非线性显微镜及非线性观察方法

摘要

为了提高光轴方向的分辨率，本发明的非线性显微镜的一个形态具备：照明单元（20，19），将从光源（11）供给的照明光（L1、L2）会聚在被观察物（10）上，在该会聚点（S1）发生相干的非线性光学过程；检测单元（27），接受在上述非线性光学过程中发生的相干的物体光（Lr），生成表示该受光部处的光强度的信号；以及，控制单元（15，28），在上述会聚点扫描上述被观察物中的被观察面（10A），计测上述被观察面上的上述信号的分布；从上述光源朝向上述被观察物的上述照明光的光程和从上述被观察物朝向上述受光部的上述物体光的光程的至少一方被双重化为一对光程，这一对光程的关系设定成相对于上述被观察面对称关系。

说明书

技术领域

本发明涉及非线性显微镜及非线性观察方法。

背景技术

近年，生物技术产业的势头迅猛，特别是以生物试样作为观察对象的 3维分解显微镜的需求持续提高。其中，空间分辨率高的共焦显微镜迄今 为止被广泛使用。传统的共焦显微镜观测生物试样所包含的荧光分子相对 于照射光的强度以线性强度发出的荧光（在线性光学过程中发出的信号）， 但是，近年来，观测生物试样所包含的特定种类的分子相对于照射光的强 度以非线性强度发出的光（在非线性光学过程中发出的信号）的非线性显 微镜持续受到关注。

非线性显微镜采用长波比较长的光（例如近红外线）作为照射光，因 此，能够观察到试样的深部。另外，上述非线性过程仅仅在物镜的焦点附 近的微小区域发生，因此，非线性显微镜获取的图像成为极薄层图像（切 片图像），在这样的非线性显微镜之一中，有利用相干反斯托克斯拉曼散 射（CARS）作为非线性过程的CARS显微镜（参照专利文献1等）。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特开2009-47435号公报

发明内容

发明要解决的课题

但是，传统的CARS显微镜中，存在光轴方向（z方向）的分辨率比 与光轴垂直的面内方向（xy方向）的分辨率低的问题。

因而，本发明目的是提供能够提高光轴方向的分辨率的非线性显微镜 及非线性观察方法。

用于解决课题的技术方案

本发明的非线性显微镜的一个形态，具备：照明单元，将从光源供给 的照明光会聚在被观察物上，在该会聚点发生相干的非线性光学过程；检 测单元，接受上述会聚点处的在上述非线性光学过程中发生的相干的物体 光，生成表示该受光部中的光强度的信号；以及控制单元，一边在上述会 聚点扫描上述被观察物中的被观察面，一边反复获取上述检测单元生成的 信号，计测上述被观察面上的上述信号的分布；从上述光源朝向上述被观 察物的上述照明光的光程和从上述被观察物朝向上述受光部的上述物体光 的光程的至少一方被双重化为一对光程，这一对光程的关系设定成相对于 上述被观察面对称关系。

另外，本发明的非线性显微镜的一个形态，具备：光束分离器，将从 光源供给的照明光的光程分支为一对光程；一对偏转镜，使上述一对光程 向被观察物中的被观察面的相互相反侧分别偏转；一对物镜，对上述一对 光程分别配置，将焦点配置在上述被观察面的共同位置；分色镜，配置在 上述一对光程的共同部分，使上述一对物镜的会聚点处的在非线性光学过 程中发生的相干的物体光从上述照明光分离；检测单元，接受由上述分色 镜分离的上述物体光，生成表示该受光部处的光强度的信号；以及控制单 元，一边在上述会聚点扫描上述被观察面，一边反复获取上述检测单元生 成的信号，计测上述被观察面上的上述信号的分布。

