一种白细胞介素-1受体拮抗剂突变体

摘要

本发明属于生物医药领域，具体地，本发明公开了五种白细胞介素-1受体拮抗剂突变体、其制备方法和用途。本发明公开的白细胞介素-1受体拮抗剂突变体具有与白介素-1受体亲和力更高、生物活性更好的优点。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明公开了一种生物受体拮抗剂 突变体。

背景技术

白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)是一种存在于人体的蛋白质类细胞因 子受体拮抗剂，通过结合白细胞介素-1(IL-1)受体，特异性地封闭IL-1的活 性。美国食品和药物管理局(FDA)在2001年11月批准Amgen公司的IL-1Ra (商品名Kineret)上市，治疗常规药物无效的顽固性类风湿关节炎。这是继美 国Immunex公司的重组肿瘤坏死因子受体(商品名Enbrel)上市后，第二个上 市的治疗类风湿关节炎的基因工程药物。

1990年，美国Synergen公司的Eisenberg等人在英国Nature杂志首次报 道了克隆IL-1Ra的全长cDNA的结果，发现IL-1Ra与IL-1在结构上有同源性， 在基因定位上与IL-1的2个亚型基因连锁，并且重组IL-1Ra能够特异性抑制 IL-1的活性，这是第一个被发现的内源性细胞因子受体拮抗剂，为治疗炎症性 疾病提供了新的途径。由于IL-1Ra的广谱抗炎作用，它还有可能在多种炎症性 疾病的治疗中发挥疗效。例如，动物实验证明，IL-1Ra能有效治疗狗的骨关节 炎、大鼠脑缺血再灌损伤、大鼠肠炎模型、豚鼠哮喘模型、小鼠肺纤维化、大 鼠肾小球肾炎、小鼠移植物抗宿主反应等。我国学者发表的论文也证实IL-1Ra 能有效治疗小鼠急性肺损伤、兔的严重角膜烧伤、大鼠角膜移植免疫排斥反应、 大鼠实验性肝纤维化等。因而，IL-1Ra具有广阔的临床应用前景。目前，IL-1Ra 开发的一个主要障碍是它的临床应用剂量很大，治疗类风湿关节炎需要每针 75-150毫克的剂量，因此目前仍需要活性更高的白细胞介素-1受体拮抗剂。

发明内容

本发明的申请人在已有的白细胞介素-1受体拮抗剂：IL-1Ra野生型(其氨 基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ.I.D.NO1、SEQ.I.D.NO2所示)X线衍射 晶体结构的基础上，对其活性中心附近的氨基酸进行了随机突变，获得了与白 介素-1受体亲和力更高、生物活性更佳的突变体。

本发明公开了五种白细胞介素-1受体拮抗剂突变体，分别为SEQ.I.D.NO.1 氨基酸的第9位、第26位、第40位氨基酸单点突变，其中第9位赖氨酸突变 为亮氨酸或异亮氨酸、第26位精氨酸突变为赖氨酸、第40位缬氨酸突变为亮 氨酸和SEQ.I.D.NO.1氨基酸的第9位、第26位、第40位氨基酸三点突变， 其中第9位赖氨酸突变为异亮氨酸、第26位精氨酸突变为赖氨酸、第40位缬 氨酸突变为亮氨酸。

本发明还公开了上述白细胞介素-1受体拮抗剂突变体的制备方法，包括首 先IL-1Ra野生型基因的获得然后获得各种突变体基因、IL-1Ra(突变体)表达 载体构建、目的基因的表达和目的蛋白的纯化四个步骤，其中表达质粒为 pET-22b(+)质粒，转化宿主菌为BL21(DE3)。

得到的目的蛋白通过活性实验检测，结果表明野生型白细胞介素-1受体拮 抗剂：IL-1Ra野生型中和拮抗IL-1的生物活性为国外已上市的Kineret(N端 甲硫氨酸形式的白细胞介素-1受体拮抗剂)的2倍，各突变体的生物活性均优 于野生型，其中三点突变的生物活性最好，为野生型的5倍。

本发明公开的上述白细胞介素-1受体拮抗剂突变体可以用来制备治疗炎症 性疾病药物中的用途，其中炎症性疾病包括关节炎、肠炎、哮喘、肺纤维化、 肾小球肾炎、移植物抗宿主反应、急性肺损伤、严重角膜烧伤、类风湿性关节 炎。本发明公开的上述白细胞介素-1受体拮抗剂突变体优选用于类风湿关节炎 的治疗。

