棉花同源结构域转录因子基因GbHDTF1及应用

摘要

本发明属于植物基因工程领域，涉及从海岛棉中分离得到一个调控棉花内源抗病相关激素茉莉酸合成和响应的基因GbHDTF1。该基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示；其编码蛋白质的序列如SEQ ID NO：2所示。还公开了含有SEQ ID NO.1所示序列的基因的表达载体，通过表达由上述核酸序列形成的双链核酸分子并用于抑制棉花内源基因GbHDTF1的表达以促进茉莉酸的合成及响应。提供了含有表达载体的宿主细胞，其包括大肠杆菌和农杆菌。GbHDTF1基因具有调控棉花内源抗病相关激素茉莉酸合成和响应的功能，通过遗传转化可应用于抗黄萎病棉花新材料的培育。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种棉花同源结构域转录因子基因GbHDTF1的克隆及在控制棉花黄萎病中的应用。本发明通过采用转录组测序的方法，对棉花抗黄萎病反应相关基因的转录组分析，分离克隆的GbHDTF1基因为调控棉花抗病相关激素茉莉酸合成及响应的基因，能影响棉花对黄萎病的抗性。 

背景技术

棉花黄萎病被称为棉花的“癌症”，是由大丽轮枝菌和黑白轮枝菌引起的土传真菌维管束病害。病原菌通过棉花根部侵染，引起叶片失绿变黄，萎蔫脱落，甚至造成植株死亡，严重威胁棉花产量及纤维品质。棉花黄萎病于1914年在美国被首次发现后，很快蔓延到世界上其他产棉国。随着1935年从美国引种棉花黄萎病传入中国，20世纪50-60年代在部分省份造成危害，20世纪90年代后，该病已经蔓延到全国各棉区，是目前危害我国棉花生产的主要病害之一，对棉花常年造成减产10-20%，严重时部分地区发病高达70%（简桂良等,Current statusand countermeasure of Verticillium wilt of cotton in China.中国棉花,2003,(3):13-14）。近年来棉花黄萎病在我国发生日趋严重，特别是在黄河流域和新疆等主要棉产区大面积发生。长期的植物生产实践表明选育和种植抗病棉花品种是防治棉花黄萎病的高效措施。但由于陆地棉抗黄萎病资源缺乏及田间抗病性鉴定结果受多种环境因素影响，传统育种方法选育抗黄萎病品种进展缓慢，因此生产上还没有高抗棉花黄萎病的品种大面积推广应用。 

同源盒基因家族是一类广泛存在于各种真核生物体内的同源结构域转录因子，参与生物体的生长发育和对环境的响应。同源盒基因编码的蛋白都包含一个由60个氨基酸组成的DNA结合区域，称为同源结构域或同源框（Homeodomain，HD）。同源结构域在三维结构上形成3个相邻的α螺旋，其中第二个和第三个螺旋形成一个螺旋-转角-螺旋结构。根据氨基酸序列的相似性，植物体内的同源结构域转录因子可以分为14类（R.Derelle,P.Lopez,Homeodomain proteins belong to the ancestral molecular toolkit of eukaryotes.Evol Dev,2007,(9):212-219）。 

茉莉酸（JA）是一种脂肪酸源的信号分子，参与了植物花粉和种子的发育，以及对伤口、臭氧、昆虫和病原微生物的防御反应（Creelman R A,Mullet J E.Biosynthesis and action of jasmonates in plants.Ann Rev Plant Physiol Plant MolBiol,1997,(48):355-381）。茉莉酸和乙烯（ET）参与不依赖SA的防卫反应。在这一过程中硫素（thionin,Thi1.2,一种含半胱氨酸的植物抗病蛋白）和防卫素（defensin,PDF1.2）会被诱导表达。PDF1.2受JA、ET和非寄主病原真菌（Alternaria brassicola）的诱导表达，但不受SA的诱导。同时发现在npr1和cpr1（constitutive PR1）突变体中及NahG转基因植株中PDF1.2的表达都不受影响，而在ein2和coi1（coronatine insensitive1）突变体中表达受到抑制，这些突变体对JA和 ET是不敏感的。而Thi1.2和PDF1.2的表达模式相同。说明Thi1.2和PDF1.2参与依赖JA和ET的系统抗病途径是不同于依赖SA的SAR途径，PDF1.2的表达需同时依赖于JA和ET(Reymond P,Farmer E E,Jasmonate and salicylate as global signals for defense gene expression.Curr Opin Plant Biol,1998,(1):404-411)。 