另外，本发明的非线性观察方法的一个形态，包含：照明步骤，将从 光源供给的照明光会聚在被观察物上，在该会聚点发生相干的非线性光学 过程；检测步骤，接受上述会聚点处的在上述非线性光学过程中发生的相 干的物体光，生成表示该受光部处的光强度的信号；以及控制步骤，一边 在上述会聚点扫描上述被观察物中的被观察面，一边反复获取上述检测步 骤生成的信号，计测上述被观察面上的上述信号的分布；从上述光源朝向 上述被观察物的上述照明光的光程和从上述被观察物朝向上述受光部的上 述物体光的光程的至少一方被双重化为一对光程，这一对光程的关系设定 成相对于上述被观察面对称关系。

发明的效果

根据本发明，可实现能够提高光轴方向的分辨率的非线性显微镜及非 线性观察方法。

附图说明

图1是本实施例的CARS显微镜的构成图（两侧激励·两侧检测模式）。

图2是说明CARS过程及非共振过程的图。

图3是说明两侧激励·单侧检测模式的图。

图4是说明单侧激励·两侧检测模式的图。

图5是说明透射观察模式的图。

图6是说明反射观察模式的图。

图7是对每个模式表示能够从观察对象物向频谱检测器27侧传递的构 造的空间频率域（传递域）的图。

具体实施方式

[第1实施例]

以下，说明本发明的第1实施例。本实施例是CARS显微镜的实施例。

图1是本实施例的CARS显微镜的构成图。图1的上部是表示CARS显微 镜的光源侧的构成的图，图1的下部是表示CARS显微镜的试样侧的构成的 图。

如图1的上部所示，在本实施例的CARS显微镜上，具备激光源11和激 励脉冲光生成部12。另外，如图1的下部所示，在本实施例的CARS显微镜 上，还具备：分色镜14；光扫描器15；中继光学系统（透镜16A，16B）； 可动的光束分离器17；可动的波长选择滤波器22r；全反射镜18；物镜19； 透明培养容器10；物镜20；可动的全反射镜21；可动的波长选择滤波器22t； 光束分离器23A；拍摄元件23B；会聚透镜25；分光器26；频谱检测器27； 和控制部28。

另外，培养容器10是由透射型的试样台（未图示）支撑的透明容器， 在培养容器10的内部容纳有包含生物细胞的透明培养液。该生物细胞所包 含的分子（蛋白质、脂肪等）成为CARS显微镜的观察对象。以下，这些 分子称为“观察对象分子”。

激光源11是振荡脉冲激光的脉冲激光源，激光源振荡的脉冲激光的脉 冲形状设定成适当的形状。通过该设定，后述的光斑S1的中心部分（高密 度光斑）的能量密度成为适合于在观察对象分子发生CARS信号的能量密 度。从该激光源11出射的脉冲激光向激励脉冲光生成部12入射。

在激励脉冲光生成部12中，具备：透镜12A；光束分离器12B；可动的 全反射镜12C；可动的全反射镜12D；透镜12F；光子晶体光纤12G；透镜 12H；波长选择滤波器12J；光束分离器12E。

向激励脉冲光生成部12入射的脉冲激光，通过穿过透镜12A而成为粗 径的平行光束，向光束分离器12B入射，分支为透射过光束分离器12B的脉 冲激光L1和由光束分离器12B反射的脉冲激光L1（另外，图1中，对具有相 互相同光频率的光附加相互相同的符号。

首先，透射过了光束分离器12B的脉冲激光L1经由透镜12F向光子晶体 光纤12G的一端入射。在光子晶体光纤12G内，在脉冲激光L1的传播过程 中引起自相位调制等的非线性现象，从而，脉冲激光L1因相干而变换为光 频率带域广的脉冲激光。从而，从光子晶体光纤12G的另一端出射白色相 干脉冲光L2。该白色相干脉冲光L2通过在透镜12H穿过而成为粗径的平行 光束，经由波长选择滤波器12J向光束分离器12E入射。

另一方面，由光束分离器12B反射的脉冲激光L1顺序由全反射镜12C、 全反射镜12D反射后向光束分离器12E入射，在该光束分离器12E上，与白 色相干脉冲光L2合成为同轴。