附图说明

图1：人IL-1Ra基因RT-PCR扩增结果1.RT-PCR扩增产物；2.DNA Marker， 自上而下为2、1、0.75、0.5、0.25、0.1kb；

图2：pET-22b(+)物理结构图：其中T7为T7启动子，lacI为lacI编码区， ori为复制起始位点，Ap为氨苄青霉素抗性基因，fl origin为fl复制起始位点；

图3：pET-22b(+)/IL-1ra物理结构图，相应部位同图2；

图4：含有人IL-1Ra cDNA的T载体双酶切图谱，其中1、2、3为质粒双酶切 产物，4为DNA Marker，自上而下为21、5.1、4.9、1.9、1.38、1.37、0.95、 0.56kb；

图5：rhIL-1Ra诱导表达SDS-PAGE电泳分析，M：分子量标准(自上而下为 97.4、66.2、43、31、20.1、14.4kD)；1：诱导前菌体全蛋白；2～6：诱导1，2， 3，4，5小时菌体全蛋白；

图6：rhIL-1Ra诱导表达全菌及裂解物SDS-PAGE电泳分析，M：分子量标准 (自上而下为97.4、66.2、43、31、20.1、14.4kD)；1-2：菌体全蛋白；3-4： 菌体裂解后上清；5，6：菌体裂解后沉淀；

图7：rhIL-1Ra免疫印迹分析M：分子量标准(自上而下为43、29、18、14.4kD)； 1：实施例3产品；2：Kineret；

图8：生物活性比较结果，其中■为Kineret，Wild type为野生型，Mutant 1为第9位赖氨酸突变为亮氨酸，Mutant 2为第9位赖氨酸突变为异亮氨酸，Mutant 3为第26位精氨酸突变为赖氨酸，Mutant 4为第40位缬氨酸突变为亮氨酸，Mutant 5为第9位赖氨酸突变为异亮氨酸、第26位精氨酸突变为赖氨酸、第40位缬氨酸 突变为亮氨酸。

具体实施方式

以下实施例、实验例仅仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明 的限制。

实施例1野生型IL-1Ra基因及各型突变体基因的获得

取健康志愿者外周血15ml，密度梯度离心去除红细胞，收集淋巴细胞体外 培养并加PHA刺激。培养结束收集淋巴细胞，用Trizol试剂抽提总RNA。

根据Genebank公布的IL-1Ra基因序列设计PCR引物：

引物1(SEQI.D.NO 3)：

5’TTGCCATATGCACCATCATCATCATCATGACGACGACGACAAGCGTCCGTCTGGGAGA

引物2(SEQ I.D.NO 4)：

5’ATTGAAGCTTCTACTCGTCCTCCTGGAA

设计序列时，在起始密码子ATG之前，加入了Nde I的酶切位点；在起始密码子 之后，加入了His标签蛋白及EK酶切位点；而在最后一个氨基酸Glu之后，立 即有TAG作为终止密码，其后是Hind III的酶切位点。引物序列与IL-1Ra胞内 可溶性蛋白152个氨基酸基因序列的两端互补。引物设计时将起始密码ATG之 后的第36、39碱基A、C分别改为了大肠杆菌偏爱密码T、G，由于兼并密码子 编码的氨基酸不变，因此对表达产物的氨基酸序列没有影响。

在0.5ml微量反应管中，24μl反应液中加入3’端引物200pmol/L，总RNA 15μg，70℃加热5分钟后加入第一链缓冲液(TAKARA公司)、RNsin(Progema 公司)、AMV逆转录酶(TAKARA公司)、dNTPs(TAKARA公司)，混合反应物于42℃ 反应1小时。

逆转录结束后于20μl反应液中加入5’端引物、PCR缓冲液、Taq DNA聚合 酶(TAKARA公司)，覆盖石蜡油。扩增条件为：94℃变性1分钟，65℃退火1分 钟，72℃延伸1.5分钟，共30个循环，最后于75℃延伸5分钟。电泳检测扩增 片段大小约为480bp，见图1。将扩增基因装入T Vector(Promega公司)中， 转化TG1菌株(Novagen公司)，测序验证无误，其氨基酸和核苷酸序列分别为 SEQ.I.D.NO1、SEQ.I.D.NO2所示。