虽然在拟南芥及水稻中克隆到了许多茉莉酸相关的基因，但目前对于棉花，茉莉酸合成及其详细调控网络仍不是很清楚。本发明证明了GbHDTF1能参与调控棉花体内茉莉酸的合成以及下游信号的传递，从而参与棉花抗黄萎病。申请人认为利用本发明的基因可通过调控激素响应来影响棉花对黄萎病菌的抗性，对创制抗黄萎病的棉花材料具有极其重要的理论和现实意义。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，在前期研究工作中通过对海岛棉（Gossypium barbadense）受黄萎病菌（Verticillium dahliae）诱导的转录组进行分析的基础上，克隆一个可能参与棉花抗黄萎病反应的基因。通过氨基酸序列分析发现其具有同源结构域转录因子的特征，我们将该基因命名为GbHDTF1基因。通过病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术，在陆地棉（Gossypium hirsutum）中沉默GbHDTF1基因，表明该基因可调控棉花抗病激素茉莉酸（JA）合成及相关信号路径，并增强棉花对黄萎病菌的抗性。 

本发明的另一个目的在于提供了一种用GbHDTF1基因进行高效转化棉花的方法。还提供了一种含有SEQ ID NO：1所示序列基因的表达载体，该载体通过表达由上述核酸序列形成的双链核酸分子并用于抑制棉花内源基因GbHDTF1的表达。本发明还提供了一种含有以上表达载体的宿主细胞，所述的宿主细胞包括大肠杆菌和农杆菌。 

本发明再一个目的是在于提供了一种棉花同源结构域转录因子GbHDTF1在控制棉花抗黄萎病中的应用，即通过调控GbHDTF1基因在棉花植株中的表达来达到调控棉花茉莉酸的合成和响应，从而应用于棉花抗黄萎病品系的培育。 

本发明GbHDTF1基因的表达载体转化的宿主是棉花，可用于培育抗黄萎病的棉花品系和品种。 

实现本发明的技术方案如下所述： 

本发明是申请人前期工作是研究海岛棉‘海7124’接种黄萎病菌后根部转录组测序的数据（徐理等,Lignin metabolism has a central role in the resistance of cotton to the wilt fungus Verticillium dahliae as revealed by RNA-Seq-dependent transcriptional analysis and histochemistry.J Exp Bot,2011,(62):5607-5621），发现一个在接种黄萎病菌后表达下调的基因。将此基因利用半定量PCR（RT-PCR）鉴定表明该基因在抗病的海岛棉‘海7124’中具有组织表达特异性，在子叶、真叶和纤维中优势表达（图1A）。该基因在叶片接种黄萎病菌‘V991’（中国农科院植物保护所简桂良副研究员惠赠）和灰霉病菌（华中农业大学李国庆教授惠赠）后与接水的对照相比表现出下调模式（图1B），并且在喷施植物抗病信号分子水杨酸和茉莉酸甲酯之后，相对与喷施无水乙醇的对照分别表现出被诱导和被抑制的表达，而其他激素（包括赤霉素、生长素和乙烯利）处理后，相对于水处理的对照GbHDTF1基因表达没有变化（图1C）。 

在海岛棉‘海7124’的总DNA、RNA中扩增得到GbHDTF1的DNA、cDNA和ORF序列。一种棉花同源结 构域转录因子基因，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，序列长度为1044bp。 

通过氨基酸序列比对确定SEQ ID NO：1所编码的氨基酸序列SEQ ID NO：2具有同源结构域转录因子的结构特征（图2）。因此我们认为这个序列为一个同源结构域转录因子基因，将该基因命名为GbHDTF1。 

本发明还提供了棉花同源结构域转录因子基因GbHDTF1在控制棉花抗黄萎病中的应用，其应用方法是： 

在将TRV-GbHDTF1载体利用农杆菌接种生长2周的陆地棉品系‘YZ1’(Jin，Identification of a novel elite genotype for in vitro culture and genetic transformation of cotton.Biologia Plantarum,2006,50:519-524）。经农杆菌转化3周后对沉默棉花植株分单株提取叶片和根部的RNA，对沉默棉花植株进行GbHDTF1的表达量分析。表达分析显示GbHDTF1沉默的棉花幼苗中GbHDTF1基因的表达相对对照植株明显下降（图4A）。 