另外，全反射镜12C、12D的全体能够向图1的箭头的方向移动，通过 该移动，调节向光束分离器12E入射的脉冲激光L1的光程长和向光束分离 器12E入射的白色相干脉冲光L2的光程长的差。通过该调节，使脉冲激光 L1向光束分离器12E入射的定时和白色相干脉冲光L2向光束分离器12E入 射的定时一致。

另外，向白色相干脉冲光L2的单独光程配置的波长选择滤波器12J的 特性设定成，在白色相干脉冲光L2所包含的多个光频率分量中仅仅使光频 率比脉冲激光L1低的分量通过的特性。因此，向光束分离器12E入射的白 色相干脉冲光L2所包含的全部的光频率分量的光频率设定为比向光束分 离器12E入射的脉冲激光L1的光频率低。

这样，光程及定时一致且在光频率上设有差异的脉冲激光L1及白色相 干脉冲光L2被用作CARS显微镜的激励光。以下，将这样的脉冲激光L1及 白色相干脉冲光L2合称为“激励脉冲光L1、L2”。

从图1上部的光束分离器12E出射的激励脉冲光L1、L2透射过图1的下 部所示的分色镜14，经由光扫描器15向透镜16A入射。向透镜16A入射的激 励脉冲光L1、L2由透镜16会聚后再次发散，在透射过光束分离器23A后向 透镜16B入射。该激励脉冲光L1、L2由透镜16B形成平行光束，向光束分 离器17入射。另外，透镜16A和透镜16B之间的激励脉冲光L1、L2的会聚 面（虚线）是后述观察对象面10A的共轭面。

这里，比光束分离器17更靠试样侧的部分构成为可切换，通过该切换， 本实施例的CARS显微镜的模式在以下的5个模式间切换。

（a）两侧激励·两侧检测模式：从培养容器10的两侧向培养容器10照 射激励脉冲光、且检测向培养容器10的两侧出射的白色CARS信号彼此的 干涉强度的模式。

（b）两侧激励·单侧检测模式：从培养容器10的两侧向培养容器10照 射激励脉冲光、且检测向培养容器10的单侧出射的白色CARS信号的模式。

（c）单侧激励·两侧检测模式：从培养容器10的单侧向培养容器10照 射激励脉冲光、且检测向培养容器10的两侧出射的白色CARS信号彼此的 干涉强度的模式。

（d）透射观察模式：从培养容器10的一侧向培养容器10照射激励脉冲 光、且检测向培养容器10的另一侧出射的白色CARS信号的模式。

（e）反射观察模式：从培养容器10的一侧向培养容器10照射激励脉冲 光、且检测向培养容器10的同侧出射的白色CARS信号的模式。

（两侧激励·两侧检测模式）

首先，说明两侧激励·两侧检测模式。

该模式中，如图1的下部所示，波长选择滤波器22t、波长选择滤波器 22r离开光程，光束分离器17被插入光程。

因此，向光束分离器17入射的激励脉冲光L1、L2分支为透射过光束分 离器17的激励脉冲光L1、L2和由光束分离器17反射的激励脉冲光L1、L2。

首先，透射过了光束分离器17的激励脉冲光L1、L2，在由全反射镜18 反射后向物镜19入射时，受到物镜19的会聚作用，向物镜19的焦点会聚。

另一方面，由光束分离器17反射的激励脉冲光，在由全反射镜21反射 后向物镜20入射时，受到物镜20的会聚作用，向物镜20的焦点会聚。

这里，物镜19和物镜20具有相互相同焦距、相互相同NA。另外，物镜 19的焦平面和物镜20的焦平面与培养容器10的深部中的观察对象面10A一 致。另外，物镜19的观察对象面10A上的会聚点和物镜20的观察对象面10A 上的焦点一致。

从而，从物镜19侧朝向培养容器10的激励脉冲光L1、L2和从物镜20 侧朝向培养容器10的激励脉冲光L1、L2在观察对象面10A上的相同位置形 成光斑S18。

而且，从光束分离器17经由全反射镜21及物镜20朝向观察对象面10A 的激励脉冲光L1、L2的光程长和从光束分离器17经由全反射镜18及物镜19 朝向观察对象面10A的激励脉冲光L1、L2的光程长一致。

