克酵母 TK1菌株振荡培养(振荡三角瓶、100mL)5天，对培养上清液进行经时取样。其结果 为，菌体的增殖于培养开始24小时以后进入定常期。D-3-苯基乳酸的产量即便进入 定常期仍继续增长，培养开始第96小时时，于培养基中生产了0.1mM的D-3-苯基 乳酸(图3)。

需要说明的是，图3～5的“细胞密度”(Cell Density)表示菌体量，“PLA”表示 D-3-苯基乳酸的浓度，且“PPA”表示苯丙酮酸的浓度，“Phe”表示L-苯丙氨酸。

(5)苯丙氨酸及苯丙酮酸对于D-3-苯基乳酸的生产的影响

使初始菌体浓度为0.2(O.D.600)，分别使用于MM培养基中添加有苯丙酮酸的 GPAMM培养基(表4)、及于MM培养基中添加有L-苯丙氨酸的GPMM培养基(表5)， 于好氧条件下将荧光威克酵母TK1菌株分别振荡培养(振荡三角瓶、100mL)2天及3 天，并对培养液进行经时取样，测定本菌的D-3-苯基乳酸的产量(图4及5)。

[表4]

GPMM培养基

[表5]

GPMM培养基

其结果为，与不添加时相比，于培养基中添加L-苯丙氨酸时，荧光威克酵母TK1 菌株的菌体量为5.1倍，生产D-苯基乳酸57.5倍。另外，若添加苯丙酮酸，则菌体 量为1.5倍，生产D-3-苯基乳酸8.9倍。

于培养基中添加有5mM的L-苯丙氨酸的情况下，培养24小时后检测不出L- 苯丙氨酸，反而蓄积有同等水平(5.7mM)的D-3-苯基乳酸。由此，可认为通过本菌使 得L-苯丙氨酸转变为D-3-苯基乳酸。即，可认为本菌株具有生成光学活性苯基乳酸 的酶。

另外，可见到菌体随着L-苯丙氨酸的减少及D-3-苯基乳酸的生产而增殖。若对 使用添加有L-苯丙氨酸的GPMM培养基(图4)的培养、使用未添加L-苯丙氨酸的MM 培养基的培养(图3)、使用添加有苯丙酮酸的GPAMM培养基(图4)的培养中的菌体的 增殖量进行比较，则使用添加有L-苯丙氨酸的GPMM培养基的培养中菌体的增殖量 最多。

据认为这是由于自L-苯丙氨酸的氨基游离出的氨被用作了氮源，故而促进了本 菌的增殖。

(6)含有荧光威克酵母TK1菌株所生产的酶的无细胞提取液的制备

每1.0g重量的湿菌体添加氧化铝2.5g、以及蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)、 N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨氯甲基酮(TPCK)各0.2mM、含有10%的甘油及1mM的二硫 苏糖醇(DTT)的20mM磷酸缓冲液，使用研磨棒及研钵将菌体研碎。于裂解液中添加 与菌体等量的相同的缓冲液，以15000×g进行离心分离。将所获得的培养上清液作 为无细胞提取液。以上操作于冰中进行。

(7)自无细胞提取液中回收本酶PPR的条件的研究

于自荧光威克酵母TK1菌株的无细胞提取液中将作为催化苯丙酮酸向D-3-苯基 乳酸的还原的酶(苯丙酮酸还原酶)的本酶PPR纯化前，对本菌的正式培养的培养时间 及无细胞提取液中的PPR活性的关系进行研究。由使用GPMM培养基培养开始4、 12、48小时后的菌体制备无细胞提取液，结果培养时间为12小时的PPR活性与4 小时、48小时相比分别高1.8、3.4倍(图6)。

根据以上结果，将纯化所使用的菌体定为使用培养12小时的菌体。需要说明的 是，培养开始12小时后与进行3-苯基乳酸的生产的时间一致，故而提示了本酶PPR 与3-苯基乳酸的生产相关的可能性。

(8)本酶PPR的最适pH值的研究

将pH5.5～8的Tris-HCl缓冲液(pH7、7.5、8)、磷酸缓冲液(pH5.5、6、6.5、7) 的各pH值缓冲液用于反应液中，测定PPR活性，研究本酶PPR的反应的最适pH值。 于pH6.5下检测到了最高PPR活性(图7)。因此，本酶PPR的最适pH值为6.5，以 后的活性测定在pH值为6.5的条件下进行。

(9)来自荧光威克酵母TK1菌株的本酶PPR的制备

如上所述制备无细胞提取液，并以100,000×g将该无细胞提取液离心分离1小 时。

进而，如下所示，利用丁基Shepharose柱、2’5’-ADP-Sepharose柱、然后利用 MonoQ HR5/5柱的各种层析法进行分离纯化，由离心分离后的无细胞提取液获得本 酶PPR。

[丁基Shepharose柱]

于离心分离后的无细胞提取液中添加硫酸铵以使其为20%。将冲洗缓冲液(10% 的甘油、1mM的二硫苏糖醇(DTT)、20mM的磷酸缓冲液、20%的(NH₄)₂SO₄，pH7) 以柱容积的5倍量进行冲洗而进行柱的平衡化。于该柱中放置制备的试样并根据硫酸 铵的直线浓度梯度(20%～0%)进行洗脱，获得活性组分。

[2’5’-ADP-Sepharose柱]

将上述获得的活性组分相对于透析缓冲液(10%的甘油、1mM的DTT、20mM 的磷酸缓冲液，pH7)进行一晚的透析。将该试样供给至冲洗了5倍量的冲洗缓冲液 (10%的甘油、1mM的DTT、20mM的磷酸缓冲液，pH7)而平衡化的 2’5’-ADP-Sepharose柱。洗脱时利用洗脱缓冲液(10%的甘油、1mM的DTT、0.1～1 mM的NADP⁺、20mM的磷酸缓冲液，pH7)来进行，获得活性组分。

[MonoQ HR5/5柱]

将上述获得的活性组分供给至经平衡缓冲液(10%的甘油、1mM的DTT、20mM 的磷酸缓冲液，pH7)平衡化的MonoQ HR5/5柱(GE Healthcare)，并根据NaCl直线浓 度梯度(0%～15%)来进行洗脱。

[PPR活性的测定法]