将GbHDTF1沉默后的棉花幼苗用于棉花黄萎病菌接种处理。通过对照植株和GbHDTF1基因沉默植株接种后植株表型和发病情况统计进行分析，表明GbHDTF1基因沉默之后棉花对黄萎病菌的抗性显著提高，表现为具有黄萎病病症的棉株明显减少（图4B）。病指和发病率的统计也表明发病植株的发病程度在GbHDTF1基因沉默植株中的显著降低（图4C）。通过以上分析说明转GbHDTF1基因沉默棉花的抗病性与GbHDTF1表达量降低相关联。 

此外，利用QRT-PCR方法对GbHDTF1沉默棉花植株和对照植株中的茉莉酸信号路径的标志基因GbLOX1，GbOPR3，GbAOS，GbMYC2，GbJAZ1，GbJAZ3和GbJAZ6的表达量进行了分析（图5A），结果表明GbHDTF1基因沉默之后能激活棉花茉莉酸的合成和响应相关的信号路径。利用对照植株和GbHDTF1基因沉默植株叶片提取激素，并进行激素含量测定，发现GbHDTF1基因沉默茉莉酸含量上升。证明在棉花中沉默GbHDTF1基因对茉莉酸的合成以及下游响应有正向调控作用。因此GbHDTF1基因可能是一个负调控棉花体内茉莉酸合成的基因，通过调控GbHDTF1基因表达水平可以影响棉花抗黄萎病，对培育棉花抗黄萎病品系具有重要意义。 

与现有技术相比，本发明具有以下优点： 

从抗病的海岛棉‘海7124’受黄萎病菌诱导的转录组中鉴定了参与棉花抗黄萎病反应的基因GbHDTF1，并对其完成了分离克隆、功能验证和应用。GbHDTF1基因编码的蛋白质具有同源结构域转录因子的典型特征。GbHDTF1基因具有负调控茉莉酸合成及响应的功能，通过遗传转化可应用于棉花抗黄萎病品系的培育，同时可作为棉花抗黄萎病反应的标志基因。 

1.本发明克隆GbHDTF1基因对棉花茉莉酸合成和响应有显著影响，这对阐明GbHDTF1的生物学功能和进一步研究植物茉莉酸和合成调控网络有重要意义。 

2.抑制表达GbHDTF1的棉花能显著增强对黄萎病菌的抗性，同时提高茉莉酸合成和响应信号路径的相关基因表达量，这说明GbHDTF1基因对棉花茉莉酸的合成及响应影响很明显，通过基因工程技术精确调控GbHDTF1基因的表达量能够控制棉花体内茉莉酸的合成。 

3.茉莉酸的合成调控直接影响植物抗病性，通过基因工程技术精确调控GbHDTF1基因的表达量能够起到控制棉花茉莉酸合成的目的，GbHDTF1基因的克隆将有助于棉花抗黄萎病材料的创制。 

4.选育抗病的棉花材料一直为棉花育种家所重视，调控棉花茉莉酸合成响应基因的发现和利用将有助于解决生产上棉花抗黄萎病性差的难题。由于目前生产上黄萎病发生造成的棉花产量损失巨大，使得选育抗黄萎病的品种显得尤其重要，GbHDTF1基因的克隆和功能验证将有助于培育高抗的棉花品种。 

5.通过GbHDTF1基因深入探讨棉花茉莉酸合成和响应的分子机理以及茉莉酸在棉花与黄萎病菌互作过程中的作用具有重要的理论意义和应用价值。 

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的GbHDTF1基因的核苷酸序列，序列长度为1044bp。 

序列表SEQ ID NO：2是GbHDTF1基因编码蛋白质的氨基酸序列，其编码347个氨基酸。 

图1为一种利用RT-PCR检测发现GbHDTF1在棉花不同组织、不同病原菌和激素诱导处理情况下的表达差异。其中：图1A：GbHDTF1在不同棉花组织中中表达量的示意图，该基因子叶、真叶和纤维中表达量最高。图1B：用黄萎病菌和灰霉病菌接种后GbHDTF1在叶片中下调表达。图1C：GbHDTF1在生长素、赤霉素和乙烯利处理下无变化。在水杨酸、茉莉酸处理之后GbHDTF1分别表现出上调和下调的基因表达模式。 

