血浆中肌苷含量的测定方法

摘要

本发明公开了一种测定人体血浆中肌苷含量的方法，它包括如下步骤：（a）在人体空白血浆250ul中加入肌苷标准品溶液25ul，配制成至少五份不同浓度的肌苷血浆溶液，再分别加入0.1ug/ml拉米夫定标准液25ul和4.25%磷酸溶液250ul，涡流混合，得混合溶液；将所述混合溶液分别加入经活化的HLB固相萃取柱中进行洗脱，弃洗脱液，再用1ml流动相溶液洗脱，收集洗脱液，离心，取上清液；（b）将经步骤（a）制得的上清液在特定的质谱和色谱条件下进行LC/MS/MS分析（c）基于步骤（b）的分析结果，用同样的方法建立当日的标准曲线及定量下限进行计算，得到待测人体血浆中的肌苷含量。

说明书

技术领域

本发明涉及医学检测领域，特别是涉及一种人体血浆中肌苷含量的测定方法。

背景技术

肌苷（Inosine），也称为次黄苷、次黄嘌呤核苷等。肌苷是人体的正常成分，为腺 嘌呤的前体，能直接透过细胞膜进入体细胞，参与体内核酸代谢、能量代谢和蛋白质的 合成。

研究证实：肌苷能活化丙酮酸氧化酶系，提高辅酶A的活性，活化肝功能，并使 处于低能缺氧状态下的组织细胞继续进行代谢，有助于受损肝细胞功能的恢复。并参与 人体能量代谢与蛋白质合成。肌苷能提高ATP水平并可转变为各种核苷酸。可刺激体 内产生抗体，还可提高肠道对铁的吸收，活化肝功能，加速肝细胞的修复。有增强白细 胞增生的作用。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种建立人体血浆肌苷LC/MS/MS测定标准曲线及定量下限的方 法。

本发明的另一目的是提供一种测定人体血浆中肌苷含量的方法。

具体地说，本发明第一方面是提供了一种建立人体血浆肌苷LC/MS/MS测定标准曲线及 定量下限的方法，它包括如下步骤：

（a）在人体空白血浆250ul中加入肌苷标准品溶液25ul，配制成至少五份不同浓度的肌 苷血浆溶液，再分别加入0.1ug/ml拉米夫定标准液25ul和4.25%磷酸溶液250ul，涡流混合， 得至少五份混合溶液；将所述混合溶液分别加入经活化的HLB固相萃取柱中进行洗脱，弃洗 脱液，再用1ml流动相溶液50mM CH₃COONH₂:CH₃OH=1:1洗脱，收集洗脱液，离心，取上 清液；

（b）将经步骤（a）制得的上清液在下述条件下进行LC/MS/MS分析

质谱条件：

Compound（化合物参数）：

肌苷母子离子对：269.1/137.1，time:400msec

拉米夫定母子离子对：230.2/112.2，time:200msec

Duration：4min

Cycles：393

DP=26

CE=15

CXP=4

CEP=4

Q1resolution：Unit

Q2resolution：Unit，

Source/Gas（离子源/气参数）：

Ion Source：Turbo Spray

Curtain Gas（CUR）：10

Collision Gas（CAD）：Medium

Ion Spray Voltage（IS）：5000

Temperature（TEM）：700

Ion Source Gas1（Gas1）：60

Ion Source Gas2（Gas2）：10

Interface Heater（ihe）：ON，

液相色谱条件：

色谱柱：Waters XBridge^TM C18，规格：3.5um，2.1× 100mm，Part No.:186003022，S/N: 01453030814045

流动相：50mM CH₃COONH₂:CH₃OH=1:1

流速：0.2ml/min

进样量：10ul

进样时间：4min；

（c）基于步骤（b）的分析结果，建立人体血浆肌苷LC/MS/MS测定的标准曲线及定量 下限。

在一优选例中，所述步骤（a）中还包括将所述混合溶液-70℃冻存的步骤。

在另一优选例中，所述不同浓度的肌苷血浆溶液为六份，其浓度分别为18.58ug/ml、37.16 ug/ml、74.31ug/ml、148.6ug/ml、297.25ug/ml和594.5ug/ml。

在另一优选例中，所述经活化的HLB固相萃取柱的活化步骤包括：使用VARIAN^TM VAC  ELUT SPS24固相萃取装置，将HLB固相萃取柱插入固定位置，先后使用1ml甲醇、1ml水 进行洗脱活化。