即，该模式中，朝向培养容器10的激励脉冲光L1、L2的光程双重化为 一对光程，这一对光程的关系设定成相对于观察对象面10A为对称的关系。

因此，该模式中，观察对象面10A的1点（光斑S1的形成部位）从观察 对象面10A的两侧由激励脉冲光L1、L2同时照射。

光斑S1的中心部分（高密度光斑）中，发生白色CARS信号Lr。该白 色CARS信号Lr有向物镜19侧出射的白色CARS信号Lr和向物镜20侧出射 的白色CARS信号Lr。

从高密度光斑朝向物镜20的白色CARS信号Lr穿过物镜20，由全反射 镜21反射后，向光束分离器17入射。

另一方面，从高密度光斑朝向物镜19的白色CARS信号Lr穿过物镜19， 由全反射镜18反射后，向光束分离器17入射，与从物镜20侧到达的白色 CARS信号Lr合成为同轴。

这里，该模式中，从培养容器10出射的白色CARS信号Lr的光程被双 重化为一对光程，这一对光程的关系设定成相对于观察对象面10A为对称 关系。另外，在这一对光程中分别行进的一对白色CARS信号Lr为可干涉。

因此，该模式中，从观察对象面10A的1点（光斑S1的形成部位）向两 侧出射的一对白色CARS信号Lr由光束分离器17合成，相互干涉。

向光束分离器17入射的一对白色CARS信号Lr（以下，简称白色CARS 信号Lr。）经由透镜16B、光束分离器23A、透镜16A、光扫描器15，向分 色镜14入射。

分色镜14的特性设定成反射白色CARS信号Lr且使激励脉冲光L1、L2 透射的特性。

因此，向分色镜14入射的白色CARS信号Lr由分色镜14反射。

另外，从光斑S1出射的能够到达分色镜14的光中，不仅是这些白色 CARS信号Lr，也包含透射过培养容器10或者由培养容器10反射的激励脉 冲光L1、L2。但是，该激励脉冲光L1、L2不同于白色CARS信号Lr，透射 过分色镜14。

因此，由分色镜14反射的白色CARS信号Lr不与激励脉冲光L1、L2混 合，由会聚透镜25会聚，向分光器26入射。另外，在分光器26的入射口（狭 缝）前的白色CARS信号Lr的会聚点，设置有针孔。

向分光器26的内部入射的白色CARS信号Lr由未图示的衍射光栅分离 为多个波长分量（多个光频率分量），这些波长分量向由线性传感器等组 成的频谱检测器27的各传感器部分别入射。因此，向分光器26的内部入射 的白色CARS信号Lr由分光器26及频谱检测器27变换为频谱信号。由频谱 检测器27生成的频谱信号被获取到控制部28。

这里，光扫描器15是配置了一对检流计反射镜等的光扫描器，驱动光 扫描器15时，前述的光斑S110在观察对象面10A上移动。

因此，控制部28通过驱动光扫描器15，由光斑S1在观察对象面10A上 进行二维扫描，同时通过在光斑S1处于各扫描位置时从频谱检测器27获取 输出信号，获取观察对象面10A的各位置处的白色CARS信号的频谱，即 CARS频谱分布。该CARS频谱分布表示观察对象物（观察对象位置）的振 动模式分布。

这里，详细说明在高密度光斑发生白色CARS信号的原理。

说明时，将激励脉冲光L1、L2的一方即脉冲激光L1的光频率设为ω1， 将激励脉冲光L1、L2的另一方即白色相干脉冲光L2所包含的各光频率分量 L2₁、L2₂、L2₃、L2₄、…的光频率设为ω2₁、ω2₂、ω2₃、ω2₄、…。