PPR的活性测定中，使用50mM的磷酸缓冲液(pH6.5)、2mM的苯丙酮酸、0.1mM 的NADPH作为酶反应液，通过向其中添加试样(酶液或无细胞提取液等)来引发反应。 反应温度为25℃。活性通过如下方式定量：利用紫外可见分光计(Beckman-Coulter  DU-800)对随反应而生成的NADPH所具有的对340nm波长的吸收的减少进行测定。 NADPH对340nm的波长的吸收的摩尔吸光系数为6.2mM^-1·cm^-1。

[苯丙氨酸转氨酶(PAT)的活性测定]

PAT的活性测定中，使用50mM的磷酸缓冲液(pH6.5)、10mM的L-苯丙氨酸、 2.5mM的2-氧基戊二酸、12.5μM磷酸吡哆醛作为酶反应液，通过向其中添加试样(酶 液或无细胞提取液等)来引发反应。反应温度为设为37℃，反应时间为设为30分钟。 通过添加2N的NaOH800μL来终止反应。活性以如下方式定量：对随反应而生成的 苯丙酮酸所具有的对320nm波长的吸收的增加进行测定，从而进行定量。需要说明 的是，苯丙酮酸的摩尔吸光系数为17.5mM^-1·cm^-1(Whitaker RJ.,et al.J.Biol.Chem.(1982) 257,3550～3556)。

[PPR的分子量的定量]

PPR的分子量的测定中，使用12.5%的聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE和/或凝胶 过滤法来进行测定。

使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法时，依据Laemmli等人的方法来进行。

另外，使用凝胶过滤法时，将使用聚乙二醇20,000浓缩的纯化本酶PPR试样等 供给至预先经洗脱缓冲液(10%的甘油、1mM的DTT、20mM的磷酸缓冲液、0.15mM 的NaCl，pH7)平衡化的Superose610/300，并以柱容量的1倍的洗脱缓冲液进行洗脱。

作为标准蛋白质，使用牛血清白蛋白(M.W.67,000)、胰凝乳蛋白酶原 (M.W.25,000)、α-淀粉酶(M.W.45,000)、β-淀粉酶(M.W.200,000)。

由菌体30g所制备的无细胞提取液中的蛋白质总量为592.2mg，D-3-苯基乳酸 的生产的总活性为190.8μmol/mL。即，可确认苯丙酮酸还原酶存在于无细胞提取液 中。

将对其进行离心分离而获得的可溶性组分如上述那样依次供给至丁基 Sepharose(疏水柱)、2’5’-ADP-Sepharose(亲和柱)、Mono Q HR5/5(强阴离子交换柱) 中，结果可将本酶PPR的比活性浓缩至2260倍，且可以产率41%对本酶PPR进行 纯化(表6)。

将纯化的本酶PPR供给至SDS-PAGE，结果显示为单一条带，且其分子量为 40,000(图8)。根据凝胶过滤法估算经纯化的本酶PPR酶的分子量为80,000，由此可 知本酶PPR形成了同型二聚体(图8)。

[表6]

来自荧光威克酵母TK1的PPR的纯化概述

(10)由荧光威克酵母TK1菌株所生成的酶的各性质

[PPR的酶学解析]

通过上述HPLC的测定方法可确认到：本酶PPR以依存于NADPH的方式与苯 丙酮酸进行反应而生成D-3-苯基乳酸。

另外，还确认到了由2mM的苯丙酮酸与2mM的NADPH可生产2mM的3-苯 基乳酸，因此表明了对于该反应下述的化学计量是成立的(路线1)。

[化2]

将D-3-苯基乳酸、L-3-苯基乳酸、NAD+、NADP+的组合用作底物时，不发生酶 反应，因此表明了利用本酶PPR的反应为不可逆反应。

另外，本酶PPR将NADPH用作辅酶而对苯丙酮酸、4-羟基苯丙酮酸、乙醛酸及 羟基丙酮酸进行还原(路线1及路线2)。

此时，k_cat/K_m值为以苯丙酮酸作为底物时的最大值，该值为373s^-1mM^-1(表7)。

另外，以NADH作为辅酶时的k_cat/K_m值为330s^-1mM^-1，该值较低，为以NADPH 作为辅酶时(10143s^-1mM^-1)的1/3。因此表明了本酶可利用NADH及NADPH作为辅 酶，但对NADPH的特异性较高。

[表7]

PPR的动力学性质

^a：不可测定

[金属离子及抑制剂的影响]

将各金属离子及各抑制剂分别以最终浓度1mM添加于反应体系中，测定PPR 活性。发现由于金属离子Cu²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、WO^2-、Hg²⁺而使本酶PPR活性下降(表 8)，因此，表明了这些金属离子会抑制PPR活性。

[表8]

各种化合物及药剂对PPR活性的影响

a若无特别说明，则化合物最终浓度为1mM

b最终浓度为0.5%

[D-3-苯基乳酸生产菌及其生产的PPR的各性质]

检索D-3-苯基乳酸生产菌，结果子囊菌酵母荧光威克酵母TK1菌株于培养上清 液中生产了D-3-苯基乳酸0.1mM，故而可认为筛选到了新型D-3-苯基乳酸生产菌。 另外，将L-苯丙氨酸添加于培养基中并同样地进行培养时，D-3-苯基乳酸的产量为 5.7mM。据报告，报告有3-苯基乳酸的生产的白地丝霉菌通过使用TSBYE培养基并 使用发酵缸进行培养生产了3.6～6.0mM的3-苯基乳酸(非专利文献2)；乳酸菌通过 使用MRS培养基生产了0.57mM的3-苯基乳酸(L Biochem.2005138,741-74915)。另 外，在培养基中添加有作为3-苯基乳酸的前体的苯丙酮酸6mM时，乳酸杆菌 SK007(Lactobacillus.Sp.SK007)生产出5.2mM的3-苯基乳酸(Li，X.et al.,Biotechnol. Lett(2007)29，593～597)；在培养基中添加有50mM的苯丙氨酸的情况下，植物乳 酸杆菌TMW1.468(L.plantarum TMW1.468)、旧金山乳酸杆菌(L.sanfranciscensis) DSM20451生产出0.04～0.08mM的3-苯基乳酸(Vermeulen，N.et al.J.Agric.Food  Chem.(2006)54,3832～3839)。以上结果显示：荧光威克酵母TK1菌株具有使用发酵 缸等无需精密控制培养条件就能较高地生产出D-3-苯基乳酸的能力。

