一株具有邻二甲苯降解能力的动胶菌及其应用

摘要

本发明涉及一株具有邻二甲苯降解能力的动胶菌（Zoogloearesiniphila）HJ1，其保藏编号为CCTCCNO.M2012235。邻二甲苯有机污染物中的应用。本发明还提供具有邻二甲苯降解能力的动胶菌HJ1在降解苯、甲苯、乙苯、二甲苯、氯苯有机污染物中的应用。本发明所述的动胶菌HJ1能高效降解邻二甲苯等苯系污染物，耐受能力强。

说明书

技术领域

本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株具有邻二甲苯降解能力的动胶菌（Zoogloea resiniphila）HJ1及其应用。

背景技术

邻二甲苯(C₈H₁₀，O-xylene) 是生产苯酐（邻苯二甲酸酐，PA）、染料、杀虫剂等的化工原料，其中90%左右用于生产苯酐。其蒸气与空气形成爆炸性混合物，遇明火、高热能引起燃烧爆炸。其蒸气比空气重，能在较低处扩散到相当远的地方，遇火源引着回燃。若遇高热，容器内压增大，有开裂和爆炸的危险。若流速过快，容易产生和积聚静电。　对皮肤、粘膜有刺激作用，对中枢神经系统有麻醉作用；长期作用可影响肝、肾功能。急性中毒：病人有咳嗽、流沮、结膜充血等重症者有幻觉、谵妄、神志不清等，有的有癔病样发作。邻二甲苯已被美国环保署（EPA）列为129种优先控制的有毒污染物之一。因此研究邻二甲苯的净化技术就显得十分迫切和重要。

生物净化技术具有去除效率高、处理费用低、二次污染小等特点，逐渐被广泛应用于有毒污染物的降解和净化。采用生物技术处理邻二甲苯的关键之一便是获得具有高效降解邻二甲苯能力的菌株。目前，国内外学者已对苯系化合物的生物降解进行了大量研究，迄今分离到的邻二甲苯降解菌主要包括红球菌（Rhodococcus）、假单胞菌(Pseudomonas)等。大量研究表明从环境中分离筛选高效邻二甲苯降解菌，仍然是消除环境中BETX污染物的重要方法之一。

本发明中的动胶菌（Zoogloea resiniphila）是一种常见的短杆菌，在专利号为201010249613.0，专利名称为“用于污水处理厂增效的复合高效微生物制剂及增效工艺”的中国专利中公开了一种使用动胶菌、从毛单胞菌、芽孢杆菌、假单胞菌、产碱杆菌和诺卡菌多种菌类制成的复合制剂，用于处理各种污水，尤其是高含盐和高氨氮污水。经检索专利和其他相关文献，尚未发现利用该菌种降解邻二甲苯的报道。该降解菌的发现对于工业废水废气中BETX等苯系污染物的高效净化具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中的不足而提供一种高效、耐受能力强的具有邻二甲苯降解能力的动胶菌及其应用。

本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：一株具有邻二甲苯降解能力的动胶菌（Zoogloea resiniphila）HJ1，菌株16S rDNA 的GenBank登陆号为JQ751310，该菌株保藏于中国典型物保藏中心，地址：中国 武汉  武汉大学，430072，保藏编号为：CCTCC NO. M2012235。该菌株的特征为：菌落呈白色，边缘整齐，光滑湿润。透射电镜下观察该菌体的形态为短杆菌，有鞭毛，革兰氏染色阴性，氧化酶阳性。

本发明提供具有邻二甲苯降解能力的动胶菌HJ1在降解邻二甲苯有机污染物中的应用。

本发明还提供具有邻二甲苯降解能力的动胶菌HJ1在降解苯、甲苯、乙苯、二甲苯、氯苯有机污染物中的应用。

本发明将所述具有邻二甲苯降解能力的动胶菌HJ1经培养获得的菌悬液投入到含邻二甲苯的污水中，在温度为25-35℃，pH值为7-9的条件下培养。

本发明所述具有邻二甲苯降解能力的动胶菌HJ1在废水中最佳培养温度为35℃，pH7，邻二甲苯降解速率为5.33 mg/(L·h)。

本发明所述的具有邻二甲苯降解能力的动胶菌HJ1降解邻二甲苯浓度范围为0-256 mg/L，最大比降解速率为0.19 mg 邻二甲苯 /(mg cells·h)。

本发明所述的具有邻二甲苯降解能力的动胶菌HJ1把邻二甲苯最终转化为CO₂、H₂O和细胞生物量，其平均产率系数为0.2572 mg cells/mg邻二甲苯，平均矿化率为54.8%。

本发明与现有技术相比具有以下优点：能实现工业废水废气中BETX等苯系污染物，尤其是邻二甲苯的高效净化，且不产生任何二次污染。容易推广，净化成本低。

附图说明

图1为Zoogloea resiniphila HJ1的革兰氏染色照片。

图2为Zoogloea resiniphila HJ1的透射电镜照片。

图3 为Zoogloea resiniphila HJ1的系统发育树图。

图4为Zoogloea resiniphila HJ1对32mg/L、64 mg/L、96 mg/L、128 mg/L、160 mg/L邻二甲苯的降解曲线、降解过程中细胞生物量变化曲线。