此时，存在于高密度光斑的观察对象分子中，具有满足ωv₁=ω1-ω2₁的 式的固有频率ωv₁的部分，发生具有光频率ωr₁=2ω1-ω2₁的CARS信号。另 外，具有满足ωv₂=ω1-ω2₂的式的固有频率ωv₂的部分，发生具有光频率 ωr₂=2ω1-ω2₂的CAR信号。另外，具有满足ωv₃=ω1-ω2₃的式的固有频率ωv₃的部分，发生具有光频率ωr₃=2ω1-ω2₃的CAR信号。另外，具有满足 ωv₄=ω1-ω2₄的式的固有频率ωv₄的部分，发生具有光频率ωr₄=2ω1-ω2₄的 CAR信号。即，本实施例的CARS显微镜中，激励脉冲光L1、L2的一方采 用白色相干脉冲光L2，因此，由高密度光斑发生的CARS信号成为光频率 不同的多个CARS信号，即白色CARS信号。

这里，关注白色相干脉冲L2所包含的一个光频率分量L2_i，详细说明利 用该光频率分量L2_i的CARS过程。

如图2的左侧所示，具有光频率ω1的脉冲激光L1和具有光频率ω2_i的光 频率分量L2_i发生具有光频率（ω1-ω2_i）的节拍，但是观察对象分子的某些 部分的固有频率ωv_i等于该节拍的光频率（ω1-ω2_i），因此，该部分与节拍 共振，转移到激励状态。然后，在对成为激励状态的部分照射具有光频率 ω1的脉冲激光L1时，该部分向具有与（ωv_i+ω1）相当的能量的中间状态 转移。然后，中间状态的部分向基态转移时，发生具有光频率ωr_i=2ω1-ω2_i的CARS信号。

顺便说一下，根据该CARS过程，在高密度光斑可发生的CARS信号的 振幅分布（=观察对象分子的密度均匀时CARS信号在观察对 象面上形成的振幅分布）用以下的式表达。

其中，该式中的是脉冲激光L1在观察对象面上形成的点 像振幅分布），是光频率分量L2_i在观察对象面上形成的点像 振幅分布）。

这里，说明背景噪声。

高密度光斑中，不仅共振过程的1种即CARS过程，还可发生非共振过 程。该非共振过程往往由培养液中及细胞中的水分子引起，是成为背景噪 声的原因的过程。由水分子引起的非共振过程如下发生。即，如图2的右侧 所示，水分子由具有光频率ω1的脉冲激光L1激励为2个光子，可能向具有 与2×ω1相当的能量的中间状态转移。然后，中间状态的水分子向基态转移 时，出射被光频率分量L2_i感应而具有与光频率分量L2_i相同光频率ω2_i的光 和具有与由脉冲激光L1及光频率分量L2_i引起的CARS信号相同光频率ωr_i的光。这些光从培养容器10出射后，能够到达分色镜14为止。

其中，具有光频率ω2_i的光不由分色镜14反射，因此不入射到频谱检测 器27，而具有光频率ωr_i的光由分色镜14反射，入射到频谱检测器27。而且， 以上的现象可在光频率ω2_i不同的多个光频率分量L2_i（i=1，2，3，…）的 各处发生。

因而，可认为在控制部28获取的CARS频谱分布上重叠了各种光频率 的背景噪声。

但是，由于非共振过程和CARS过程的差异，有在背景噪声和CARS 信号之间必然错开相位π/2的特征。

从而，控制部28通过对前述CARS频谱分布实施基于该特征的运算， 能够从该CARS频谱分布除去各种光频率的背景噪声。因此，控制部28能 够获取不含背景噪声的CARS频谱分布。

以上，本实施例的CARS显微镜中，朝向培养容器10的激励脉冲光L1、 L2的光程和从培养容器10出射的白色CARS信号Lr的光程的双方双重化为 一对光程，这一对光程的关系设定成相对于观察对象面10A对称关系。

因此，本实施例的CARS显微镜能够设定成两侧激励·两侧检测模式。

另外，本实施例的CARS显微镜中，光束分离器17的姿势可变。通过 该姿势调节，能够相对地调节激励脉冲光相对于物镜20的瞳孔的入射位置 和激励脉冲光相对于物镜19的瞳孔的入射位置。因此，通过该调节，能够 使物镜20形成的光斑S1的位置和物镜19形成的光斑S1的位置沿着xy方向

