一株用于异麦芽酮糖生产的甘蔗克雷伯菌

摘要

本发明公开了一种从甘蔗根部土壤样品中分离获得的异麦芽酮糖生产菌甘蔗克雷伯菌，是通过从甘蔗根部收集土壤样品、在蔗糖固体平板上稀释涂平板分离单菌落、蔗糖液体培养基中培养、薄层层析检测异麦芽酮糖和高效液相色谱法分析培养液中各种糖生成组分的比例等步骤获得的。其特征在于能够将蔗糖异构化为异麦芽酮糖，且产物中仅有低于1%的葡萄糖和果糖副产物。本发明中催化蔗糖转化为异麦芽酮糖的酶为a-葡萄糖基转移酶，是以蔗糖为诱导剂诱导本发明中的甘蔗克雷伯菌生成的。

说明书

技术领域

本发明专利涉及一种微生物菌，能够合成α-葡萄糖基转移酶，催化蔗糖生物转化为异麦芽酮糖，用于异麦芽酮糖生产。

背景技术

异麦芽酮糖(α-D-吡喃葡糖基-1,6-D-果糖,Isomaltulose),又称帕拉金糖,是一种葡萄糖和果糖以α-1,6-糖苷键结合形成的还原性二糖,天然存在于蜂蜜,但是含量极低。作为蔗糖的异构体,其口感和物理性质与蔗糖非常相似,而甜度只有蔗糖的一半。由于异麦芽酮糖特殊的生理功能，作为一种健康食品添加剂，在特定条件下可以作为蔗糖替代品应用于食品工业。

异麦芽酮糖几乎不能被牙菌斑形成细菌尤其是可变链球菌所利用,并且能减少不溶性葡聚糖及其酸的生成,从而防止可变链球菌吸附到牙齿表面并减少牙釉质的局部脱钙作用，具有防龋齿活性。异麦芽酮糖在人体内,只能被小肠处的肠道微生物分解成葡萄糖和果糖而被消化吸收，但由于其分解速度很慢,摄入异麦芽酮糖后,能长时间缓慢提供能量，而不会引起血液中葡萄糖和胰岛素的急速上升,从而成为糖尿病患者的健康食品。同时,健康人或糖尿病患者食用异麦芽酮糖不会引起任何胃肠不适和血脂变化。

异麦芽酮糖是以蔗糖为原料，经微生物合成的α-葡萄糖基转移酶（EC.5.4.99.11）催化蔗糖异构化后而得到的，迄今已发现某些微生物能够将蔗糖转化为异麦芽酮糖，如Serratia、Erwinia、Protaminobacter和Klebsiella等几个细菌属中的微生物种，具代表性的菌种主要包括Protaminobacter rubrum、Serratia plymuthica和Klebsiella planticola。已经发现的微生物中多数催化产物以异麦芽酮糖为主（75-80%）,但同时也伴随有海藻酮糖和葡萄糖与果糖形成。其中的葡萄糖和果糖的存在严重影响异麦芽酮糖的产品质量和功能性，必须采用树脂分离等技术分离除去，导致生产成本大幅提高，因此,α-葡萄糖基转移酶催化蔗糖异构化产物的多样性成为异麦芽酮糖工业生产的主要障碍。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效生产异麦芽酮糖的微生物菌，能够将蔗糖直接转化为异麦芽酮糖，而产物中仅有极低浓度的葡萄糖和果糖。

本发明是一种命名为LI8的甘蔗克雷伯菌，是一株纯培养细菌株，分类学鉴定为甘蔗克雷伯菌（Klebsiella sugarcanna），保藏编号为：CCTCC M 2013153，该菌株能够合成α-葡萄糖基转移酶，在催化蔗糖异构化为异麦芽酮糖的产物中，异麦芽酮糖含量为88.9％，海藻酮糖为10.3%，葡萄糖和果糖为0.8%。其技术解决方案为：

