术中辅助鉴定前哨淋巴结是否发生乳腺癌细胞转移的引物组及其应用

摘要

本发明公开了一种术中辅助鉴定前哨淋巴结是否发生乳腺癌细胞转移的引物组及其应用。本发明提供了一种引物组，由引物组合物甲、引物组合物乙和引物组合物丙组成；引物组合物甲由序列1、2、3、4、5和6所示的单链DNA分子组成引物组合物乙由序列7、8、9、10、11和12所示的单链DNA分子组成；引物组合物丙由序列13、14、15、16、17和18所示的单链DNA分子组成。应用本发明提供的引物组鉴定前哨淋巴结是否发生乳腺癌细胞转移，在手术过程之中即可判断SLN的转移状态，这样一来患者就可以避免二次手术，既减少了患者的痛苦，同时也可以大大的节省医院的开支，这无疑具有非常重要的临床和社会意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种术中辅助鉴定前哨淋巴结是否发生乳腺癌细胞转移的引物组及其 应用。

背景技术

乳腺癌是常见的女性肿瘤，其发病率和死亡率分列女性肿瘤的第一位和第二位， 手术是乳腺癌患者最常用的治疗手段之一。自1894年Halsted创立乳腺癌根治术以后 的100多年间，乳腺癌外科治疗经历了扩大根治术和改良根治术的尝试和修正，最大 的变革无疑是20世纪后30年间迅速发展的保乳治疗，这使得外科治疗模式从“可以 耐受的最大治疗”转变到“最小有效治疗”的道路上来，开始强调注重生活质量的保 守治疗。

腋窝淋巴结(axilary lymph nodes,ALN)分级是决定早期乳腺癌的诊断、治疗和 预后的重要因素，根据ALN状态的不同，临床医生可以为患者制定与之相对应的治疗 策略。多年以来，临床上判断ALN状态的主要方法是依赖腋窝淋巴结清扫术(axilary  lymph nodes dissection，ALND)。但是近年来，随着诊断影像学的不断发展，乳腺癌 早期确诊的频率不断提高，其中有50%到60%的乳腺癌病人并没有ALN转移，这部分病 人进行ALND是一种过度治疗，不仅不会明显改善其生存效果，还会造成病人上肢水肿、 麻木等术后综合症的发生，严重影响患者的生活质量。

为了既能准确的评估ALN的状态，同时尽可能缩小手术范围，临床上逐渐探索出 了一种替代ALND的方法——前哨淋巴结活检(sentinel lymph node biopsy，SLNB）。

前哨淋巴结(sentinel lymph node，SLN）指的是通过淋巴导流管进行转移的肿瘤 细胞首先达到的一个或几个淋巴结（如图1所示）,一般通过在肿瘤附近注射美蓝等 染料，沿淋巴管找到距肿瘤中心最近的蓝染的淋巴结即为SLN。乳腺癌的SLN通常位 于腋窝,少数情况下亦可位于腋窝以外。根据SLN理论，SLN可以准确的反映ALN的 转移状态，乳腺癌患者手术过程中，外科医生首先要切除患者的SLN，如果检测证实 SLN中没有肿瘤细胞的转移，则证实患者的肿瘤分期较早，ALND就可以避免，这是与 “最小有效治疗”原则相符合的。随着SLN研究在乳腺癌领域的不断进展，SLNB已经 成为了世界通用的乳腺癌早期治疗的标准手术步骤。

SLN的转移状态可以通过组织病理学检查来判断，目前最常用的有冰冻切片和石蜡 切片两种方法。冰冻切片方法的优势在于简单快速，外科医生在手术进行中即可得知 结果，患者如果需要做ALND，则无需进行二次手术。该方法的不足在于假阴性率很高 (5-52%)，而且受周围脂肪组织的影响，切片容易扭曲变形，不易于观察。石蜡切片目 前虽然是判断SLN是否转移的金标准，但是等待结果需要1-2天的时间，不利于术中进 行。如果采用该方法，患者的手术需要分两次来做：第一次手术切除SLN，等石蜡切片 的结果出来后才能决定是否进行二次手术，这对患者和医院都会造成很多不必要的麻 烦。