图2为一种采用DNAMAN软件对GbHDTF1蛋白质序列和拟南芥AtOCP3、水稻OsGF14c-int、葡萄VvSS0AEB28YD18、蕃茄SlLEFL1032DD01蛋白序列进行比对分析的示意图。结果表明GbHDTF1具有PINTOX类同源结构域转录因子的典型特征PINTOX结构域和同源结构域HD。 

图3：是本发明构建的三种质粒载体的图谱，其中：图3A、图3B和图3C分别为一种通过病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）载体构建pTRV2-GbHDTF1，RNAi载体pHellsgate4-GbHDTF1和超量表达载体pK2GW7.0-GbHDTF1的物理图谱。 

图4为一种通过VIGS技术在陆地棉品系‘YZ1’中沉默该基因之后棉花接种黄萎病菌的分析示意图。 

利用RT-PCR技术检测对照植株和沉默植株中GbHDTF1表达量，证实产生表型的沉默植株体内GbHDTF1基因的表达量在根和叶片中均显著低于对照植株（图4A），表明沉默植株GbHDTF1基因通过VIGS技术被抑制。 

通过伤根接种法接种棉花黄萎病菌‘V991’表明，干涉植株的抗性明显增强，植株发病率，病指均显著低于对照（图4B，图4C）。 

图5为一种利用QRT-PCR的方法鉴定GbHDTF1的的沉默植株中茉莉酸信号途径相关标志基因的表达变化以及测定茉莉酸含量变化的示意图。茉莉酸合成途径相关标志基因GbLOX1、GbOPR3和GbAOS，茉莉酸响应相关基因GbMYC2和GbJAZ3的表达量均高于对照植株（图5A），干涉植物的茉莉酸含量也高于对照植株（图5B）。 

具体实施方式

实施例1：GbHDTF1基因分离克隆 

本发明申请人前期工作是研究海岛棉‘海7124’（中国棉花种质资源库，北京，中国农业科学院，作物品种资源研究所）接种黄萎病菌后根部转录组测序的数据，发现一个在接种黄萎病菌后表达下调的基因。 

利用已得到的EST序列在棉花D基因组数据库中（http://www.phytozome.net/cotton.php）进行序列比对，得到与基因匹配的候选DNA序列，以该DNA序列为模板，设计引物GbHDTF1-OE-F（5' GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGCTTCTGCTTTGTCAGT3'）和GbHDTF1-OE-R（5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCACATTGTCATCCCTAAACAGTAAAC3'），在海岛棉‘海7124’的总DNA、cDNA中分别扩得GbHDTF1的DNA、cDNA和ORF序列。一种棉花同源结构域转录因子基因，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，序列长度为1044bp。 

通过用DNAMAN软件将GbHDTF1氨基酸序列与其他物种中的同源结构域转录因子进行比对确定SEQ ID NO：1所编码的氨基酸序列SEQ ID No：2具有同源结构域转录因子的结构特征（图2）。因此我们认为这个序列为一个同源结构域转录因子基因，并将该基因命名为GbHDTF1。 