在另一优选例中，所述步骤（c）包括：以待测人体血浆肌苷浓度（X，ug/ml）为横坐标， 以待测人体血浆肌苷色谱峰面积（As）与内标色谱峰面积（Ai）的比值（Y=As/Ai）为纵坐 标，进行线性回归运算，求得人体血浆肌苷LC/MS/MS测定的标准曲线及定量下限。

本发明的第二方面是提供了一种测定人体血浆中肌苷含量的方法，它包括如下步骤：

（a）在待测人体血浆250ul中加入0.1ug/ml拉米夫定标准液25ul和4.25%磷酸溶液250ul， 涡流混合，得混合溶液；将所述混合溶液加入经活化的HLB固相萃取柱中进行洗脱，弃洗脱 液，再用1ml流动相溶液50mM CH₃COONH₂:CH₃OH=1:1洗脱，收集洗脱液，离心，取上清 液；

（b）将经步骤（a）制得的上清液在下述条件下进行LC/MS/MS分析

质谱条件：

Compound（化合物参数）：

肌苷母子离子对：269.1/137.1，time:400msec

拉米夫定母子离子对：230.2/112.2，time:200msec

Duration：4min

Cycles：393

DP=26

CE=15

CXP=4

CEP=4

Q1resolution：Unit

Q2resolution：Unit，

Source/Gas（离子源/气参数）：

Ion Source：Turbo Spray

Curtain Gas（CUR）：10

Collision Gas（CAD）：Medium

Ion Spray Voltage（IS）：5000

Temperature（TEM）：700

Ion Source Gas1（Gas1）：60

Ion Source Gas2（Gas2）：10

Interface Heater（ihe）：ON，

液相色谱条件：

色谱柱：Waters XBridge^TM C18，规格：3.5um，2.1×100mm，Part No.:186003022，S/N: 01453030814045

流动相：50mM CH₃COONH₂:CH₃OH=1:1

流速：0.2ml/min

进样量：10ul

进样时间：4min；

（c）基于步骤（b）的分析结果，用所述的建立人体血浆肌苷LC/MS/MS测定标准曲线 及定量下限的方法建立当日的标准曲线及定量下限进行计算，得到待测人体血浆中的肌苷含 量。

在一优选例中，所述步骤（a）中还包括将所述混合溶液-70℃冻存的步骤。

在另一优选例中，所述经活化的HLB固相萃取柱的活化步骤包括：使用VARIAN^TM VAC  ELUT SPS24固相萃取装置，将HLB固相萃取柱插入固定位置，先后使用1ml甲醇、1ml水 进行洗脱活化。

本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述， 本发明的特点、目的和优势将更为明显。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按 照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量 计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。 此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较 佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示 的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相 同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或 相似特征的一般性例子。

实施例1：建立人体血浆肌苷LC/MS/MS测定的标准曲线及定量下限

一、仪器与试药

1.仪器：

1)液质联用仪：AB Sciex3200Q TRAP LC/MS/MS SYSTEM(SER.No:AF22091001)，AB  SCIEX公司

2)固相萃取装置：VARIAN^TM VAC ELUT SPS24，WATERS公司

3)离心机：BECKMAN Avanti^TM30 Centrifuge（SER.No:GEY95G02），美国BECKMAN 公司

4)电子天平：Mettler－AE240双量程分析天平，Mettler公司

5)漩涡混合器：XW-80，上海医科大学仪器厂

2.试药、试剂及耗材：

1)空白血浆（O型Rh阳性，上海市血液中心，批号：20130100000031825）

2)肌苷标准品（中国药品生物制品检定所，批号：140669-201104）

3)拉米夫定（葛兰素史克，批号：12040022）

4)甲醇（色谱纯，Tedia公司，批号：1205441）

5)氨水（江苏昆山金城实际有限公司，批号：040608）

6)磷酸（色谱纯，Tedia公司，批号：101026）

7)乙酸（苏州振亚化工厂，批号：010517）

8)重蒸水（仁济医院自制）

9)色谱柱（Waters XBridge^TM C18，规格：3.5um，2.1×100mm），WATERS公司

10)HLB固相萃取柱：OASIS^TM HLB Cartridge（Part No.WATO94225），WATERS公 司

二、HLB固相萃取柱的活化

使用VARIAN^TM VAC ELUT SPS24固相萃取装置，将HLB固相萃取柱插入固定位置，先 后使用1ml甲醇、1ml水进行洗脱活化，备用。

三、将空白血浆置于常温水浴5分钟，分别取出250ul放于6个不同的试管中，每个试管分 别加入肌苷标准液25ul，依次配成相当于肌苷血浆浓度为18.58ug/ml、37.16ug/ml、74.31ug/ml、 148.6ug/ml、297.25ug/ml和594.5ug/ml的样品，并加入0.1ug/ml拉米夫定标准液25ul，涡旋30 秒，再加入4.25%磷酸溶液250ul并涡旋30秒。将6管混合液分别加入之前已完成活化的HLB小 柱中，洗脱，洗脱液弃之，再用1ml流动相溶液（50mM CH₃COONH₂:CH₃OH=1:1）洗脱，此 时收集洗脱液。将收集液在4℃下20000rpm高速离心10分钟，取上清液，样品即得。