相对移动。通过该相对移动，能够使物镜20形成的光斑S1的xy方向的位置 13和物镜19形成的光斑S1的xy方向的位置一致。

另外，本实施例的CARS显微镜中，物镜20的z方向的位置可变，通过 该位置调节，能够使物镜20的焦平面和物镜19的焦平面一致。

另外，本实施例的CARS显微镜中，未图示的试样台能够调节培养容 器10的z方向的位置，通过该位置调节，能够使物镜19、20的焦平面与期望 的观察对象面10A一致。

另外，本实施例的CARS显微镜中，全反射镜21能够在保持其姿势的 状态下，向与其反射面垂直的方向移动。

通过全反射镜21的位置调节，能够调节从物镜20侧朝向光斑S1的激励 脉冲光L1、L2的光程长和从物镜19侧朝向光斑S1的激励脉冲光L1、L2的 光程长的差。通过该调节，能够使激励脉冲光L1、L2从一侧向观察对象面 10A入射的定时和激励脉冲光L1、L2从另一侧向观察对象面10A入射的定 时一致。

另外，通过全反射镜21的位置调节，能够调节从光斑S1向物镜20侧出 射的白色CARS信号Lr的光程长和从光斑S1向物镜19侧出射的白色CARS 信号Lr的光程长的差。通过该调节，能够使向观察对象面10A的一侧出射 的白色CARS信号Lr向光束分离器17入射的定时和向观察对象面10A的另 一侧出射的白色CARS信号Lr向光束分离器17入射的定时一致。

另外，本实施例的CARS显微镜中，光束分离器23A使从透镜168朝向 共轭面（虚线）的光的一部分反射，向配置在与该共轭面等价的位置的拍 摄元件238入射。因此，若调节时在试样台上配置伪样本（二光子荧光材料）、 控制部28使拍摄元件23B生成的荧光图像实时显示于监视器，则能够使一 对物镜19、20分别形成的一对光斑S1的z方向的错位和/或这一对光斑S1的 xy方向的错位可视化。因此，CARS显微镜的用户能够有效地进行物镜20 的位置调节和/或光束分离器17的姿势调节。

另外，这里为了使物镜20的焦平面和物镜19的焦平面一致而使物镜20 移动，但是也可以取代物镜20使而物镜19移动。

另外，这里，为了调节从物镜20侧朝向观察对象面10A的激励脉冲光 L1、L2的光程长和从物镜19侧朝向观察对象面10A的激励脉冲光L1L2的光 程长的差而使全反射镜21移动，但是也可以取代全反射镜21使全反射镜18 移动。

另外，这里，光束分离器23A设为非可动，但是，该光束分离器23A 是在观察前的调节时而不是观察时需要，因此，也可以将该光束分离器23A 设为可动，在非观察时从光程移去。另外，若在非观察时从光程移去，则 也可以取代光束分离器23A而使用全反射镜。

另外，两侧激励·两侧检测模式中的CARS显微镜具备：使从光源（11） 供给的照明光（L1、L2）的光程分支为一对光程的光束分离器（17）；使 一对光程分别向被观察物（10）中的被观察面（10A）的相互相反侧偏转 的一对偏转镜（18，21）；对一对光程分别配置、在被观察面（10A）的 共同位置配置了焦点的一对物镜（19，20）；配置在一对光程的共同部分、 将一对物镜（19，20）的会聚点（S1）处的非线性光学过程中发生的相干 的物体光从照明光分离的分色镜（14）；接受由分色镜（14）分离的物体 光、生成表示该受光部处的光强度的信号的检测单元（27）；以及，一边 在会聚点（S1）扫描被观察面（10A），一边反复获取检测单元（27）生 成的信号、计测被观察面（10A）上的信号分布的控制单元（28）。