图5为Zoogloea resiniphila HJ1对192 mg/L、224 mg/L、256 mg/L、288 mg/L邻二甲苯的降解曲线、降解过程中细胞生物量变化曲线。

图6为Zoogloea resiniphila HJ1对邻二甲苯比降解速率拟合曲线。

图7为Zoogloea resiniphila HJ1在降解邻二甲苯的过程中CO₂生成量拟合曲线。

图8为Zoogloea resiniphila HJ1在降解邻二甲苯的过程中细胞生物量生成曲线。

图9为Zoogloea resiniphila HJ1对工业常见有机污染物降解性能分析。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一、Zoogloea resiniphila HJ1的分离、纯化及其鉴定。

1. Zoogloea resiniphila HJ1的分离及纯化。

Zoogloea resiniphila HJ1是从新昌制药厂废水处理站的活性污泥中驯化、分离得到的一株革兰氏阴性菌。具体步骤如下：

取新昌制药厂废水处理站的活性污泥，自来水淘洗五次后，空曝48h，尽量去除残留的有机物。配制无机盐培养液（pH7），以邻二甲苯为唯一碳源对活性污泥进行定向驯化，2 d更换新鲜无机盐培养液，每天测定培养液的pH。配制邻二甲苯初始浓度为100 mg/L无机盐培养基，配制方法如下：1g/L KH₂PO₄，4.5g/L Na₂HPO₄，0.5g/L (NH₄)₂SO₄，0.1g/L MgSO₄，0.02g/L CaCl₂，0.1mg/L MnSO₄·4H₂O，0.1mg/L ZnSO₄·7H₂O，0.02mg/L CuSO₄·5H₂O，0.02mg/L CoCl₂·6H₂O，0.02 mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，1mg/L FeSO₄·7H₂O，0.02mg/L H₃BO₃，pH 7.3~7.55。分装于250 mL的密封盐水瓶（50 mL/个），110℃灭菌40 min。待培养基冷却后，加入邻二甲苯作为唯一碳源，将驯化的污泥按体积分数为5%的量加入到培养基中，于30℃，160 rpm的摇床振荡培养。3d左右以10%的量转接到新鲜灭菌后的无机盐培养基中，摇床振荡培养。结合琼脂无机盐平板划线分离，挑取单菌落接入无机盐培养基摇床继续振荡培养，直到获得在上述培养基中生长快、菌落规则和性状稳定的可降解邻二甲苯的单菌。

2. Zoogloea resiniphila HJ1的鉴定

通过16S rDNA序列分析和生理生化实验鉴定，确定菌株HJ1为Zoogloea resiniphila。具体步骤如下：

采用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒(V2.2，上海申能博彩生物科技有限公司)提取和纯化菌株的DNA，4℃保存。选用细菌的通用引物BSF8/20和BSR1541/20对纯化的DNA进行PCR扩增，引物序列分别为：

 BSF8/20：5'-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3'

BSR1541/20：5'-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3'

PCR反应程序设定为：94°C预变性4 min；然后94°C变性1 min，59°C退火1 min，72°C延伸1.5 min，循环35个周期；然后72°C 延伸10 min；最后4°C 保持10 min。将PCR产物进行测序（上海英潍捷基），测序结果见序列表。

将菌株HJ1的16S rDNA序列上传到Genbank，获得Genbank的登录号JQ751310，同时同Genbank中的基因序列进行同源性比较，发现其属于Zoogloea属，与Zoogloea resiniphila strain DhA-35（NR027188）同源性最高,达到99%。将该菌株命名为Zoogloea resiniphil HJ1，并于2012年6月18日在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉 武汉大学，邮编430072）保藏，保藏号为CCTCC NO.M2012235。

 实施例二、Zoogloea resiniphila HJ1对不同浓度邻二甲苯的降解性能检测。

在最佳环境因子条件（培养液pH7，培养温度35℃）下，考察了菌株LX-1对初始浓度32-288mg/L 邻二甲苯的降解性能。结果表明，菌株HJ1能完全降解32-256 mg/L 邻二甲苯，但只能部分降解初始浓度为288 mg/L邻二甲苯。在最佳培养条件下，菌株最大比降解速率达到了0.19 mg o-xylene /(mg cells·h)。具体实施步骤如下：

配制pH=7的无机盐培养液1000 mL，分装于250mL的盐水瓶中，每瓶50mL，110℃灭菌40 min。待培养液冷却后，取其中10瓶加入处于对数生长期的HJ1菌悬液，加入邻二甲苯作为唯一碳源，使其浓度达到32、64、128、160、192、224、256、288 mg/L；设置空白对照。盐水瓶密封后35℃振荡培养，定时测定培养液中残留的邻二甲苯浓度及生物量，绘制菌株HJ1对于不同初始浓度邻二甲苯很的降解曲线，并计算相应的比降解速率。