除此之外，上述两种切片法还存在一些共同的不足：①为节省人力物力，一般只 切取2-5%的淋巴结进行检测，切片位置的不同可能会导致不同的结果；②切片过程中 有一个厚度间隔，低于该间隔的转移灶容易被漏检；③切片法提供的是主观结果，对 于同一张切片，不同的病理医生可能会得出不同的结果。

综上所述，只有准确快速的判断SLN的转移状态，才能正确的安排患者后续手术和 药物治疗方案，在保证治疗效果的前体下，尽可能的提高患者的生活质量。目前临床 上对SLNB最理想的要求是：①快速：能在手术进行过程中得到结果；②准确：能够真 实反映SLN的转移状态；③整体：能对整个淋巴结进行全面分析，避免漏诊；④客观： 尽量避免主观影响因素。

很显然，常规病理学的方法不能完全满足上述要求。如果能够建立一种快速、准 确、客观的整体检测技术，在手术过程之中即可判断SLN的转移状态，患者就可以避免 二次手术，既减少了患者的痛苦，同时也可以大大的节省医院的开支，这无疑会具有 非常重要的临床和社会意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种术中辅助鉴定前哨淋巴结是否发生乳腺癌细胞转移的引 物组及其应用。

本发明提供了一种引物组，由引物组合物甲、引物组合物乙和引物组合物丙组成；

所述引物组合物甲由序列表的序列1所示的单链DNA分子、序列表的序列2所示 的单链DNA分子、序列表的序列3所示的单链DNA分子、序列表的序列4所示的单链 DNA分子、序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分 子组成；

所述引物组合物乙由序列表的序列7所示的单链DNA分子、序列表的序列8所示 的单链DNA分子、序列表的序列9所示的单链DNA分子、序列表的序列10所示的单链 DNA分子、序列表的序列11所示的单链DNA分子和序列表的序列12所示的单链DNA 分子组成；

所述引物组合物丙由序列表的序列13所示的单链DNA分子、序列表的序列14所 示的单链DNA分子、序列表的序列15所示的单链DNA分子、序列表的序列16所示的 单链DNA分子、序列表的序列17所示的单链DNA分子和序列表的序列18所示的单链 DNA分子组成。

本发明还保护所述引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下（a） 或（b）或（c）：（a）辅助鉴定CK19基因（编码细胞角蛋白）、PIP基因（编码泌乳 素诱导蛋白）和PBGD基因（又称HMBS基因，编码胆色素原脱氨酶，胆色素原脱氨酶 又称为羟甲基胆汁合酶）的表达情况；（b）辅助鉴定乳腺癌细胞；（c）辅助鉴定前哨 淋巴结是否发生乳腺癌细胞转移。

本发明还保护一种试剂盒，包括所述引物组；所述试剂盒的功能为如下（a）或（b） 或（c）：（a）辅助鉴定CK19基因、PIP基因和PBGD基因的表达情况；（b）辅助鉴定 乳腺癌细胞；（c）辅助鉴定前哨淋巴结是否发生乳腺癌细胞转移。