（两侧激励·单侧检测模式）

接着，说明两侧激励·单侧检测模式。这里仅仅说明与两侧激励·两侧检 测模式的不同点。

该模式中，如图3所示，对从光束分离器17经由物镜20朝向观察对象面 10A的激励脉冲光L1、L2的光程，将波长选择滤波器22t插入。

波长选择滤波器22t的特性设定成，切断白色CARS信号Lr且使激励脉 冲光L1、L2透射的特性。

因此，该模式中，能够到达观察对象面10A的激励脉冲光成为从物镜 19出射的激励脉冲光L1、L2和从物镜20出射的激励脉冲光L1、L2的双方， 能够到达光束分离器17的白色CARS信号仅限于从观察对象面10A向物镜 19侧出射的白色CARS信号Lr（向物镜20侧出射的白色CARS信号Lr不能 到达。）。

另外，两侧激励·单侧检测模式中的CARS显微镜在两侧激励·两侧检测 模式中的CARS显微镜中，还具备：配置在一对光程的一方、仅仅切断朝 向被观察面（10A）的照明光（L1、L1）和从被观察面（10A）出射的物 体光（Lr）中的后者的波长选择滤波器（22t）。

（单侧激励·两侧检测模式）

接着，说明单侧激励·两侧检测模式。这里也仅仅说明与两侧激励·两侧 检测模式的不同点。

该模式中，如图4所示，对从观察对象面10A经由物镜19朝向光束分离 器17的白色CARS信号Lr的光程，插入有波长选择滤波器22r。

波长选择滤波器22r的特性设定成使白色CARS信号Lr透射且切断激 励脉冲光L1、L2的特性。

因此，该模式中，能够到达观察对象面10A的激励脉冲光仅限于从物 镜20出射的激励脉冲光L1、L2，能够到达光束分离器17的白色CARS信号 成为从观察对象面10A向物镜20侧出射的白色CARS信号Lr和从观察对象 面10A向物镜19侧出射的白色CARS信号Lr的双方。

另外，单侧激励·两侧检测模式中的CARS显微镜在两侧激励·两侧检测 模式中的CARS显微镜中，还具备：配置在一对光程的一方、仅仅切断朝 向被观察面（10A）的照明光（L1、L2）和从被观察面（10A）出射的物 体光（Lr）中的前者的波长选择滤波器（22r）。

（透射观察模式）

接着，说明透射观察模式。这里也仅仅说明与两侧激励·两侧检测模式 的不同点。

该模式中，如图5所示，对从光束分离器17经由物镜20朝向观察对象面 10A的激励脉冲光L1、L2的光程，插入有波长选择滤波器22t，且对从观察 对象面10A经由物镜19到达光束分离器17的白色CARS信号Lr的光程，插入 有波长选择滤波器22r。

因此，该模式中，能够到达观察对象面10A的激励脉冲光仅限于从物 镜20侧出射的激励脉冲光L1、L2，能够到达光束分离器17的白色CARS信 号仅限于向物镜19侧出射的白色CARS信号Lr（即向激励脉冲光L1、L2的 下游侧出射的白色CARS信号Lr）。

（反射观察模式）

接着，说明反射观察模式。这里也仅仅说明与两侧激励·两侧检测模式 的不同点。

该模式中，如图6所示，光束分离器17从光程离开，对从光束分离器17 经由物镜20朝向观察对象面10A的白色CARS信号Lr的光程，插入有波长选 择滤波器22t。

因此，该模式中，能够到达观察对象面10A的激励脉冲光仅限于从物 镜19侧出射的激励脉冲光L1、L2，能够到达光束分离器17的白色CARS信 号仅限于向物镜19侧出射的白色CARS信号（即向激励脉冲光L1、L2的上 游侧出射的白色CARS信号Lr）。

（各模式的效果）

图7（A）-图7（E）是对每个模式表示能够从观察对象物向频谱检测 器27侧传递的构造的空间频率域（传递域）的图。图7（A）表示两侧激励·两 侧检测模式的传递域，图7（B）表示两侧激励·单侧检测模式的传递域，图 7（C）表示单侧激励·两侧检测模式的传递域，图7（D）表示透射观察模 式的传递域，图7（E）表示反射观察模式的传递域。

