APRIL基因实时荧光PCR检测引物和试剂盒

摘要

本发明提供了一种APRIL基因实时荧光PCR检测的引物，正向引物（SEQ ID NO.1）：5-GTGATTTAAGAGGACT-3；反向引物（SEQ ID NO.2）：5-TGGAGAGGGTGCGAAC-3；和利用上述引物对APRIL基因进行实时荧光PCR检测的试剂盒和检测方法。本发明采用SYBR Green I实时荧光PCR检测方法，对APRIL基因进行鉴定，具有检测实时性和高效性，并可以对早期APRIL基因表达进行检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，尤其是涉及APRIL基因实时荧光PCR检测 引物和试剂盒。

背景技术

一种诱导增殖配体（a proliferation inducing ligand,APRIL），和BAFF （B-cell-activating factor）同属于肿瘤坏死因子超家族成员，主要由DC,巨噬细胞， T和B细胞分泌。APRIL对免疫调节的功能定义的较少。最近研究表明APRIL 可能作为初始B和T细胞的共刺激因子，诱导外周血B细胞产生IgM[G.Yu,T. Boone,J.Delaneyet al,Nat Immunol,2000,1（3）:252-256;J.V.Stein,M. Lopez-Fraga,F.A.,J Clin Invest,2002,109（12）:1587-1598]，影响胸腺依赖性B细 胞应答。与BAFF相同，APRIL促进B细胞增殖和增加激活T细胞的数量。

APRIL不仅可以结合BAFF的共受体BCMA和TACI，然且APRIL可以结合独 自受体--硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPG）。APRIL 可以结合肿瘤细胞表达的HSPG，参与肿瘤的维持和生长，利用肝素（Heparin） 可以抑制APRIL与HSPG的结合，降低其对肿瘤的促生长作用；在裸鼠注射 ARPIL转染的肿瘤细胞比对照组增殖更加迅速，抑制APRIL对肿瘤生长有明显 的抑制作用。在原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis,PBC)，一种自身免 疫性肝病，病人BAFF和APRIL的血清浓度明显增加[P.Rennert,P.Schneider,T. G.Cacheroet al.,J Exp Med,2000,192（11）:1677-1684 ]。ARPIL也成为治疗自身免疫性疾病和肿瘤的新兴药物靶点。

目前，在APRIL的检测方法上，还是普遍采用抗体直接检测定量技术；但是， 对于目前病人的个性化治疗和疾病发展检测方面，这技术定性和定量周期较长， 花费较大，不适合大范围的使用。

发明内容

为了解决上述现有技术的不足，本发明目的是提供一种APRIL基因实时荧 光PCR检测引物和试剂盒。

本发明所采用的技术方案如下：

APRIL基因PCR检测的引物，

正向引物：5-GTGATTTAAGAGGACT-3；

反向引物：5-TGGAGAGGGTGCGAAC-3；

利用引物对进行检测的试剂盒：

试剂盒包括一种检测溶液，其检测溶液含有含SYBR Premix Ex Taq(2×)、正 向引物10μM、反向引物10μM、Rox Dye（50×）；

利用本试剂盒进行检测的步骤如下：

1）提取待检测样品的RNA，并反转录cDNA溶液。

2）反应体系：取2ul步骤1）中所得的DNA溶液，并与上述试剂盒中的检 测溶液14ul进行混合，并加入无菌超纯水至反应体积20ul；加入到实时荧光反 应管中，进行离心；

3）将步骤2）的反应体系按照下述条件进行实时荧光PCR检测：

预变性95℃/100s，1次循环；变性95℃/30s，延伸66℃/120s，40次循 环。

本发明采用SYBR Green I实时荧光PCR检测方法，对APRIL基因进行鉴 定，具有检测实时性和高效性，并可以对早期APRIL基因表达进行检测，针对 APRIL基因表达的胞外区RNA为检测对象进行设计引物，检测早期APRIL分泌形 式的基因表达，用于早期判断自身免疫性疾病，另外可以对病人进行个性诊断和 治疗过程中，APRIL的基因表达情况的检测，并判断自身免疫性疾病病人复发 和加重病情的可能性及其对于肿瘤患者中APRIL标的相关性。

附图说明

图1是实施例1的检测样品实时荧光PCR检测曲线；

图2是实施例1的检测样品和对照实时荧光PCR检测比较图；

图3是实施例2的检测样品和对照进行ELISA验证比较图。

具体实施方式

根据实施例和附图对本发明申请做进一步的说明。

设计APRIL基因PCR检测的引物，根据编码APRIL的胞外区cDNA进行 设计

正向引物：5-GTGATTTAAGAGGACT-3

反向引物：5-TGGAGAGGGTGCGAAC-3；

另外试剂盒包括一种检测溶液，其检测溶液含有含SYBR Premix Ex Taq(2×)、 正向引物10μM、反向引物10μM、Rox Dye（50×）；

实施例1

1）离心待检测样品和阴性对照血液，提取下层血细胞的RNA，并反转录 cDNA溶液，低温保存备用；其中检测样品取自系统性红斑狼疮病人血液（1、2、 3）和原发性胆汁性肝硬化病人血液（4）；正常人血清（5、6）作为阴性对照。

2）反应体系：取2ul步骤1）中所得的DNA溶液，并与上述试剂盒中的检 测溶液14ul进行混合，并加入无菌超纯水至反应体积20ul；加入到实时荧光反 应管中，进行离心；同时以无菌水作为空白对照

3）将步骤2）的反应体系按照下述条件进行实时荧光PCR检测：

预变性95℃/100s，1次循环；变性95℃/30s，延伸66℃/120s，40次循 环。

附图1为本实施例的实时荧光PCR扩增曲线，其中1-3为系统性红斑狼疮病 人样品，4为原发性胆汁性肝硬化病人样品；5、6为阴性对照。其中样品1和3 曲线分别高于2和4，样品2的曲线高于样品3；并表现出良好的特异性。

附图2为进行检测样品和对照样品的曲线荧光进行比较；样品1-4明显高于 阴性对照；其中^***，为P<0.01。

实施例2

利用ELISA进行对检测样品中血清APRIL的浓度，采用酶标仪进行检测所 得OD值进行分析；及实时荧光PCR检测结果相符性；所用的APRIL抗体购自 为Santa Cruz公司，货号为APRIL(F-5)。

ELISA的检测结果与利用实时荧光PCR所得出的APRIL表达趋势相符。