另外，荧光威克酵母TK1菌株对映选择性地生产D-3-苯基乳酸。对于化工产品、 医药品来说，有时如反应停所代表的对映体那样，其彼此间的生理活性不同。因此， 期待对映选择性地制造手性分子。因此可认为，本菌具有较高的对映选择性并生产 D-3-苯基乳酸的情况在考虑将本化合物用于医药品原料等的方面而言具有重大意义。

另外，关于纯化的本菌的PPR活性，以苯丙酮酸作为底物时的k_cat/K_m值为373 s^-1mM^-1。该值比迄今为止所报告的任一戊糖乳酸杆菌JCM1558(Lactobacillus pentosus  JCM1558)(非专利文献15)、Lactobacillu.plantarum ATCC8041的DLDH(Taguchi，H.; Ohta,T.J.Biol.Chem.(1999)266，12588-12594)、豆根瘤菌CFN42(Rhizobium etli CFN42) 的GRHPR(Fauvart,M.et al.Biochimica et Biophysica Acta1774(2007)1092～1098)的 分子活性都高(表9)。

另外，麦牙糖念珠菌L4(Candida maltosa L4)的D-4-羟基苯基乳酸脱氢酶是至今 为止唯一以来自经纯化的真菌的苯丙酮酸作为底物的酶，其与荧光威克酵母TK1菌 株的PPR同样地对于苯丙酮酸及4-羟基苯丙酮酸显示较高的亲和性。然而，D-4-羟 基苯基乳酸脱氢酶必需以Mn²⁺作为辅助因子，且分子量为250,000～280,000，与本菌 PPR的分子量相比，该分子量非常大。另外，本酶PPR对于苯丙酮酸的亲和性最高， 相对于此，D-4-羟基苯基乳酸脱氢酶对于4-羟基苯丙酮酸的亲和性较高，因此还可认 为二者为不同的酶。

[表9]

荧光威克酵母TK1及其他有机物对于苯丙酮酸的底物特征

非专利文献15

Taguchi,H.;Ohta,T.J.Biol.Chem.(1991)266，12588～12594

Fauvart,M.et al.Biochimica et Biophysica Acta1774(2007)1092～1098

<实施例2>ppr基因的克隆及于大肠杆菌中的表达

(1)使用菌株

使用3-苯基乳酸生产菌荧光威克酵母TK1菌株。

将大肠杆菌Origami B(DE3)用作PPR表达用宿主。构筑质粒时，使用大肠杆菌 JM109株。

(2)培养方法

自预先使菌体生长发育的YPD琼脂培养基取出菌体1接种环并接种于分注总容 量50mL的试管中的上述YPD培养基10mL中，于30℃以120rpm振荡培养2天。 通过离心分离使菌体自预培养液中集菌，以生理食盐水对该沉淀进行清洗。将其接种 于含有150mL的GPMM培养基的总容量500mL的振荡三角瓶中。将其于30℃以 120rpm且于好氧条件下振荡培养12小时。

(3)本酶PPR的N末端氨基酸序列解析

[印迹]

于A溶液(0.3M Tris、5%甲醇)中浸入2张滤纸，于B溶液(25mM Tris、5%甲醇) 中浸入1张滤纸，于C溶液(25mM Tris、40mM的6-氨基己酸、5%甲醇)中浸入3 张滤纸。将纯化的本酶PPR以SDS-PAGE进行电泳后，使凝胶与浸于各溶液中的滤 纸叠置，再使用转录装置(Horizeblot AE-6670P/N、ATTO)电转录于聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜(AE-6665、ATTO)上。

[蛋白质序列]

自经干燥的PVDF膜切出目标的条带，并供给至氨基酸序列分析装置(Applied  Biosystems Procise492cLC)。

(4)本酶PPR的内部氨基酸序列的确定

由凝胶将于SDS-PAGE中泳动过的纯化本酶PPR切下，并通过胰蛋白酶进行凝 胶内消化。将胰蛋白酶消化肽供给至基质辅助激光解吸/离子化飞行质谱仪(Matdx- Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of Flight/Mass Spectrometry， MALDI-TOF/MS)(AXIMA(注册商标)、AXIMA(注册商标)-QIT Shimazu)，并基于所 获得的片段信息确定氨基酸序列。

(5)cDNA的制备

使于GPMM培养基中培养的荧光威克酵母TK1菌株悬浮于裂解缓冲液(500mM 的NaCl、200mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM的EDTA、1%SDS)中，添加一半量的玻 璃珠及等量的苯酚-氯仿-异戊醇(25：24：1)(苯酚氯仿处理)。以漩涡搅拌器搅拌后进 行离心分离，回收上清液，进行DNase(脱氧核糖核酸酶)处理，并重复2次苯酚-氯仿 -异戊醇提取，再添加2.5倍量的乙醇及1/10倍量的3M乙酸钠(乙醇沉淀)。离心分离 后，使沉淀悬浮于RLC(附属于RNeasy(注册商标)Plant Mini Kit)450μL、2-巯基乙醇 4.5μL中。以后的步骤中依据RNeasy(注册商标)Plant Mini Kit的实验步骤。使用经制 备的RNA及PrimeScript(注册商标)Reverse Transcriptase(PrimeScript逆转录酶)合成 cDNA。

(6)全DNA的制备

使于YPD培养基中培养一夜的荧光威克酵母TK1菌株悬浮于裂解缓冲液(100 mM的NaCl、10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM的EDTA、2%TritonX-100)中，并添加 一半量的玻璃珠及等量的苯酚-氯仿-异戊醇(25：24：1)(苯酚氯仿处理)。以漩涡搅拌 器搅拌后进行离心分离，回收上清液，重复2次苯酚-氯仿-异戊醇提取，再添加2.5 倍量的乙醇及1/10倍量的3M乙酸钠(乙醇沉淀)。离心分离后将沉淀以70%乙醇清 洗。丢弃70%乙醇以抽气器使其干燥，使其悬浮于添加有RNase(核糖核酸酶)的适量 灭菌水中。

(7)克隆

[PCR法]