图4~6为菌株HJ1以不用初始浓度邻二甲苯的降解曲线。结果表明，当邻二甲苯浓度低于256 mg/L时，菌株HJ1可完全降解；但菌株HJ1未能实现对288 mg/L邻二甲苯的完全降解，132 h后其残留浓度约为113.5 mg/L。当邻二甲苯浓度低于160 mg/L时，菌株HJ1的生物量随着邻二甲苯的浓度升高而增大；当邻二甲苯的浓度为160-224 mg/L时，菌株的生物量保持不变，维持在46 mg/L左右；当邻二甲苯的浓度上升至256 mg/L时，菌株的生物量下降至36.6 mg/L；当邻二甲苯浓度进一步上升至288 mg/L时，菌株的生物量进一步下降至15.5 mg/L。同时通过Haldane’s抑制生长动力学模型对比降解速率进行了拟合，获得了最大比降解速率。当邻二甲苯浓度为20 mg/L时，邻二甲苯比降解速率达到最大值0.19h^-1。

 实施例三、Zoogloea resiniphila HJ1对邻二甲苯的矿化率和平均产率系数分析。

在最佳环境因子条件（培养液pH7，培养温度35℃）下，考察了菌株Zoogloea resiniphila HJ1对初始邻二甲苯浓度32-258 mg/L的矿化率和平均产率系数。结果表明，所述的菌株HJ1可以把邻二甲苯最终转化为CO₂、H₂O和细胞生物量，平均矿化率为54.8%，平均产率系数为0.2572 mg cells/mg o-xylene。具体实施步骤如下：

将菌悬液接种于32、64、92、128、160、192、224、256以及288 mg/L以邻二甲苯为唯一碳源的降解培养基中，密封，在35℃、pH=7.5条件下培养。测定培养瓶内的初始菌浓度及CO₂浓度。然后，待降解完全时加入盐酸，静置半小时，然后测定最终菌浓度以及CO₂浓度。根据CO₂浓度的变化情况计算邻二甲苯的矿化率，根据菌浓度变化计算菌株降解邻二甲苯的产率系数。

结果如图7~8所示。当邻二甲苯浓度低于192 mg/L时，CO₂生成量与邻二甲苯消耗量成线性增长；当邻二甲苯浓度高于192 mg/L时，CO₂生成量趋于稳定。当邻二甲苯浓度低于192 mg/L时，CO₂生成量和邻二甲苯消耗量的拟合关系为y=1.821x，此即CO₂生成量和邻二甲苯消耗量的比率，即消耗1mg邻二甲苯可以产生1.821mgCO₂。理论上，当邻二甲苯完全为H₂O和CO₂时，CO₂生成量和邻二甲苯消耗量的关系为y=3.32x。这表明邻二甲苯被菌株HJ1完全降解时，C的矿化率为54.8%。当邻二甲苯浓度低于192 mg/L时，生物量与邻二甲苯消耗量成线性增长；当甲苯浓度高于192 mg/L时，生物量急剧下降。当甲苯浓度低于192 mg/L时，菌株浓度对甲苯消耗浓度拟合度(R²)大于0.99，直线的斜率即为细胞产率系数，为0.2572 mg cells/mg o-xylene。

 实施例四、Zoogloea resiniphila HJ1对工业常见有机污染物降解性能分析

分别以苯、甲苯、乙苯、氯苯等工业中常见的有机污染物作为唯一碳源，考察菌株Zoogloea resiniphila HJ1对于这些物质的降解能力。结果表明，菌株HJ1能不同程度地降解上述有机污染物，能较为完全地降解苯系物，对氯苯、环己烷等的降解率在8-42%。具体实施方案如下：

配制pH为7.3、盐浓度（以NaCl计）为0.66%的无机盐培养液800 mL，分装于250 mL的盐水瓶中，每瓶50 mL，110℃灭菌40 min。待培养液冷却后，取其中8瓶加入处于对数生长期HJ1菌悬液，使初始生物量达到38.4 mg/L（以湿菌体计），分别以苯、甲苯、乙苯、氯苯等作为唯一碳源，初始浓度均为100 mg/L；另取8瓶加入相同量的上述有机物但不加入HJ1菌悬液作为空白对照。盐水瓶密封后置于33℃的摇床振荡培养，分别于48h分析液相中残留的有机物浓度，测定相应的生物量，计算各物质的降解率。

结果如图9所示。有机污染物的分子结构、接受或提供电子的能力决定了其化学稳定性，并影响微生物对有机物的吸附和转移能力，从而决定有机物的可生物降解性。由于BETX都具有苯环的结构，菌株HJ1具有相关加氧酶，能将BETX有效地催化降解。菌株HJ1不能降解具有苯环结构的氯苯，可能是由于苯环上的Cl使亲电取代反应钝化。而卤代甲烷，十四烷、石油醚 (主要成分为戊烷与己烷)，环己烷以及环己烯等化合物的结构与BETX的差别较大，故菌株HJ1不能对其进行完全降解。以上试验结果说明，菌株Zoogloea resiniphila HJ1能降解多种常见有机污染物，对于该菌株用于实际工业污染治理具有一定的指导意义。

虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。

<110> 浙江工业大学

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<212> DNA

<213>动胶菌（Zoogloea resiniphila）

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