以下述质谱、色谱条件进行LC/MS/MS分析

质谱条件：

Compound（化合物参数）：

肌苷母子离子对：269.1/137.1，time:400msec

拉米夫定母子离子对：230.2/112.2，time:200msec

Duration：4min

Cycles：393

DP=26

CE=15

CXP=4

CEP=4

Q1resolution：Unit

Q2resolution：Unit，

Source/Gas（离子源/气参数）：

Ion Source：Turbo Spray

Curtain Gas（CUR）：10

Collision Gas（CAD）：Medium

Ion Spray Voltage（IS）：5000

Temperature（TEM）：700

Ion Source Gas1（Gas1）：60

Ion Source Gas2（Gas2）：10

Interface Heater（ihe）：ON，

液相色谱条件：

色谱柱：Waters XBridge^TM C18，规格：3.5um，2.1×100mm，Part No.:186003022，S/N: 01453030814045

流动相：50mM CH₃COONH₂:CH₃OH=1:1

流速：0.2ml/min

进样量：10ul

进样时间：4min；

基于LC/MS/MS分析结果，建立肌苷的标准曲线，即分别以待测物肌苷的浓度（X，ug/ml） 为横坐标，以待测物肌苷的色谱峰面积（As）与内标拉米夫定色谱峰面积（Ai）的比值 （Y=As/Ai）为纵坐标，进行线性回归运算，求得标准曲线Y=0.0480X-0.0649。肌苷在18.58～ 594.5ug/ml范围内线性关系良好（r=0.9998）。肌苷的定量下限为18.58ug/ml。

实施例2：测定人体血浆中的肌苷含量

一、仪器与试药

1.仪器：

1)液质联用仪：AB Sciex3200Q TRAP LC/MS/MS SYSTEM(SER.No:AF22091001)，AB  SCIEX公司

2)固相萃取装置：VARIAN^TM VAC ELUT SPS24，WATERS公司

3)离心机：BECKMAN Avanti^TM30Centrifuge（SER.No:GEY95G02），美国BECKMAN 公司

4)电子天平：Mettler－AE240双量程分析天平，Mettler公司

5)漩涡混合器：XW-80，上海医科大学仪器厂

2.试药、试剂及耗材：

1)空白血浆（O型Rh阳性，上海市血液中心，批号：20130100000031825）

2)肌苷标准品（中国药品生物制品检定所，批号：140669-201104）

3)拉米夫定（葛兰素史克，批号：12040022）

4)甲醇（色谱纯，Tedia公司，批号：1205441）

5)氨水（江苏昆山金城实际有限公司，批号：040608）

6)磷酸（色谱纯，Tedia公司，批号：101026）

7)乙酸（苏州振亚化工厂，批号：010517）

8)重蒸水（仁济医院自制）

9)色谱柱（Waters XBridge^TM C18，规格：3.5um，2.1×100mm），WATERS公司

10)HLB固相萃取柱：OASIS^TM HLB Cartridge（Part No.WATO94225），WATERS公 司

二、收集待测人体血浆

从待测者上臂静脉抽取新鲜血液5ml，将存有新鲜血液的试管插入碎冰中，待所有血液 收集完毕，4℃、20000rpm高速离心10分钟，取上清液，得受试者血浆。

三、待测人体血浆的预处理

取受试者血浆250ul于1.5mlEP管内，加入0.1ug/ml拉米夫定标准液25ul，涡旋30秒， 再迅速加入4.25%磷酸溶液250ul，涡旋30秒，得预处理样品。将EP管置于试管架上，放于 低温冰箱-70℃冻存。若取血现场没有低温冰箱，可将存有预处理样品的EP管放于试管架上， 缓慢放入存有适当容量液氮的泡沫容器内（液氮的液面不宜超过EP管的高度）速冻，存放 至少2min。操作过程必须做好防护措施，注意安全。（在相对密闭的操作室内，并带好防冻 手套，缓慢放入。）待混合液完全冻干后，将EP管放于充满干冰的泡沫容器中，迅速运至拥 有低温冰箱的实验室中-70℃冻存，预处理样品放于干冰的时间不宜超过1天。