于50μL的PCR反应体系中，添加所获得的cDNA1μL作为模板、l0×KOD-Plus 缓冲液(TOYOBO)5μL、各2.5mM的dNTP4μL、引物 NP(5’-ATGAARAARCCNCAGGT-3’)(序列编号10)、Oligo  dT(5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3')(序列编号11)、KOD-Plus-DNA聚合酶(TOYOBO) lμL、25mM的MgSO42μL。对该反应体系进行35次的96℃30s、50℃30s、68℃3min 的处理后，使其于68℃进行扩增反应5min(一次PCR)。进而，添加PCR产物作为模 板1μL、10×Ex Taq缓冲液(TaKaRa)5μL、各2.5mM的dNTP4μL、引物NP(序列编 号10)、引物2427P(5'-GGYTCYTCYTCRAANACRTT-3’)(序列编号12)、Ex Taq聚合 酶(TaKaRa)0.5μL。进行35次的96℃15s、56℃20s、72℃1min的处理，使其于72℃ 进行扩增反应5min(二次PCR)。

[PPR基因的全长解析]

以制备的全RNA为基础，使用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of  cDNA Ends，RACE)5'RACE系统第2.0版(Invitrogen Co.,CA)合成PPR的5'-末端的 cDNA。以所获得的cDNA作为模板，使用试剂盒附带的接合器寡核苷酸及对编码PPR 的基因特异的引物(GSP1(5'-TGAAAATGCGTTAGTATGTGGAT-3')(序列编号13)、 GSP2(5'-TGCCTTTGCTGCTTTGAATGTAT-3')(序列编号14))进行巢式PCR。关于PCR 的反应条件，进行35次的96℃15s、56℃20s、72℃1min的处理，使其于72℃进行 扩增反应5min。通过琼脂糖电泳而回收以PCR所获得的200kp的DNA片段，并克 隆于pGEM(注册商标)-T easy(Promega，Madison，WI)中。确定所获得的质粒的插入 片段的DNA序列。

对于3'-末端，以通过cDNA末端快速扩增技术3’RACE系统(Invitrogen Co.,CA) 所合成的cDNA为模板，使用引物GSP(5'-AACTACGAGGTGCTGCC-3')(序列编号 15)、引物GSP nest(5’-GTCCTCCCCAGTTACCATATATAGC-3’)(序列编号16)以与上 述相同的方式进行PCR，从而确定所获得的270kb的片段的碱基序列。

[DNA序列解析]

DNA的序列解析中，使用全自动DNA测序仪(CEQ2000’Beckman Coulter)进行 解析。对于方法，依据实验步骤进行。

(8)实时PCR

对于荧光威克酵母TK1菌株，使用MM培养基、GPMM培养基、GPAMM培养 基于30℃培养8小时，由所获得的各培养基的菌体制备RNA。将其作为模板，并使 用oligo-dT19引物、逆转录酶M-MLV(TAKARA BIO，Inc.，Japan)进行逆转录反应。 以所获得的单链cDNA作为模板，使用iQ(注册商标)SYBR(注册商标)Green  Supermix(Bio-Rad Laboratories Inc.,CA)供于MiniOpticon(注册商标)第3.1版(Bio-Rad  Laboratories Inc.,CA)。将各菌体中pprA基因的表达量表示为其与18S核糖体核糖核 酸(ribosomal RNA)的表达量之比。

表达量的比率(pprA/18SrDNA)=2^{CT(pprA)-CT(18S ribosom)}

*C_T为扩增产物蓄积而获得的可检测出的荧光信号的周期数。

需要说明的是，使用的酶pprA(pprART F(5’-ATTTAGCCGCGATGAAAGAAC-3’) (序列编号17)、pprART R(5'-TCGGCAAAGGCACATCC-3')(序列编号18))及18S核糖 体的引物(18SRT F(5'-ACCAGGTCCAGACACAATAAGG-3')(序列编号19)、18SRT  R(5'-AAGCAGACAAATCACTCCACC-3')(序列编号20))为使用引物制作软件 primer3(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgi)设计的。

(9)使用大肠杆菌的重组PPR(rPPR)的表达、纯化

[转化体的制作]

使用由荧光威克酵母TK1菌株的RNA制备的单链cDNA及引物 Nde-PPR(5'-GGGTTTCATATGAAAAAGCCTCAG-3’)(序列编号21)、 Xho-PPR(5'-CCGCTCGAGAACTACAAGATT-3')(序列编号22)，通过PCR反应而扩增 pprA基因的cDNA片段。以Nde I、Xho I对其进行处理后，将其与预先以相同限制 酶对pCWori进行处理后的物质连结而构筑质粒(pCW-PPR)，将该质粒导入至大肠杆 菌ATCC31882(由ATCC获取)中(参照图9及图10)。

[表达的诱导]

将所获得的重组体于含有最终浓度100μg/L的氨苄青霉素钠的LB培养基(LA)10 mL中于37℃培养12小时。将其总量接种于150mL LA中。以120rpm于37℃培养 2小时后，添加最终浓度1mM的IPTG，并以50rpm于室温下培养8小时。

[rPPR的纯化]

收集培养的菌体，使其悬浮于缓冲液A(20mM磷酸钾(pH7.0)、10%甘油、0.1mM 的DTT)中，并进行超声波裂解。将裂解液以15,000rpm离心分离30分钟并回收上清 液(无细胞提取液)。预先使其吸附Ni²⁺后，将无细胞提取液供给至经含有300mM的 NaCl的缓冲液A(缓冲液C)平衡化的螯合Sepharose柱(Amersham)中。回收以含有 500mM咪唑的缓冲液C洗脱的组分，并对缓冲液A进行透析，用于后续的解析中。

(10)分子系统解析

[氨基酸序列的比对]

于美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information， NCBI)的数据库内，检索到与克隆的pprA基因的推测氨基酸序列具有相同性的序列。 此时使用的是BLAST。利用所获得的序列信息进行ClustalW的多重比对解析。

[系统树的制作]

系统树的制作中使用了MEGA4。系统树的制作所使用的氨基酸序列由NCBI获 得。系统树的制作通过邻接法进行，于分枝上显示出了Bootstrap反复推测值。

(11)本酶PPR的N末端氨基酸序列的确定

将纯化的本酶PPR(1μg)于PVDF膜上电印迹，分析本酶PPR的N末端的氨基酸 序列。其结果为，可确定由MKKPOVLILGRI构成的本酶PPR的12个残基的N末端 氨基酸序列(序列编号1)。