本发明还保护所述引物组的应用，为如下（a）或（b）：（a）辅助鉴定CK19基因、 PIP基因和PBGD基因的表达情况；（b）辅助鉴定乳腺癌细胞。

本发明还保护所述引物组合物甲。

本发明还保护所述引物组合物甲在制备鉴定CK19基因的试剂盒中的应用。

本发明还保护所述引物组合物乙。

本发明还保护所述引物组合物乙在制备鉴定PIP基因的试剂盒中的应用。

本发明还保护所述引物组合物丙。

本发明还保护所述引物组合物丙在制备鉴定PBGD基因的试剂盒中的应用。

以上任一所述的CK19基因可为如下（1）或（2）：

（1）序列表的序列19自5’末端第143-1345位核苷酸所示的DNA分子或与其对 应的RNA分子；

（2）序列表的序列19所示的DNA分子或与其对应的RNA分子。

以上任一所述的PIP基因可为如下（3）或（4）：

（3）序列表的序列20自5’末端第37-477位核苷酸所示的DNA分子或与其对应 的RNA分子；

（4）序列表的序列20所示的DNA分子或与其对应的RNA分子。

以上任一所述的PBGD基因可为如下（5）或（6）：

（5）序列表的序列21自5’末端第158-1243位核苷酸所示的DNA分子或与其对 应的RNA分子；

（6）序列表的序列21所示的DNA分子或与其对应的RNA分子。

以上任一所述的乳腺癌细胞具体可为MCF-7细胞。

应用所述引物组合物辅助鉴定乳腺癌细胞的方法具体包括如下步骤：①提取待测 细胞的总RNA；②以步骤①提取的总RNA为模板，分别采用所述引物组合物甲、所述 引物组合物乙或所述引物组合物丙进行RT-LAMP，根据RT-LAMP的结果判断待测细胞 是否为乳腺癌细胞。如果采用所述引物组合物丙进行RT-LAMP的结果、采用所述引物 组合物甲进行RT-LAMP的结果和采用所述引物组合物乙进行RT-LAMP的结果均为阳性， 则证实核酸提取符合要求，待测细胞为候选的乳腺癌细胞。如果采用所述引物组合物 丙进行RT-LAMP的结果为阳性、采用所述引物组合物甲进行RT-LAMP的结果和采用所 述引物组合物乙进行RT-LAMP的结果均为阴性，则证实核酸提取符合要求，待测细胞 为候选的非乳腺癌细胞。如果采用所述引物组合物丙进行RT-LAMP的结果为阴性，说 明核酸提取有问题，实验失败，需重新进行。

应用所述引物组合物辅助鉴定前哨淋巴结是否发生乳腺癌细胞转移的方法具体包 括如下步骤：①提取待测前哨淋巴结的总RNA；②以步骤①提取的总RNA为模板，分 别采用所述引物组合物甲、所述引物组合物乙或所述引物组合物丙进行RT-LAMP，根 据RT-LAMP的结果判断待测前哨淋巴结是否发生乳腺癌细胞转移。如果采用所述引物 组合物丙进行RT-LAMP的结果、采用所述引物组合物甲进行RT-LAMP的结果和采用所 述引物组合物乙进行RT-LAMP的结果均为阳性，则证实核酸提取符合要求，待测前哨 淋巴结为候选的发生乳腺癌细胞转移的前哨淋巴结。如果采用所述引物组合物丙进行 RT-LAMP的结果为阳性、采用所述引物组合物甲进行RT-LAMP的结果和采用所述引物 组合物乙进行RT-LAMP的结果均为阴性，则证实核酸提取符合要求，待测前哨淋巴结 为候选的未发生乳腺癌细胞转移的前哨淋巴结。如果采用所述引物组合物丙进行 RT-LAMP的结果为阴性，说明核酸提取有问题，实验失败，需重新进行。

以上任一所述的RT-LAMP反应的反应均可采用Loopamp朗报核糖核酸扩增试剂 盒。采用Loopamp朗报核糖核酸扩增试剂盒时，所述RT-LAMP反应的反应体系具体组 成如下：2×酶溶液（RM）12.5μl、引物组合物溶液2.5μl（含FIP40pmol、BIP40pmol、 FLP20pmol、BLP20pmol、F35pmol和B35pmol）、酶溶液（EM）1.0μl、去离子水（DW） 4.0μl、总RNA溶液（总RNA溶液中的RNA浓度为20ng/μl）5μl（对照试验以等体积 去离子水代替）。

以上任一所述的RT-LAMP反应程序如下：63℃1小时，80℃5分钟。

所述逆转录环介导恒温扩增的反应体系的结果可以按照以下四种方式进行检测： ①通过Loopamp浊度仪实时检测焦磷酸镁沉淀：如果生成浊度变化曲线则说明待测生 物样本中含有所述基因的RNA，反之则没有；②通过直接观察沉淀进行结果判读：如 果反应体系中生成白色沉淀，待测生物样本中含有所述基因的RNA，反之则没有；③ 当体系中含有钙黄绿素时，可以通过荧光显色进行结果判读：如果逆转录环介导等温 扩增体系显示为绿色，待测生物样本中含有所述基因的RNA，如果逆转录环介导等温 扩增体系显示为橙色，待测生物样本中不含有所述基因的RNA；④通过琼脂糖凝胶电 泳进行结果判读：如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测生物样本中含 有所述基因的RNA，反之则没有。为避免气溶胶的污染，推荐在条件允许的情况之下 采用方式①进行检测，条件不具备时尽量采用方法②和③进行检测。扩增之后的样品 按照生物污染物处理，尽量不要打开反应管的盖子。