实施例2：GbHDTF1在棉花不同组织的表达分析和对植物抗病信号分子的响应 

以海岛棉‘海7124’为材料，提取根、茎、子叶、真叶、纤维、胚珠、花瓣和花药8个不同组织的RNA，提取方法为异硫氢酸胍法（Zhu等,An improved simple protocol for isolation of high quality RNA from Gossypium spp.suitable for cDNA library construction.Acta Agronomica Sinica.2005,31:1657-1659）。RNA提取完成后后用DNaseI(购自Promega公司)处理，RNA完整性通过1.2%（w/v）琼脂糖胶（EtBr）电泳检测（5V/cm）。核酸浓度的测定在Beckman DU800spectrophotometer（购自美国贝克曼公司）上进行。RNA260/280比值在1.9到2.1之间，260/230比值大于2.0的RNA用于下一步的分析。用RT-PCR检测GbHDTF1基因的表达水平。cDNA的合成是以3μg总RNA为模版，与1μl500μg/ml oligo-dT（15）引物（购自Promega公司，美国），1μl10mM dNTP，DEPC-water混合，总体积为12μl；然后65℃变性5min冰上骤冷；再加入8μl含有4μl RT buffer，2μl0.1M dithiothreitol，40units ofRibonuclease Inhibitor（购自Promega公司），和200units of Superscript III RT（购自美国Invitrogen公司）的混合液；50℃温浴1h合成第一链；反应结束后75℃处理15min使SuperscriptIII RT失活。每份cDNA稀释到300μl后-20℃保存待用。以上述反转录合成的cDNA为模板，以实施例1中获得的基因设计特异引物GbHDTF1Rt-F（5'GGCTTCTGCTTTGTCAGTGAACT3'）和GbHDTF1Rt-R（5'CGTCGTTGCCGTCTTCCTC3'）对GbHDTF1基因进行PCR扩增。同时用引物UB7-F（5'GAAGGCATTCCACCTGACCAAC3'）和UB7-R（5'CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG3'）对棉花GhUbi7（GenBank登陆号：DQ116441）基因做特异扩增，作为内对照进行相对半定量分析。结果表明：本发明克隆的基因GbHDTF1在棉花各个组织中表达具有组织特异性，在子叶、真叶和纤维中表达量最高。 

对照植株和GbHDTF1沉默植株叶片接种黄萎病菌‘V991’（中国农科院植物保护所简桂良副研究员惠赠）和灰霉病菌（华中农业大学李国庆教授惠赠），接水作为对照，接种方法为：保存于-80℃的病原菌孢子置于含有PDA培养基的平皿上活化4天，挑取直径7cm的菌块于另一PDA平皿上，生长7天之后在平皿中加入5ml蒸馏水，用涂布器轻刮菌落表面将病原菌孢子洗脱到蒸馏水中。孢子液用双层医用纱布过滤，在显微镜下对孢子液浓度进行统计。利用蒸馏水稀释孢子液至其终浓度分别为10⁷孢子/ml（黄萎病菌）和10⁵孢子/ml（灰霉病菌），然后对对照植株和GbHDTF1沉默植株叶片分别进行喷施，以蒸馏水喷施作为对照。病原菌接种之后在0h、6h、12h和24h取样，分离RNA进行RT-PCR鉴定。 

对照植株和GbHDTF1沉默植株叶片进行激素诱导处理，具体方法是：赤霉素（GA,购自SIGMA公司）、 生长素（吲哚乙酸即IAA,购自SIGMA公司）和乙烯利（ETH,购自SIGMA公司）用蒸馏水溶解，使终浓度分别为0.5μM、5μM和200μM。茉莉酸甲酯（MeJA,购自SIGMA公司）和水杨酸（SA,购自SIGMA公司）用乙醇溶解，终浓度分别为100μM和10mM。对对照植株和GbHDTF1沉默植株叶片进行喷施，蒸馏水和乙醇喷施作为对照。病原菌接种之后在0h、0.5h、1h和3h取样，分离RNA进行RT-PCR鉴定。利用引物GbHDTF1Rt-F和GbHDTF1Rt-R对GbHDTF1基因进行PCR扩增。同时用引物UB7-F和UB7-R作为内对照进行相对半定量分析。结果表明：该基因在海岛棉‘海7124’接种黄萎病菌‘V991’和灰霉病菌后与接水的对照相比表现出表达下降模式（图1B），并且在植物抗病信号分子水杨酸和茉莉酸甲酯的诱导之后，相对与喷施乙醇的对照分别表现出被诱导和被抑制的表达，而其他激素（包括赤霉素、生长素和乙烯利）处理后表达没有变化（图1C）。 

实施例3：病毒干涉载体、RNAi抑制表达载体和超量表达载体的构建和VIGS介导的转化 

根据GbHDTF1的基因序列设计了如下引物：正向引物GbHDTF1-trv-s（5'CGACGACAAGACCCTGGCGAGGAAGACGGCAACGAC3'），反向引物GbHDTF1-trv-a（5'GAGGAGAAGAGCCCTATGTTTGGTTTCAGGCATTGGT3'），再以GbHDTF1基因cDNA为模板进行PCR扩增，得到的产物及pTRV：RNA2载体（荷兰瓦格宁根大学Thomma博士惠赠）质粒分别用限制性内切酶BamH1和Kpn1(购自NEB公司，中国)进行双酶切。将酶切后的PCR产物与酶切回收的pTRV：RNA2质粒片段用T4连接酶(购自Invitrogen公司，美国)进行连接，连接产物即为病毒沉默载体pTRV2-GbHDTF1（见图3A）（图4A），将该载体进行热激转化（按照大肠杆菌转化说明书操作），转入大肠杆菌TOP10（购自天根生化科技（北京）有限公司）中，挑取单克隆用引物GbHDTF1-trv-s和GbHDTF1-trv-a进行检测，检测后的阳性克隆扩繁后提取质粒，再转化农杆菌GV3101（Roger等，A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.Trends in plant science.2000.5,1360-1385.）。检测后于-80保存备用（图4A）。 