Mutant1(K9L)基因

根据拟引入的点突变设计overlap PCR引物：

引物3(SEQI.D.NO 5)：5’CTGGGAGAAAATCCAGCTTGATGCA

引物4(SEQ I.D.NO 6)：5’ATTCTGAAGGCTTGCATCAAGCTGG

引物1’(SEQ I.D.NO 13)：5’TTGCCATATGCACCATCATCATCAT

以野生型基因为模板，分别以引物1’与引物4、引物3与引物2进行PCR，反 应条件同前，再以反应产物为模板，引物1’与引物2进行overlap PCR。将扩 增基因装入T Vector(Promega公司)中，转化TG1菌株(Novagen公司)，测 序验证无误。

Mutant2(K9I)基因

根据拟引入的点突变设计overlap PCR引物：

引物5(SEQ I.D.NO 7)：5’CTGGGAGAAAATCCAGCATCATGCA

引物6(SEQ I.D.NO 8)：5’ATTCTGAAGGCTTGCATGATGCTGG

以野生型基因为模板，分别以引物1’与引物6、引物5与引物2进行PCR，反 应条件同前，再以反应产物为模板，引物1’与引物2进行overlap PCR。将扩 增基因装入T Vector(Promega公司)中，转化TG1菌株(Novagen公司)，测 序验证无误。

Mutant3(R26K)基因

根据拟引入的点突变设计overlap PCR引物：

引物7(SEQ I.D.NO 9)：5’AGAAGACCTTCTATCTGAAGAACAA

引物8(SEQ I.D.NO10)：5’GCAACTAGTTGGTTGTTCTTCAGAT

以野生型基因为模板，分别以引物1’与引物8、引物7与引物2进行PCR，反 应条件同前，再以反应产物为模板，引物1’与引物2进行overlap PCR。将扩 增基因装入T Vector(Promega公司)中，转化TG1菌株(Novagen公司)，测 序验证无误。

Mutant4(V26L)基因

根据拟引入的点突变设计overlap PCR引物：

引物9(SEQ I.D.NO 11)：5’ACTTGCAAGGACCAAATCTCAATTT

引物10(SEQ I.D.NO 12)：5’ATCTTTTCTTCTAAATTGAGATTTG

以野生型基因为模板，分别以引物1’与引物10、引物9与引物2进行PCR，反 应条件同前，再以反应产物为模板，引物1’与引物2进行overlap PCR。将扩 增基因装入T Vector(Promega公司)中，转化TG1菌株(Novagen公司)，测 序验证无误。

Mutant5(R26K K9IV40L)基因

以Mutant3基因为模板，分别以引物1’与引物8、引物7与引物2进行PCR， 反应条件同前，再以反应产物为模板，引物1’与引物2进行overlap PCR。获 得中间MutantA。

以中间MutantA基因为模板，分别以引物1’与引物10、引物9与引物2 进行PCR，反应条件同前，再以反应产物为模板，引物1’与引物2进行overlap PCR。将扩增基因装入T Vector(Promega公司)中，转化TG1菌株(Novagen 公司)，测序验证无误，获得中间Mutant5。

实施例2IL-1Ra表达载体构建(以野生型基因为例，其余各型突变体构建方法 与野生型相同)

表达质粒为pET-22b(+)质粒，结构图见附件。插入目的基因后原质粒的peIB 引导序列被取代，示意图见图2及图3。

挑取含有测序质粒的重组TG1菌单克隆于LB培养液，过夜培养，小量质粒抽提 试剂盒提取质粒，用Nde I和HindIII双酶切含有上述目的基因的中间载体，电 泳回收480bp左右的小片段，结果见图4。将其插入用相同的两种酶酶切过的 pET-22b(+)载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)感受态细胞， 载体自连作为对照。

实施例3目的基因的表达(以野生型IL-1Ra为例，其余各型突变体表达方法与 野生型相同)

质粒酶切图谱鉴定为正确后，用该质粒转化感受态BL21/DE3大肠杆菌，挑 选10个克隆，分别接种在小试管中的LB培养基中，37℃振荡培养，待细菌生 长到OD_600nm＝0.6时，留少量细菌悬液于-20℃后加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG (TAKARA公司)，继续振荡培养，每隔1小时收获细菌直至5小时。