(12)本酶PPR的内部氨基酸序列的获取

将SDS-PAGE后的本酶PPR自凝胶中切出，并使用胰蛋白酶进行凝胶内消化。 对所获得的胰蛋白酶消化肽进行MALDI-TOF MS解析。自通过MALDI-TOF MS解 析所获得的肽波峰中选择m/z2000.00&m/z2427.27两种肽，使用MALDI-QIT-TOF  MS进行MS/MS解析(图11)。以所获得的质量片段波峰的信息为基础进行胰蛋白酶 消化肽的氨基酸序列的从头测序(de novo sequence)，从而，显示为m/z2000.00的肽 可获得由19个氨基酸残基构成的氨基酸序列NIQAIYGNWGGLASFGGFK(序列编号 2)，显示为m/z2427.27的肽可获得由22个氨基酸残基构成的氨基酸序列 VAFAALDVFEEEPFIHPGLIGR(序列编号3)(图12)。

(13)pprA基因的克隆

基于N末端氨基酸序列(序列编号1)及内部氨基酸序列m/z2427.27(序列编号3) 的信息，分别设计引物NP(序列编号10)、引物2427P(序列编号12)。以由荧光威克 酵母TK1菌株制备的cDNA作为模板，使用引物NP(序列编号10)、引物Oligo dT(序 列编号11)进行PCR。进而，以PCR产物作为模板，使用引物NP(序列编号10)、引 物2427P(序列编号12)进行PCR。其结果是，扩增了935bp的目标DNA片段(图13)。

以经扩增的DNA的碱基序列为基础设计引物，通过RACE法解析pprA基因的 两末端的碱基序列。其结果显示，pprA基因由对364个残基的氨基酸进行编码的1,095 bp的碱基对构成(图14：序列编号4及5)。该推测氨基酸序列中，可同时发现上述所 确定的PPR的N末端及内部氨基酸序列。另外，若对由基因组DNA扩增的序列及 由cDNA扩增的序列进行比较，由该结果可知，pprA基因中不存在内含子。

(14)pprA基因于染色体上的拷贝数

为了确认存在于荧光威克酵母TK1菌株的基因组上的pprA基因的拷贝数，进 行southern印迹解析(图15)。对于经限制酶(HindIII、EcoRI、PstI、BamHI)处理的荧 光威克酵母TK1菌株的全DNA，以含有pprA基因的序列的DNA片段作为探针进行 southern杂交。其结果为，使用任一经限制酶处理的全DNA的情况下，均只检测出 一条条带。由此表明了存在于基因组上的pprA基因仅有1个拷贝，纯化的本酶PPR 为pprA基因的表达结果。

(15)L-苯丙氨酸的本酶PPR的表达控制

分别使用GPMM培养基(含有D-葡萄糖及L-苯丙氨酸)、GPAMM培养基(含有 D-葡萄糖及苯丙酮酸)、MM培养基(含有D-葡萄糖)将荧光威克酵母TK1菌株于30 ℃分别培养10小时，并将所获得的菌体的无细胞提取液中的PPR活性依据上述[PPR 活性的测定法]进行测定。其结果为，使用添加有L-苯丙氨酸的GPMM培养基所获得 的菌体的无细胞提取液中的PPR活性为0.22μmol/min/mg，与使用MM培养基进行培 养时的活性相比为3.6倍。另外，与使用添加有苯丙酮酸的GPAMM培养基时相比高 3.0倍(图16)。将于相同条件下将荧光威克酵母TK1菌株培养8小时所获得的菌体的 pprA基因的转录量使用实时PCR进行测定。其结果为，使用添加有5mM苯丙氨酸 的GPMM培养基进行培养的菌体中的pprA基因的表达量与使用MM培养基的条件 相比增加了40倍，与使用GPAMM培养基进行培养的条件相比增加了18倍(图16)。 根据以上结果表明，pprA基因的表达受苯丙氨酸诱导。

(16)使用大肠杆菌的酶rPPR的表达、纯化

[酶rPPR的纯化]

于大肠杆菌Origami B株中导入在pET21a中组入了pprA基因的cDNA的质粒。 使在N末端插入有His的本酶PPR表达后，使用螯合Sepharose柱进行纯化(图17)。 其结果表明，由于40kDa中获得的是单一基因带，故而可使酶rPPR纯化。

[酶rPPR的酶学各性质]

纯化的酶rPPR与荧光威克酵母TK1菌株的酶PPR相同，可将NADPH用作辅 酶，且以苯丙酮酸、4-羟基苯丙酮酸、乙醛酸及羟基丙酮酸作为底物时的k_cat/K_m值中， 以苯丙酮酸作为底物时最高(表10)。另外，未检测出以丙酮酸及草酰乙酸作为底物的 活性(数据未显示)。由此表明，使用大肠杆菌所表达的酶rPPR也与来自荧光威克酵 母TK1菌株的酶PPR显示相同的底物特异性。

[表10]

rPPR的动力学性质

(17)本酶PPR的分子系统解析

[酶PPR的比对解析]

酶PPR的推测氨基酸序列与相同性最高的都柏林念珠菌(Candida dubliniensis)的 功能未知基因的推测氨基酸序列仅显示54%的相同性。另外，功能明确的蛋白质的氨 基酸序列中与来自植物乳酸杆菌(L.plantarum)的D-乳酸脱氢酶(DLDH)仅显示20%的 相同性，与埃特里根瘤菌(R.etli)CFN42的重组GRHPR仅显示25%相同性，与来自 变叶草(Solenostemon scutellarioide)的羟基苯丙酮酸还原酶(HPPR)仅显示27%的相同 性。

使用C.dubliniensis的功能未知基因、来自L.plantarum的DLDH、R.etli CFN42 的重组GRHPR、来自S.scutellarioide的HPPR及荧光威克酵母TK1菌株的推测氨基 酸序列进行比对解析。