通过从甘蔗根部收集土壤样品、在蔗糖固体平板上稀释涂平板分离单菌落、蔗糖液体培养基中培养、薄层层析（TLC）检测异麦芽酮糖的合成和高效液相色谱（HPLC）法分析检测蔗糖异构化产物中各种糖组分比例等步骤，获得异麦芽酮糖生产菌。

本发明中所述的甘蔗克雷伯菌（Klebsiella sugarcanna），在2013年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2013153，保藏单位地址为：武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编：430072。

对于上述技术方案中，所述的从土壤中分离甘蔗克雷伯菌的步骤包括：

将从甘蔗根部收集的土壤样品悬浮于无菌生理盐水中，在蔗糖固体平板上进行系列稀释涂平板，在30°培养箱中培养24小时，挑取单菌落接种到蔗糖液体培养基中，并在30°C摇床中振荡培养（150转/分）过夜，薄层层析法检测发酵上清液中是否含有异麦芽酮糖。用高效液相色谱分析检测产生异麦芽酮糖的培养上清液中的糖组分比例，选取一株能够产生最高浓度异麦芽酮糖且葡萄糖和果糖含量较低的单菌落用于本发明，并命名为LI8，该菌落在蔗糖固体平板上的形态特征为圆形、光滑、白色不透明。其中，

所述蔗糖固体平板培养基组成为：20～25g蔗糖，4.5～5.5g酵母粉，0.45～0.55g硫酸镁，0.8-1.0g磷酸氢二钾，15-20g琼脂，1000g水，pH7.0～7.2。

所述蔗糖液体培养基组成为：38～42g蔗糖，4.5～5.5g蛋白胨，3.5～4.5g酵母粉，1000g水，pH7.0～7.2。

所述薄层层析法为：取0.5μl发酵上清液点样在硅胶薄层层析板上，于展开槽中展开后显色，展开剂组成为乙酸乙酯-乙酸-水的体积比4:3:0.8，显色剂为本胺（4％）-二本胺（4％）-磷酸（85％）的体积比5:5:1，显色温度为80°C，显色时间为5分钟，异麦芽酮糖形成典型的黄绿色斑点。

所述高效液相色谱法为：采用Waters 2690系统，层析柱为糖分析专用柱（4.6×250毫米），检测器为Waters 2410折光指数检测器，样品用70％的乙氰水溶液洗脱，洗脱液流速为1毫升/分，根据峰面积计算糖含量及产物比例。

本发明中的其他相关分析方法为：

α-葡萄糖基转移酶测定方法：取0.1毫升培养液与0.4毫升溶解于20mM磷酸缓冲溶液（pH7.0）的2wt％蔗糖溶液混合，于30°C水浴中反应10分钟，立即加入1.5毫升3,5-二硝基水杨酸试剂终止酶反应，并在沸水浴中加热5分钟后冷却，在波长520nm处测定吸光度值，通过异麦芽酮糖标准曲线确定还原糖含量。一个酶活力单位定义为：在上述反应条件下，每分钟催化蔗糖异构化形成1μmol异麦芽酮糖所需要的酶量。

3,5-二硝基水杨酸试剂配制方法：将6.9g结晶酚溶于15.2mL10%氢氧化钠中，并稀释至69mL，加入6.9g亚硫酸氢钠，制成甲液；将255g酒石酸钠溶于300mL10%氢氧化钠中，再加入880mL1%的3,5-二硝基水杨酸溶液，制成乙液；将甲乙液混合后，并贮于棕色试剂瓶中，室温下放置7～10天，即制成3,5-二硝基水杨酸试剂。

本发明的有益效果

采用本发明中的甘蔗克雷伯菌生产异麦芽酮糖时，产物中仅含有低于1%的葡萄糖和果糖副产物，因而在后续制糖工艺中无需分离纯化就可直接浓缩结晶，既可大幅降低生产成本，又节省大量生产用水。