用15％SDS-PAGE观察不同克隆的细菌在加入IPTG之前以及之后的不同时 间点的蛋白表达情况，结果显示全部克隆均在诱导后增加了分子量20kDa左右 的蛋白条带。该条带分子量与文献报道的rhuIL-1Ra分子量一致，见图5。诱导 表达4小时，目的蛋白的表达量达到最高，继续诱导表达量不再提高。

取经IPTG诱导表达的菌体冻融破碎，离心收集上清和沉淀，用15％SDS-PAGE 电泳分析，结果目标蛋白主要在细胞破碎后的上清液中，表明IL-1Ra以可溶形 式表达，见图6。重组蛋白经小量纯化后，用免疫印迹的方法检测(步骤：15％ SDS-PAGE，半干法电转移至硝酸纤维素薄膜(200mA，30min)，用3％BSA将膜 封闭后加抗人IL-1Ra单抗(R&D Systems)，室温孵育1h后洗膜3次，再加入 过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗结合45min后，洗膜、显色)，结果提示IPTG 诱导表达的蛋白性质与进口对照品rhIL-1Ra(Kineret)一致，见图7。

实施例4目的蛋白的纯化(以野生型IL-1Ra为例，其余各型突变体纯化方法与 野生型相同)

发酵终止后，取出菌液，低速离心(5,000rpm，20分钟，4℃)，收集菌体， 用生理盐水洗涤一次，所有上清液待灭菌后弃去。将湿菌体称量，于-20℃保存。 取一定量的菌体，悬浮于适量的0.01mol/L PBS(pH 7.0)缓冲液中(菌体与悬 浮液的体积比为1；10)，冰浴下使用高压均质机进行碎菌，共3个循环；取样进 行染色涂片，显微镜下检查，基本无完整细胞，离心20,000rpm，20分钟，4℃， 收集上清。上清经连接了Ni2+的金属螯合柱纯化，获得以粗制IL-1Ra为主(纯 度大于70％)的蛋白溶液。

上述溶液加入一定量的重组牛肠激酶(rEK)(上海张江生物技术有限公司 产品)，2mmol/L CaCl₂，置21℃孵育20小时，将N端的Hi s标签蛋白及EK酶 切位点去除，获得IL-1Ra粗制品。

IL-1Ra粗制品经0.8μm滤膜过滤后采用强阳离子交换介质SP-Sepharose  Fast Flow在pH 6.2进行离子交换层析，大量的可溶性细菌杂蛋白、核酸、内 毒素等被去除，目标蛋白的纯度可以达到90％，收率在80％以上。提高pH至 8.5，进行DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析，可进一步去除残存的 细菌杂蛋白、细菌内毒素，使样品纯度达到98％以上，获得IL-1Ra精制品。

实验例5生物活性比较实验

材料：

测活细胞：A375.S2黑色素瘤细胞系ATCC CRL-1872。

培养液：为含10％新生小牛血清(NBS)，RPMI-1640/D’MEM(1∶1)培养液。

胰蛋白酶：0.25％胰蛋白酶溶解于细胞培养用PBS中

Kineret：Amgen公司产品。

方法：

1.用10mL培养液稀释IL-1至终浓度为4ng/mL。

2.用步骤1培养液稀释样品至800ng/mL，在96孔板中连续2倍比稀 释(最高浓度孔初始加入200μl，余孔各加入100μl稀释液，而后用多通 道加样器自最高浓度孔吸出100μl加入下一孔，吹匀后继续向下重复，至 最低浓度后吸出的100μl丢弃)，设置复孔。

3.取对数生长期的A375.S2细胞，胰蛋白酶消化，计数，普通培养 液调整细胞密度至8×10⁴/ml，加入96孔培养板中，0.1ml/孔。

4.96孔培养板置于37℃8％二氧化碳培养箱中培养。

5.72h后，加入新鲜配制的20；1混合的MTS/PMS溶液(Progema)20μl/ 孔，在孵箱中继续孵育3小时，用酶标仪测量其A₄₉₀-A₆₃₀值。

结果：

本发明中野生型IL-1Ra中和拮抗IL-1的生物活性约为Kineret的2倍，其余 各型突变体生物活性均优于野生型，其中以Mutant 5活性最佳，约为Kineret 的10倍。见图8。