于荧光威克酵母TK1菌株的推测氨基酸序列上的第185～331个上发现了 NADH/NADPH结合区域。进而在PPR的推测氨基酸序列中观察到了被认为是 NADH/NADPH结合模体的序列的-G-X-G-X-X-G-(图18)。另外，被鉴定为来自人的 GRHPR(Booth MP，et al.J Mol Biol.(2006)360,178～189)的底物结合部位的底物的与 羧基的氧原子形成氢键的第86个缬氨酸(V)(V83in GRHPR)、第87个甘氨酸 (G)(GRHPR：G274)、底物的与羧基和羰基的氧原子形成氢键的第282个精氨酸 (R)(GRHPR：R269)残基被保留在酶PPR中。还保留有作为酸碱催化剂的第329个组 氨酸(H)(GRHPR：H329)残基及与H329残基的咪唑环形成氢键的第311个谷氨酸 (E)(GRHPR：E311)残基。由于DLDH及GRHPR属于D-异构体特异性2-羟基酸脱氢 酶超家族的酶，故而提示了本供试菌的PPR也属于相同家族。

[系统树]

挑选属于GRHPR、HPPR、DLDH、甲酸脱氢酶(Formate Dehydrogenase，FDH)、 L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase，LLDH)及苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase， MDH)家族的已知的酶及与本酶PPR相同性较高的功能未知蛋白质的氨基酸序列，并 制作分子系统树。其结果为，PPR属于与LLDH、MDH超家族不同的簇，被分类为 D-异构体特异性2-羟基酸脱氢酶超家族。

为进行进一步详细的系统解析，选择属于D-异构体特异性2-羟基酸脱氢酶超家 族的HPPR或属于GRHPR家族的酶、本酶PPR以及与本酶PPR显示相同性的功能 未知蛋白质的氨基酸序列，制作系统树。其结果为，本菌的PPR不属于现存的HPPR 或GRHPR家族，与子囊菌酵母的功能未知蛋白质形成新的簇。由此可知：PPR形成 了属于D-异构体特异性2-羟基酸脱氢酶超家族的新家族。其家族于系统树上位于 HPPR及GRHPR家族附近，该情况表明，与HPPR或GRHPR家族的酶同样，本酶 PPR将苯丙酮酸、4-羟基苯丙酮酸、乙醛酸及羟基丙酮酸认作底物，在这点上是与 HPPR或GRHPR家族的酶有关系的。

[本酶PPR的功能性]

本研究中，新发现了可生产D-3-苯基乳酸及光学活性4-羟基苯基乳酸的子囊菌 酵母荧光威克酵母TK1菌株。进而由供试菌对参与生产D-3-苯基乳酸及D-4-羟基苯 基乳酸的本酶PPR进行纯化，克隆作为其基因的pprA基因。至今为止尚无关于将直 接参与生产D-3-苯基乳酸及D-4-羟基苯基乳酸的酶纯化并克隆其基因的报告，本研 究为最初的例子。另外，在酶学解析、分子系统解析的任一结果上，均表明了本酶 PPR为与报告为参与3-苯基乳酸的生产的乳酸菌的DLDH不同的酶。通过系统解析， 本酶PPR无法分类为D-异构体特异性2-羟基酸脱氢酶超家族的现存家族中，而是被 划分为与子囊菌酵母的功能未知蛋白质相同的组中。由此提示了如下可能性：本酶 PPR为属于D-异构体特异性2-羟基酸脱氢酶超家族的新酶，其功能保存于子囊菌酵 母中。

将由本研究所明确的荧光威克酵母TK1菌株中生产D-3-苯基乳酸的机构的模型 示于图19中。可认为，以葡萄糖为碳源的情况下，由莽草酸途径所供给的苯丙酮酸 通过本酶PPR被还原并生成D-3-苯基乳酸。另外，培养基中添加有苯丙氨酸的情况 下，苯丙氨酸通过氨基转移酶氨基脱落并转换成苯丙酮酸。进而，通过本酶PPR以 NADPH为辅酶由苯丙酮酸还原而生产出D-3-苯基乳酸。另外，pprA基因于苯丙氨 酸的存在下在转录水平上的表达量增大。实际上，蛋白质水平的PPR活性也增加3.6 倍，关于D-3-苯基乳酸的产量，添加苯丙氨酸时与未添加时相比也会增加58倍。

关于乳酸菌中的3-苯基乳酸的生产，可认为：对自丙酮酸向乳酸的转换进行催化 的LDH也对苯丙氨酸的代谢中间体苯丙酮酸显示催化剂作用，因此会有副反应产生 (Valerio F.et al.，(2004)FEMS Microbiol Letters,233，289-295)。然而，本供试菌的本 酶PPR并不显示LDH活性，认作底物的2-酮酸中，对苯丙酮酸的亲和性最高。该情 况表明本酶PPR的功能与通常的乳酸菌的LDH不同。

另外还可知，本酶PPR由4-羟基苯丙酮酸生成D-4-羟基苯基乳酸。

由此可知，本供试菌中，3-苯基乳酸及D-4-羟基苯基乳酸的生产并非副反应，而 是通过本酶PPR特异性生产的。

本研究中，通过利用大肠杆菌的pET体系而成功地实现了重组PPR的表达及纯 化。

另外，根据本研究，在参与芳香族化合物的生物合成的新型酶PPR的纯化、其 基因的克隆及于构筑异种生物中的表达体系方面获得成功。可认为，该成果会对今后 的芳香族为化合物的发酵生产产生作用。3-苯基乳酸为显示广泛抗菌活性的抗菌物 质，与此同时，还可期待其可作为芳香族系聚合物的原料(Tsuji H.et al.,J.Appl. Polymer Sci.,110，3954-3962(2008))。芳香族系聚合物中包括酚醛树脂所代表的苯酚 树脂或聚苯醚，通常具有耐热性、耐化学品性等优异物性。

然而，其原料的供给主要来自石油，对于被称为循环型社会的现在，要求向来源 于生物的原料转变。至今为止，作为生物聚合物而研究其实用化材料的主流为聚乳酸。 聚乳酸是通过使原料乳酸通过接枝聚合或直接聚合获得的(Yin，M.;Baker,G.L. Macromolecules1999,32，7711)。发展聚乳酸的实用化的理由在于：原料乳酸为代谢 的基本产物，对于利用乳酸菌的乳酸发酵等基于生物的生产的研究得到了广泛的进 行。若能确立芳香族系代谢产物的发酵生产技术，则可认为可稳定地供给原料，进而 制造生物来源的芳香族系聚合物。根据本研究可认为，通过明确D-3-苯基乳酸的生 产机理，实现了至今为止研究较为困难的使用D-3-苯基乳酸的生物聚合物的功能解 析的突破。