应用本发明提供的引物组通过RT-LAMP（逆转录环介导恒温扩增）技术可以从分 子水平上直接快速、准确检测CK19基因、PIP基因和PBGD基因，具有如下优点：（1） 在恒温条件下即可发生反应，摆脱了了对于仪器的依赖；（2）反应时间短；在30min 内即可完成检测；（3）灵敏度高；最低检测限为10^-4ng/μl；（4）特异性强；应用6 个靶基因位点，内引物及外引物在6个区域特异性结合方可进行扩增；（5）鉴定简便； 在核酸大量合成时，从dNTP解离出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副 产物—焦磷酸镁沉淀；如果在反应体系中加入结合了Mn²⁺的钙黄绿素，Mg²⁺则替换掉钙 黄绿素中结合的Mn²⁺，是钙黄绿素发出黄绿色荧光；以上两种方法均不需要借助其他 仪器便可肉眼观察实验结果，实现了结果可视化；也可通过Loopamp浊度仪检测的方 式进行结果判读；（6）步骤简单；可以实现RNA的一步扩增，免开盖操作，可保证临 床检验人员自身安全，进而也避免了气溶胶的污染。

应用本发明提供的引物组辅助鉴定前哨淋巴结是否发生乳腺癌细胞转移与通过美 国FDA批准的GeneSearch方法比较，符合性良好，具有很好的临床推广应用价值。应 用本发明提供的引物组鉴定前哨淋巴结是否发生乳腺癌细胞转移，解决了传统病理方 法在准确性、整体性以及时间性方面的不足，具有灵敏度高、速度快、特异性强、简 便、安全等特点，在手术过程之中即可判断SLN的转移状态，这样一来患者就可以避 免二次手术，既减少了患者的痛苦，同时也可以大大的节省医院的开支，这无疑具有 非常重要的临床和社会意义。

附图说明

图1为人体内的前哨淋巴结的示意图。

图2为实施例1的步骤一中的扩增曲线（本发明保护的各个引物组合物中的基础 引物部分）。

图3为实施例1的步骤一中的扩增曲线（对照引物组合物的基础引物）。

图4为实施例1的步骤三中的扩增曲线（本发明保护的各个引物组合物，包括基 础引物和环引物）。

图5为实施例2中的扩增曲线。

图6为实施例3中的扩增曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。MCF-7细胞（人乳腺癌细胞系）：ATCC，HTB-22。NAMALWA细胞（B 细胞淋巴瘤细胞系）：ATCC，CRL-1432。实施例中的RT-LAMP反应体系中，除了引物， 其它组分均为Loopamp朗报核糖核酸扩增试剂盒（RT-LAMP法）（北京蓝谱生物科技有 限公司，货号为SLP244）中的组件。

CK19基因和PIP基因均为乳腺癌细胞中特异表达的基因。PBGD基因为各细胞中均表 达的基因，作为参照基因。

实施例1、引物组的设计和筛选

设计并合成用于鉴定CK19基因的引物组合物（共6组,均为LAMP引物组合物，均 由FIP、BIP、F3和R3组成）、用于鉴定PIP基因的引物组合物（共4组,均为LAMP 引物组合物，均由FIP、BIP、F3和R3组成）和用于鉴定PBGD基因的引物组合物（共 3组,均为LAMP引物组合物，均由FIP、BIP、F3和R3组成）。

一、采用MCF-7细胞和NAMALWA细胞进行引物筛选：

1、采用天根生化科技（北京）有限公司的细胞/细菌总RNA提取试剂盒(货号：DP430) 分别提取MCF-7细胞和NAMALWA细胞的总RNA，-80℃冻存。

2、以步骤1提取总RNA溶液为模板，分别采用各组引物组合物进行RT-LAMP。

RT-LAMP反应体系（25μL）：2×酶溶液（RM）12.5μl、引物组合物溶液2.5μl（含 FIP40pmol、BIP40pmol、F35pmol和B35pmol）、酶溶液（EM）1.0μl、去离子水（DW） 4.0μl、总RNA溶液（总RNA溶液中的RNA浓度为20ng/μl）5μl。

设置如下空白对照：用5μl去离子水代替RT-LAMP反应体系中的5μl总RNA溶液。

RT-LAMP反应程序：63℃1小时，80℃5分钟，4℃保存。从反应开始时刻即采 用Loopamp浊度仪（厂家：日本荣研化学株式会；型号：LA-320C；参数：光源为ED （波长650mm），检出器为光电二极管）实时检测60分钟。