具体实施方式：

实施例1

从甘蔗根部收集土壤样品，取1g悬浮于100mL无菌生理盐水中，平板稀释法涂布于蔗糖固体平板上，于30°C培养箱中培养24小时，随机选择平板上的单菌落，挑取菌落的一部分接种于新鲜蔗糖固体平板上，30°C培养箱中培养16小时，用于菌种保存。菌落的另外一部分接种于蔗糖液体培养基中，于30°C震荡培养（150转/分钟）16小时，薄层层析法检测培养液中是否有异麦芽酮糖生成。选择含有异麦芽酮糖的培养液，高效液相色谱法分析检测培养液中的糖组成分，选择生产异麦芽酮糖含量最高、葡萄糖和果糖含量最低的菌用于本发明，为了保证本发明菌的纯度，在蔗糖固体平板上采用划线法培养，挑取一株单菌落用于本发明，并命名为LI8。该菌具有克雷伯菌属所具有的全部关键生理生化特征：革兰氏阴性，兼性厌氧，氧化酶阴性，不运动，杆状，产生荚膜，而且本发明中的16S rDNA基因序列与其他已知克雷伯菌的同源性均在97～99.2%之间，说明本发明中的LI8菌属于克雷伯菌。但本发明中的LI8菌与已知的克雷伯菌属中的各个种相比，又有明显的不同，包括产生吲哚和10°C时生长，而且与其他克雷伯菌的DNA-DNA杂交率都在3.4-28.2%范围，说明本发明中的LI8与其他已知克雷伯菌不同，因此命名为甘蔗克雷伯菌（Klebsiella sugarcanna），表示是从甘蔗根部土壤中分离获得的。

上述生理生化特征、DNA杂交和16S rDNA序列比较都采用微生物学鉴定用常规方法，相关参考书可查。

实施例2

将甘蔗克雷伯菌由保存斜面接种到蔗糖固体培养基斜面中，于30°C培养箱中活化培养过夜后，接种于50mL种子培养基中，30°C摇床震荡（150转/分钟）培养6小时后，按1%接种量接种到100mL发酵培养基中，在30°C和150转/分钟条件下培养10小时，高效液相色谱法检测培养液中的产物成分。结果显示，培养液中的糖组分比例为：88.9％异麦芽酮糖，10.3%海藻酮糖，0.8%葡萄糖和果糖。

所述种子培养基组成为：1.5g蔗糖，0.3g酵母粉，0.2g蛋白胨，0.05g硫酸镁，0.07g磷酸二氢钠，0.06g硝酸钠，100g水，pH7.0～7.2。

所述发酵培养基配方为：4g蔗糖，0.2g酵母浸粉，0.15g蛋白胨，100g水，pH7.0～7.2。

上述所用高效液相色谱法为：采用Waters 2690系统，层析柱为糖分析专用柱（4.6×250毫米），检测器为Waters 2410折光指数检测器，样品用70％的乙氰水溶液洗脱，洗脱液流速为1毫升/分，根据峰面积计算糖含量及产物比例。

实施例3

按实施例2方法活化种子培养液后，按1%接种量接种到含有不同碳源的基础培养基（50mL）中，在30°C和150转/分钟条件下培养10小时，检测培养液中的α-葡萄糖基转移酶活性。结果发现只有含有蔗糖、棉籽糖、果糖和异麦芽酮糖的培养液中有α-葡萄糖基转移酶生成，其中蔗糖诱导生成最大活力的α-葡萄糖基转移酶。各种碳源培养基中α-葡萄糖基转移酶活性如表1所示。

碳源α-葡萄糖基转移酶活性（U/mL）蔗糖15.8棉籽糖13.9果糖11.2异麦芽酮糖4.5葡萄糖0乳糖0木糖0阿拉伯糖0纤维二糖0半乳糖0蜜二糖1.7

表1

所述基础培养基组成为：1.5g蛋白胨，0.5g硫酸镁，1g磷酸氢二钾，1g氯化钠，1000g水，pH7.0～7.2。

上述所用碳源包括：蔗糖、棉籽糖、果糖、异麦芽酮糖、葡萄糖、乳糖、木糖、阿拉伯糖、纤维二糖、蜜二糖和半乳糖。