设计GbHDTF1基因的RNAi抑制表达载体构建引物，在引物的两端分别加上用于重组的attB位点序列及保护碱基，即正义引物5’端加上5'GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGC3'接头，反义引物5’端加上5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTG3'接头，分别将该引物命名为GbHDTF1-RI-s（5'GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGC GGCTTCTGCTTTGTCAGTGAACT3'）和GbHDTF1-RI-a（5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTG CGTCGTTGCCGTCTTCCTC3'），再以GbHDTF1基因cDNA为模板进行PCR扩增，得到的产物通过BP重组反应（BP重组反应试剂盒购自Invitrogen,美国)导入RNAi载体pHellsgate4(购自Invitrogen,美国）。RNAi载体见Wesley等(Construct design for efficient,effective and high-throughput gene silencing in plants.Plant J.2001.27:581-590)，构建得到RNAi载体pHellsgate4-GbHDTF1（见图3B）。 

根据GbHDTF1基因的ORF设计引物，分别将该引物命名为：GbHDTF1-OE-F和GbHDTF1-OE-R。再以GbHDTF1 基因的DNA为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物通过BP反应构建到中间载体pDNOR221（购自Invitrogen公司，美国）上，BP反应体系（5μl）如下：PCR产物2μl，pDNOR221载体1μl，BP酶（购自Invitrogen公司，美国）1μl，TE（pH8.0）1μl。然后再将含有GbHDTF1基因的pDNOR221载体和pK2GW7.0（购自比利时国立根特大学）载体进行LR重组反应，将GbHDTF1基因构建到pK2GW7.0的载体上，从而获得超量表达载体pK2GW7.0-GbHDTF1（该表达载体含有如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，见图3C）。LR反应体系（5μl）如下：含有GbHDTF1基因的pDNOR221载体1μl，pK2GW7.0载体2μl，LR酶（购自Invitrogen公司）1μl，TE（pH8.0）1μl。所述的超表达载体pK2GW7.0-GbHDTF1含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，以及植物表达载体pK2GW7.0（图3C）。 

VIGS介导的棉花基因沉默的方法参考Fradin等（Fradin,E.F.,Z.Zhang,et al.2009.Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Vel.Plant Physiol150(1):320-332）。具体步骤为：将带有质粒TRV:RNA1,TRV:RNA2和TRV:GbHDTF1的农杆菌菌株在50μg/mL Kanamycin（购于Sigma公司）LB培养皿上活化。接种前两天，挑取一个单克隆接种于5ml LB培养液。培养液中加入50μg/mL Kanamycin。在摇床上28℃，转速50rpm过夜。将活化后的菌液分别接种于100ml含有50μg/mL的Kanamycin LB培养液中，并加入10mM MES(2-(4morpholino)-ethane sulfonic acid)，20μM乙酰丁香酮。于28℃转速50rpm的摇床上过夜。当农杆菌液浓度OD600=0.8左右，将菌液收集于50mL离心管中，于4000rpm，离心5分钟。用重悬液（10mM MgCl₂,10mM MES和200μM乙酰丁香酮）重悬，调整浓度至OD600=1.2-1.5。重悬后的菌液在常温放置2h。将要沉默的棉花幼苗每片子叶背面用针头扎几个小孔。将重悬液TRV:RNA1，分别与TRV:RNA2和TRV:GbHDTF1按1：1体积混合均匀，用2ml注射器将混合后的菌液沿着小孔注射渗入棉花子叶。用黑色塑料膜将注射接种后的棉花幼苗避光24h。24h后，保持培养条件为25℃,120μE m^-2S^-1光强，16h亮/8h暗。 