经验证，用于鉴定CK19基因的第六组引物组合物、用于鉴定PIP基因的第二组引 物组合物和用于鉴定PBGD基因的第二组引物组合物的结果最为理想，出现扩增曲线的 起始时间依次为24分钟、30分钟和28分钟。进行三次重复实验，结果一致。

用第六组引物组合物鉴定CK19基因的扩增曲线见图2A，用第二组引物组合物鉴 定PIP基因的扩增曲线见图2B，用第二组引物组合物鉴定PBGD基因的扩增曲线见图 2C。

用于鉴定CK19基因的第六组引物组合物的序列如下：

CK19-F3（序列1）：5’-TGGTACCAGAAGCAGGGG-3’；

CK19-B3（序列2）：5’-GTTGATGTCGGCCTCCACG-3’；

CK19-FIP（序列3）：5’-GGAGTTCTCAATGGTGGCACCAACTACTACACGACCATCCA-3’；

CK19-BIP（序列4）：5’-GTCCTGCAGATCGACAACGCCTCCGTCTCAAACTTGGTTCG-3’。

用于鉴定PIP基因的第二组引物组合物的序列如下：

PIP-F3（序列7）：5’-GACGACAATCCAAAAACCTT-3’；

PIP-B3（序列8）：5’-AGAGGAAATCACCTGGGT-3’；

PIP-FIP（序列9）：5’-CCGAATAACATCAACGACGGCCTACTGGGACTTTTACACCA-3’；

PIP-BIP（序列10）：5’-CCTGATGATGCTGCTGTAATCCGGGCTTCCATTATTCTACCTT-3’。

用于鉴定PBGD基因的第二组引物组合物的序列如下：

PBGD-F3（序列13）：5’-AGAGTGATTCGCGTGGGTA-3’；

PBGD-B3（序列14）：5’-ACTTCATTCTTCTCCAGGGC-3’；

PBGD-FIP（序列15）：5’-TCAAACTGCAGGCCAGGGTACCAGCTTGCTCGCATACAGAC-3’；

PBGD-BIP（序列16）：5’-TTGCTATGTCCACCACAGGGGAAGCTCCTTGGTAAACAGGC-3’。

用于鉴定CK19基因的6组引物组合物中，除了第六组引物组合物外，其余5组引 物组合物的扩增效果均不理想，或者扩增时间过长（出现扩增曲线的起始时间为30 分钟以上），或者在NAMALWA细胞或空白对照中存在非特异性扩增，第一组引物组合物 的扩增曲线见图3A（出现扩增曲线的起始时间为34分钟）。

用于鉴定PIP基因的4组引物组合物中，除了第二组引物组合物外，其余3组引 物组合物的扩增效果均不理想，或者扩增时间过长（出现扩增曲线的起始时间为30 分钟以上），或者在NAMALWA细胞或空白对照中存在非特异性扩增，第一组引物组合物 的扩增曲线见图3B（出现扩增曲线的起始时间为36分钟，存在非特异性扩增）。

用于鉴定PBGD基因的3组引物组合物中，除了第二组引物组合物外，其余2组引 物组合物的扩增效果均不理想，扩增时间过长（出现扩增曲线的起始时间为30分钟以 上），第一组引物组合物的扩增曲线见图3C（在MCF-7细胞中出现扩增曲线的起始时 间为44分钟，在NAMALWA细胞中出现扩增曲线的起始时间为48分钟）。