<实施例3>D-3-苯基乳酸生产体系的构筑

(1)导入有ppr基因的苯丙氨酸生产性大肠杆菌的制备

将D-3-苯基乳酸的生产株于LB培养基{10.0g/L的胰蛋白、5.0g/L的酵母浸膏、 10.0g/L的NaCl}中培养一晚后，以总量的20%添加灭菌甘油，并于-80℃保存。

预培养中，于试管中装入5.0mL LB培养基，对于培养基接种1/100量的甘油保 存溶液，并于37℃以120rpm振荡培养约6小时。

首先，依据上述方法制作质粒，并使用该质粒将ppr基因导入苯丙氨酸生产性的 ATCC31882株(由ATCC获得)，制备转化的新型苯基乳酸生产株。

(2)新型苯基乳酸生产株的培养

使用添加有20g/L的葡萄糖及50mg/L的卡那霉素的50mL苯基乳酸生产培养 基(表11及12)中，接种1/100量的上述预培养液，并于500mL容积的振荡三角瓶中 于37℃以120rpm对本苯基乳酸生产株振荡培养24小时。

[表11]

[表12]

将其结果示于图20及表13中。需要说明的是，D-3-苯基乳酸及L-苯丙氨酸的定 量中，使用RP-18柱(MERCK公司制造)，以HPLC(HEWLETT PACKARD公司制造 SERIES1100)进行。

关于苯基乳酸的光学活性，通过重结晶来纯化培养基中的苯基乳酸，将该试样供 给至如上所述的NUCLEOSIL Chiral-1柱(MACHEREY-NAGEL公司制造)，由此确定 苯基乳酸的光学活性。

D-葡萄糖的定量中，使用葡萄糖CII测试试剂盒(Wako公司制造)来进行定量。

通过将pprA基因分别导入苯丙氨酸生产株ATCC31882株，分别成功地制作了生 产99%以上D-3-苯基乳酸的有用株(ATCC31882/pHSGpprA)。

继而以实用化为目标，使用ATCC31882pHSGpprA株，利用发酵缸进行D-3-苯 基乳酸的生产(图21)。

将400mL上述苯基乳酸生产培养基装入1.0L容积的发酵缸，并接种1/100量的 预培养液，在37℃、500rpm的条件下，并以0.2L/min(0.5vvm)的空气进行通气，进 而使用5N NaOH将pH值控制在7.0，培养96小时。为了使培养环境的稳定化，添 加有适量消泡剂。

需要说明的是，关于碳源D-葡萄糖，使用蠕动泵，将500g/L的D-葡萄糖溶液 以1.50g/L/h的速度添加到培养基中。

另外，对于营养所需成分L-酪氨酸及L-色氨酸，为防止长期培养导致的缺乏， 预先于苯基乳酸生产培养基中分别添加0.50g/L。

最终，培养96小时时可生产D-3-苯基乳酸15.5g/L(相对糖产率10.8%)。需要说 明的是，相对糖产率为利用D-3-苯基乳酸的生成量(g)/D-葡萄糖的总添加量(g)而算出 的。

[表13]

(4)生产的D-3-苯基乳酸的纯化

对于在培养基中生产的D-苯基乳酸，采用使用有机溶剂的提取法和重结晶法对 其纯化。提取溶剂使用甲醇和己烷的混合溶剂(混合比1：1)。

首先，向经离心分离而除去了菌体的培养上清液中加入盐酸使其酸化，向其中加 入等量的提取溶剂，缓慢搅拌30分钟，进行提取操作。

其后，回收有机溶剂层，向培养液中再次加入新的提取溶剂，进行上述步骤。进 行2次这些步骤，利用蒸发器将回收的有机溶剂层蒸干。得到了含有D-3-苯基乳酸 的粉末状固体。

为了由所获得的粉末状固体获得高纯度的D-3-苯基乳酸，添加甲苯，并于90～ 100℃使粉末充分溶解，其后缓慢使其冷却，由此在甲苯溶液中获得了白色结晶。

去除甲苯，将经清洗的白色结晶供给至手性柱及GC/MS(GC-2010SHIMADZU 公司制造)，结果确认到，白色结晶为高纯度的D体3-苯基乳酸。

以上，通过使用本发明的PPR，确立了进行光学活性D-3-苯基乳酸的发酵生产 并得到高纯度的产物D-3-苯基乳酸的技术。并且，其产量比已报道的多很多，对于 后述的产业用途是有益的。

<实施例4>利用对PPR进行编码的基因构筑光学活性4-羟基苯基乳酸生产体系

(1)导入有ppr基因的L-酪氨酸生产性大肠杆菌的制备

将光学活性4-羟基苯基乳酸的生产株于LB培养基{10.0g/L的胰蛋白、5.0g/L 的酵母浸膏、10.0g/L的NaCl}中培养一晚后，以总量的20%添加灭菌甘油，并于-80 ℃保存。

预培养中，于试管中装入5.0mL LB培养基，对于培养基接种1/100量的甘油保 存溶液，并于37℃以120rpm振荡培养约6小时。

首先，依据上述方法制作质粒pTyrA(图22)，使用该质粒pTyrA将tyrA基因(序 列编号23)导入苯丙氨酸生产性的ATCC31882株(由ATCC获得)，获得L-酪氨酸生产 菌，该tyrA基因是使序列编号24所示的碱基序列第779个碱基的C变为了T而将第 260个Thr置换为Ile的基因。依据上述方法制作质粒(pCWpprA或pHSGpprA)，使 用该质粒将ppr基因导入该L-酪氨酸生产菌中，制备转化的新型光学活性羟基苯基乳 酸生产株(NST-pprA生产株)。

(2)具有PPR的新型光学活性羟基苯基乳酸生产株的培养

使用添加有20g/L的葡萄糖及50mg/L的卡那霉素的50mL D-羟基苯基乳酸生 产培养基(表14及表15)，并接种1/100量的上述预培养液，于500mL容积振荡三角 瓶中，于37℃以120rpm对具有PPR的光学活性羟基苯基乳酸生产株振荡培养24小 时。