另外，这些图7（A）-图7（E）的各个横轴用波数表示z方向的传递域， 纵轴用波数表示x方向的传递域。另外，y方向的传递域的范围与x方向的传 递域的范围相同，因此图示省略。因此，能够认为传递域的z方向的幅度越 广则z方向的观察分辨率越高，传递域的x方向的幅度越广则xy方向的观察 分辨率越高。

比较图7（A）-图7（E）可知，xy方向的观察分辨率在模式间几乎无 差异。但是，z方向的观察分辨率在模式间存在差异。

具体地说，z方向的观察分辨率最高的是两侧激励·两侧检测模式（图7 （A）），z方向的观察分辨率第2高的是两侧激励·单侧检测模式（图7（B））， z方向的观察分辨率第3高的是单侧激励·两侧检测模式（图7（C）），z方 向的观察分辨率第4高的是透射观察模式或者反射观察模式（图7（D）、 图7（E））。

即，为了提高z方向的观察分辨率，最好将本实施例的CARS显微镜设 定成两侧激励·两侧检测模式（图7（A）），设定成两侧激励·单侧检测模 式（图7（B））的场合，也可以获得相近效果。另外，虽然比其稍差，但 是设定成单侧激励·两侧检测模式（图7（C））的场合，也可以获得一定的 效果。

另一方面，将本实施例的CARS显微镜设定成透射观察模式（图7（D）） 及反射观察模式（图7（E））的场合，z方向的观察分辨率保持较低。

顺便说一下，在透射观察模式（图7（D））、反射观察模式（图7（E）） 之间，传递域错位，存在前者的原点被覆盖而后者的原点未被覆盖的差异。 即，差异在于：透射观察模式（图7（D））能够传递空间频率为零附近的 构造但是无法传递空间频率大的构造，而反射观察模式（图7（E））无法 传递空间频率为零附近的构造但是能够传递空间频率大的构造。

从而，本实施例的CARS显微镜的用户通过一边将CARS显微镜的模式 在以上的5种模式间切换一边反复观察同一观察对象面10A，能够详细进行 观察对象面10A的观察。

用户通过将CARS显微镜的模式设定成将观察对象面10A的激励方向 和检测方向的至少一方双重化的模式（图7（A）到（C）），能够提高z 方向的观察分辨率，而且，通过设定成将观察对象面10A的激励方向和检 测方向双方双重化的模式（图7（A）），能够使z方向的观察分辨率最高。

[第1实施例的补充]

另外，第1实施例中，说明了分光型的CARS显微镜，但是本发明也能 够适用于非分光型的CARS显微镜。该场合，在上述激励脉冲光生成部12 应用光参量发射器，生成光频率不同的一对脉冲激光作为激励脉冲光即可。 另外，该场合，从观察对象面10A出射的CARS信号成为单一光频率的 CARS信号，因此，取代分光器26及频谱检测器27而采用PMT（光电倍增 管）等受光元件即可。

另外，第1实施例中，说明了激光扫描型的CARS显微镜，但是本发明 也能够适用于台座扫描型的CARS显微镜。该场合，省略光扫描器15，未 图示的试样台设为不仅在z方向还能够在xy方向上移动培养容器10。

另外，第1实施例中利用CARS过程作为非线性过程，但是也可以利用 其他非线性过程。其他非线性过程例如是双光子荧光、第1谐波（SHG）、 第2谐波（THG）、相干斯托克斯拉曼散射（CSRS）、4波混合、和频发 生等。

符号说明

11…激光源，12…激励脉冲光生成部，14…分色镜，15…光扫描器， 16A...透镜，16B…透镜16，17...光束分离器，22r…波长选择滤波器，18… 全反射镜，19…物镜，20…物镜，21…全反射镜，22t…滤波器，10…培养 容器，23A…光束分离器，23B…拍摄元件，25…会聚透镜，26…分光器26， 27…频谱检测器，28…控制部