用于鉴定CK19基因的第一组引物组合物的序列如下：

F3：5’-AAGGCGCCAGGTGAGG-3’；

B3：5’-GCGGAGGACACGGATACG-3’；

FIP：5’-TCATGGCGAGGCGGAGCACCCCGCGAATCGCAGCT-3’；

BIP：5’-CGGCTCCGTGCGTTTTGGGGAGCCCCCGTGAATGC-3’。

用于鉴定PIP基因的第一组引物组合物的序列如下：

F3：5’-AGAATTTTGACATTCCCAAGT-3’；

B3：5’-TTGGTGTAAAAGTCCCAGTA-3’；

FIP：5’-ACCATGCATTCTTTCAATTCTGTTTCAGTACGTCCAAATGACGAA-3’；

BIP：5’-TTACCTCATTAGCAGCATCCCTCTAGAAGGTTTTTGGATTGTCGT-3’。

用于鉴定PBGD基因的第一组引物组合物的序列如下：

F3：5’-GCAACTGTACCTGACTGGAG-3’；

B3：5’-TGCTCAGCAACAAGTTGGC-3’；

FIP：5’-TGCTGGGCAGGGACATGGATGAGTCTGGAGTCTAGACGGC-3’；

BIP：5’-TGACCCACAGTTGGTAGGCATCGCTGATGCCCAAGTTCTGG-3’。

二、设计环引物

在用于鉴定CK19基因的第六组引物组合物的基础之上设计环引物，以进一步缩短 反应时间，具体引物序列如下：

CK19-FLP（序列5）：5’-AGAATCTTGTCCCGCAGG-3’；

CK19-BLP（序列6）：5’-CGTCTGGCTGCAGATGA-3’。

在用于鉴定PIP基因的第二组引物组合物的序列的基础之上设计环引物，以进一 步缩短反应时间，具体引物序列如下：

PIP-FLP（序列11）：5’-TGCAATTTGCACAGTTCT-3’；

PIP-BLP（序列12）：5’-CCGGTTTTATACTATTGAAATCC-3’。

在用于鉴定PBGD基因的第二组引物组合物的基础之上设计环引物，以进一步缩短 反应时间，具体引物序列如下：

PBGD-FLP（序列17）：5’-GTTGCCACCACACTGTCC-3’；

PBGD-BLP（序列18）：5’-CTGCACTCTCTAAGATTGGAGAGA-3’。

三、引物组合物的应用

将序列表的序列1所示的单链DNA分子、序列表的序列2所示的单链DNA分子、 序列表的序列3所示的单链DNA分子、序列表的序列4所示的单链DNA分子、序列表 的序列5所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分子形成的引物组合 物命名为引物组合物甲（用于鉴定CK19基因）。

将序列表的序列7所示的单链DNA分子、序列表的序列8所示的单链DNA分子、 序列表的序列9所示的单链DNA分子、序列表的序列10所示的单链DNA分子、序列表 的序列11所示的单链DNA分子和序列表的序列12所示的单链DNA分子形成的引物组 合物命名为引物组合物乙（用于鉴定PIP基因）。

将序列表的序列13所示的单链DNA分子、序列表的序列14所示的单链DNA分子、 序列表的序列15所示的单链DNA分子、序列表的序列16所示的单链DNA分子、序列 表的序列17所示的单链DNA分子和序列表的序列18所示的单链DNA分子形成的引物 组合物命名为引物组合物丙（用于鉴定PBGD基因）。

1、采用天根生化科技（北京）有限公司的细胞/细菌总RNA提取试剂盒(货号：DP430) 分别提取MCF-7细胞和NAMALWA细胞的总RNA，-80℃冻存。

2、以步骤1提取的总RNA溶液为模板，分别进行三个体系的RT-LAMP。

第一个RT-LAMP反应体系（25μL）：2×酶溶液（RM）12.5μl、引物组合物甲溶液 2.5μl（含CK19-FIP40pmol、CK19-BIP40pmol、CK19-FLP20pmol、CK19-BLP20pmol、 CK19-F35pmol和CK19-B35pmol）、酶溶液（EM）1.0μl、去离子水（DW）4.0μl、总 RNA溶液（总RNA溶液中的RNA浓度为20ng/μl）5μl。

第二个RT-LAMP反应体系（25μL）：2×酶溶液（RM）12.5μl、引物组合物乙溶液 2.5μl（含PIP-FIP40pmol、PIP-BIP40pmol、PIP-FLP20pmol、PIP-BLP20pmol、 PIP-F35pmol和PIP-B35pmol）、酶溶液（EM）1.0μl、去离子水（DW）4.0μl、总RNA 溶液（总RNA溶液中的RNA浓度为20ng/μl）5μl。

第三个RT-LAMP反应体系（25μL）：2×酶溶液（RM）12.5μl、引物组合物丙溶液 2.5μl（含PBGD-FIP40pmol、PBGD-BIP40pmol、PBGD-FLP20pmol、PBGD-BLP20pmol、 PBGD-F35pmol和PBGD-B35pmol）、酶溶液（EM）1.0μl、去离子水（DW）4.0μl、总 RNA溶液（总RNA溶液中的RNA浓度为20ng/μl）5μl。