使用以葡萄糖为碳源的培养基对所获得的转化体进行培养时，于培养基中检测出 了4-羟基苯基乳酸。所生产的4-羟基苯基乳酸为D-4-羟基苯基乳酸。目前为止，能 达到2.5g/L的D-4-羟基苯基乳酸的发酵生产(相对糖产率8%)(表16)。

[表14]

[表15]

[表16]

(3)含有对PPR进行编码的基因的微生物所生产的光学活性4-羟基苯基乳酸的 纯化

对于在培养基中所生产的D-4-羟基苯基乳酸，采用使用有机溶剂的提取法及重 结晶法进行纯化。提取溶剂使用乙酸乙酯与己烷的混合溶剂(混合比1：1)。

首先，向经离心分离而去除了菌体的培养上清液中添加盐酸使其酸化(pH2.5～ 3.5)，向其中添加等量提取溶剂，缓慢搅拌30分钟，进行提取操作。

其后，回收有机溶剂层，于培养液中再次添加新提取溶剂，进行上述步骤。利用 蒸发器将回收的有机溶剂层蒸干，获得含有D-4-羟基苯基乳酸的粉末状固体。

为了由所获得的粉末固体获得高纯度的D-4-羟基苯基乳酸，添加甲苯并于90～ 100℃使粉末充分溶解，其后使其缓慢冷却，由此于甲苯溶液中获得了白色结晶。

将去除了甲苯并经清洗的白色结晶供给至手性柱及GC/MS(GC-2010 SHIMADZU公司制造)，结果确认到，白色结晶为高纯度的光学活性D-4-羟基苯基乳 酸(纯度约99%)(参照图23)。

<实施例5>利用酵母W.fluoresensTKl株进行的D-4-羟基苯基乳酸的发酵生产

表明了本菌可使添加于培养基中的酪氨酸转换成4-羟基苯基乳酸。可认为，本菌 以葡萄糖为原料，经由莽草酸途径、4-羟基苯丙酮酸而生成4-羟基苯基乳酸。所生产 的4-羟基苯基乳酸为光学活性体(D-4-羟基苯基乳酸)。

<使用高速液体层析法(HPLC)的4-羟基苯基乳酸的定量>

试样中的羟基苯基乳酸的定量中，使用HPLC并于以下分析条件下进行。

需要说明的是，对培养液进行分析的情况下，将通过过滤或离心分离等去除了菌 体的培养上清液用作试样。

分析器：HP-1100(Hewlett-Packard)

柱：TSKgel ODS-80(注册商标)(4.6×150mm,Tosoh,Tokyo,Japan)

柱温度：28℃

流速：0.8mL/min

流动相：20mm磷酸钾缓冲液(pH2.5)：甲醇(6：4，v/v)

<使用气相层析质量分析计(GC/MS)的4-羟基苯基乳酸的定性>

使用1%的NaOH将培养液5mL的pH值调整为9至10，并使用离心蒸发器进 行减压干燥。使所获得的沉淀完全悬浮于1%的NaOH200μL、甲醇167μL、吡啶34μL 中。向其中添加氯甲酸甲酯20μL，并通过剧烈搅拌而使试样甲基化。反复进行添加 氯甲酸甲酯并搅拌的操作后，添加氯仿400μL并进行搅拌。接着，添加50mM碳酸 氢钠，并去除搅拌后的水层。通过向所获得的氯仿层中添加0.1g硫酸钠而使氯仿层 完全脱水，使用GC/MS(GCMS-QP2010Plus、Shimadzu)对所获得的溶液中所含的有 机酸进行测定。分析条件如下所示。

分析器：GC/MS-QP2010Plus(Shimadzu)

柱：DB-5(0.32mm×30m)

柱温度：60℃(2min)-8℃/min-180℃(5min)-40℃/min-220℃(5min)

界面温度：230℃

离子源温度：250℃

载气：He

流量：30ml/min

<生产的4-羟基苯基乳酸的光学异构>

[使用HPLC的手性分析]

使用HPLC并于以下的分析条件下确定培养液基苯基乳酸的光学异构。需要说明 的是，使用通过过滤或离心分离而自培养液中去除了菌体的培养上清液作为试样。

分析器：HP-1100(Hewlett-Packard)

柱：Nucleosil Chiral-1(Macherey-Nagel)

柱温度：60℃

流速：1.2mL/min

流动相：0.5mM的CuSO₄

<生产的4-羟基苯基乳酸的光学异构>

回收培养上清液并以适当甲醇进行稀释后作为分析试样。羟基苯基乳酸浓度的测 定中使用HPLC并于以下的分析条件下确定。

分析器：HP-1100(Hewlett-Packard)

柱：ODS-柱(5C18-MS-II：COSMSIL)

柱温度：28℃

流速：0.8mL/min

流动相：20mM磷酸：甲醇=4：6

以上，利用本发明的酶PPR时，可使酪氨酸转换成D-4-羟基苯基乳酸。进而， 通过利用经由莽草酸途径及羟基苯丙酮酸的转化体，可以葡萄糖作为原料来生成D-4- 羟基苯基乳酸。

并且，若利用本发明的酶PPR及对其进行编码的基因，则还可选择性地制作D-4- 羟基苯基乳酸。

因此，确立了一项进行D-苯基乳酸及D-4-羟基苯基乳酸的发酵生产并高纯度地 获得作为产物的D-苯基乳酸及D-4-羟基苯基乳酸的技术。另外，其产量比已报告的 多很多，对于后述的产业用途是有益的。

工业实用性

由独自发现的新型D-3-苯基乳酸生产菌获得了本发明的PPR及对其进行编码的 pprA基因，可高效地获得高纯度的光学活性3-苯基乳酸及4-羟基苯基乳酸。通过导 入有pprA基因的转化体，可以低成本的葡萄糖作为原料而高效地获得高纯度的光学 活性3-苯基乳酸及4-羟基苯基乳酸，还可于基因工程学方法进行制造。

该光学活性3-苯基乳酸被广泛的领域所关注，例如期待其用作聚芳香族系塑料原 料、生物适应性材料、功能性材料、医药农业中间体。同样地，还期待光学活性4- 羟基苯基乳酸用作食品添加物、医药、农药等。进而，有可能实现以往被认为是较为 困难的用于芳香族为化合物的发酵生产技术构筑的突破。