将存于低温冰箱的上述预处理的样品取出，置于室温下水浴溶解10min。待完全溶解后 将混合液加入之前已完成活化的HLB小柱（同实施例1）中，洗脱，洗脱液弃之，再用1ml 流动相溶液（50mM CH₃COONH₂:CH₃OH=1:1）洗脱，并收集。将收集液在4℃下20000rpm 高速离心10分钟，取上清液，即得。

四、检测待测人体血浆中的肌苷含量

以上述质谱、色谱条件（同实施例1）进行LC/MS/MS分析，按实施例1的方法建立当 日的标准曲线及定量下限进行计算，得到待测人体血浆中的肌苷含量。

实施例3：本发明的肌苷测定方法的方法学验证

3.1.专属性

分别取6份不同健康人的空白血浆各250ul，除不加内标拉米夫定溶液25ul而改用甲醇 水溶液25ul以外，其余按实施例2的方法操作；取一定浓度的肌苷标准液25ul替代加入空白 血浆，其余按实施例2的方法操作；取受试者给药后的血浆样品，按实施例2的方法处理。 结果表明，在选用条件下，血浆中内源性物质不干扰被测物和内标的测定，专属性良好。

3.2.精密度和准确度

按实施例1的方法制备血浆浓度为28.5ug/ml、57ug/ml、228ug/ml的质控样品，每个浓 度进行6份样本分析，连续测定3d，根据当日标准曲线，计算QC样品测得的浓度。根据QC 样品结果计算本法的精密度和准确度，结果表明，日间、日内相对标准差（RSD）<15%，准 确度均在85%～115%范围内。表明血浆样品分析的精密度和准确度良好。详见表1。

表1.肌苷测定方法的精密度与准确度（n=6）

3.3.回收率和基质效应

按实施例1的方法制备血浆浓度为28.5ug/ml、57ug/ml和228ug/ml的质控样品，每一浓 度进行6份样本分析，得到肌苷和内标拉米夫定的峰面积值Anva和Arop。

向1.5ml EP管中分别加入250ul空白血浆，加入4.24%磷酸溶液250ul，涡旋30秒。将6 管混合液分别加入已完成活化的HLB小柱（同实施例1.）中，洗脱，洗脱液弃之，再用1ml 流动相溶液（50mM CH3COONH2:CH3OH=1:1）洗脱，并收集。将收集液在4℃下20000rpm 高速离心10分钟，取上清液并转移至另一干净的1.5ml试管中，分别精密加入肌苷浓度为（28.5 ug/ml、57ug/ml、228ug/ml）低、中、高对照液25ul和拉米夫定对照溶液（0.1ug/ml）25ul， 每一浓度6份样本分析，涡旋30s，取10ul进样分析，得到肌苷和内标拉米夫定的峰面积值 Bnva和Brop。

分别精密加入浓度为28.5ug/ml、57ug/ml和228ug/ml的肌苷标准液25ul，加入纯净水 250ul，每一浓度进行6份样本分析，其余按实施例2的方法操作，10ul进样分析得到肌苷和 内标拉米夫定的峰面积值Cnva和Crop。

计算得出，肌苷的提取回收率为99.69±0.71%，内标拉米夫定的平均提取回收率为 108.73±4.55%。肌苷的平均基质效应为91.96±3.53%，内标拉米夫定的平均基质效应为 99.3±1.50%。提取回收率及基质效应均在规定范围内。

3.4.稳定性

稳定性考察按照前述方法配制低、中、高三个浓度（28.5ug/ml、57ug/ml和228ug/ml） 的肌苷血浆样品。血浆样品按实施例2的方法操作后，分别对肌苷血浆样品处理后立即测定、 室温放置24h，-70℃冻融3次的稳定性。结果表明，肌苷的浓度均保持稳定，未出现明显变 化。（测得浓度与加入浓度的相对标准偏差均小于±15%）。

3.5.肌苷血浆浓度测定

对2名健康人24h血浆内肌苷浓度进行测定，按实施例2的方法进行操作处理，测得第 一名健康受试者的肌苷浓度范围为33.66～66.70ug/ml；第二名的肌苷浓度范围为23.22～59.82 ug/ml。

本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神 之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申 请所附权利要求的覆盖范围。