每个RT-LAMP反应体系均设置如下空白对照：用5μl去离子水代替RT-LAMP反应 体系中的5μl总RNA溶液。

三个RT-LAMP反应程序相同，均如下：63℃1小时，80℃5分钟，4℃保存。从 反应开始时刻即采用Loopamp浊度仪（厂家：日本荣研化学株式会；型号：LA-320C； 参数：光源为ED（波长650mm），检出器为光电二极管）实时检测60分钟。

第一个RT-LAMP反应体系的实时检测见过见图4A。

第二个RT-LAMP反应体系的实时检测见过见图4B。

第三个RT-LAMP反应体系的实时检测见过见图4C。

CK19基因的检出时间为12min、PIP基因的检出时间为18min、PBGD基因的检出 时间为16min。

进行三次重复实验，结果一致。

实施例2、通过Loopamp浊度仪检测细胞中的目的基因的灵敏度

1、采用天根生化科技（北京）有限公司的细胞/细菌总RNA提取试剂盒(货号：DP430) 提取MCF-7细胞的总RNA，-80℃冻存。

2、将步骤1得到的总RNA溶液，用去离子水进行梯度稀释，分别得到RNA浓度为 1ng/μl、10^-1ng/μl、10^-2ng/μl、10^-3ng/μl、10^-4ng/μl、10^-5ng/μl、10^-6ng/μl 和10^-7ng/μl的稀释液。

3、以步骤1提取总RNA溶液为模板，分别进行三个体系的RT-LAMP。

RT-LAMP反应体系与实施例1的步骤三中的RT-LAMP反应体系的区别仅在于用5μl 步骤2制备的稀释液代替5μl总RNA溶液。

RT-LAMP反应程序同实施例1的步骤三。

第一个RT-LAMP反应体系的实时检测见过见图5A。自左至右的曲线依次代表RNA 浓度由高至低的各个稀释液。灵敏度为10^-4ng/μl。

第二个RT-LAMP反应体系的实时检测见过见图5B。自左至右的曲线依次代表RNA 浓度由高至低的各个稀释液。灵敏度为10^-2ng/μl。

第三个RT-LAMP反应体系的实时检测见过见图5C。自左至右的曲线依次代表RNA 浓度由高至低的各个稀释液。灵敏度为10^-2ng/μl。

进行三次重复实验，结果一致。

实施例3、通过Loopamp浊度仪检测临床样本并与GeneSearch方法进行比较

1、采用试剂盒（QIAGEN公司，RNeasy Mini Kit(250)，货号：74106）提取已经 医院确诊的乳腺癌患者的前哨淋巴结的总RNA，进行GeneSearch法的检测（Blumencranz  P,Whitworth PW,et al.Scientific Impact Recognition Award.Sentinel node  staging for breast cancer:intraoperative molecular pathology overcomes  conventional histologic sampling errors.Am J Surg.2007Oct;194(4):426-32.）， 剩余的总RNA-80℃冻存。

2、以步骤1提取总RNA溶液为模板，分别进行三个体系的RT-LAMP。

RT-LAMP反应体系与RT-LAMP反应程序均同实施例1的步骤三。

根据与GeneSearch前50例结果的对比分析，确认RT-LAMP检测的阈值（即CK19 基因的检出时间为16min、PIP基因的检出时间为20min、PBGD基因的检出时间为 20min，如果待测样本扩增曲线的出现时间位置为该阈值以内，判断为阳性，否则判断 为阴性）进行结果评判。与GeneSearch检测结果不符的标本至少进行三次重复实验， 以出现次数多的结果为准。

101个GeneSearch法判断为阳性的前哨淋巴结中，有94个经RT-LAMP检测为阳 性，即相比于GeneSearch法，RT-LAMP法的敏感性为93.1%。253个GeneSearch法判 断为阴性的前哨淋巴结中，有249个经RT-LAMP检测为阴性，即相比于GeneSearch 法，RT-LAMP法的特异性为98.4%。RT-LAMP法与GeneSearch法的总体符合率为 96.9%(343/354)，统计学分析Kappa=0.923P<0.0001，说明两者结果一致。

一个典型的阳性结果见图6A,3个基因的检出时间均为阈值以内。一个典型的阴 性结果见图6B，PGBD基因的检出时间为阈值以内，CK19基因和PIP基因的检出时间 均为阈值以外。