实施例4：TRV:GbHDTF1转基因植株相关分析 

1、TRV:GbHDTF1转基因植株基因表达分析 

对照植株和GbHDTF1沉默植株分别提取叶片和根系RNA（Zhu等,An improved simple protocol for isolation of high quality RNA from Gossypium spp.suitable for cDNA library construction.Acta Agronomica Sinica.2005,31:1657-1659），利用反转录酶SuperscriptIII（购自Invitrogen公司,美国）将其反转录合成cDNA，以GbHDTF1-Rt-F和GbHDTF1-Rt-R引物进行RT-PCR，同时用引物UB7-F和UB7-R扩增棉花GhUbi7基因做内参，PCR扩增35个循环。对沉默棉花植株进行GbHDTF1的表达量分析。表达分析表明GbHDTF1沉默的棉花幼苗中GbHDTF1基因的表达相对对照植株均明显下降（图4A）。 

2、TRV:GbHDTF1转基因植株抗病性鉴定。 

农杆菌转化后3周后的棉花幼苗用于棉花黄萎病菌接种处理，接种方法为伤根接种法（马平等,A new inoculation method for Verticillium wilt on cotton and its application in evaluating pathogenesis  and host resistance.Acta Phytopathologica Sinica,2004,34(6):536-541）。接种一周之后观察棉花黄萎病的发病率和病指，统计方法依据国家标准（GB/T22101.5-2009棉花抗病虫性评价技术规范第5部分：棉花黄萎病）。通过对对照植株和GbHDTF1基因沉默植株接种后植株表型和发病情况统计进行分析，表明GbHDTF1基因沉默之后植物对黄萎病菌的抗性有显著提高，表现出黄萎病病症的植株明显减少（图4B）。病指和发病率的统计也表明发病植株的发病程度在GbHDTF1基因沉默植株中的显著降低（图4C）。 

3、TRV:GbHDTF1转基因植株茉莉酸信号途径相关基因分析 

取对照植株和GbHDTF1沉默植株分别提取叶片提取RNA（Zhu等,An improved simple protocol for isolation of high quality RNA from Gossypium spp.suitable for cDNA library construction.Acta Agronomica Sinica.2005,31:1657-1659），用QRT-PCR检测TRV:GbHDTF1沉默后，茉莉酸路径相关基因表达变化。相关引物的DNA序列如下： 

LOX1-RF(5'GCTTATGTTGCTGTAAATGACTCTGG3'） 

LOX1-RR(5'CACACTAAGTTGTCGGTTCGTTG3'） 

AOS-RF(5'TGCCACCTGGTCCTTTCATTTC3'） 

AOS-RR(5'GCGTGTTTGGGCTCGGAAGGGTCG3'） 

OPR3-RF(5'AGAGGTCCACTCCTGGCGGCTT3'） 

OPR3-RR(5'CCACCTGTTCTTCATTGTAGATTCC3'） 

MYC-2RF(5'GCTCCGCCACTACCGTGCTC3'） 

MYC-2RR(5'CTCGAAGCACTTTTTTACGGTGTTC3'） 

Jaz1-RF(5'AGCCTCAAAAAGGAAGACCTCAAAC3'） 

Jaz1-RR(5'TGGCTGCTCAATCACCATAGTAATC3'） 

JAZ3-RF(5'TGATTTTGCTCAAGGAGATAACGCT3'） 

JAZ3-RR(5'TGATTGCCTACTCGTTGCCTGT3'） 

JAZ6-RF(5'GGCATCAATATGGCGGTTCAGGAC3'） 

JAZ6-RR(5'TTCATCGGGTTTAGGTGGCAGAGT3'） 

同时用引物UB7-F和UB7-R对棉花GhUbi7基因做特异扩增作为内对照进行相对定量分析。定量PCR仪为ABI7500，定量PCR试剂购自Bio-Rad公司。PCR反应体系（20μl）包括：1μl稀释后的cDNA(等于10ng起始总RNA)，10μl2×PCR Master Mix,200nM的引物。反应条件为：95℃30sec；95℃5sec，60℃35sec，40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。结果表明：在本发明克隆的基因GbHDTF1被干涉植株中，茉莉酸合成相关基因受诱导，茉莉酸下游响应相关基因及茉莉酸下游相关基因都受到不同程度的诱导（参见附图5A），表明GbHDTF1基因参与了植物抗病反应信号路径。 

4、TRV:GbHDTF1转基因植株茉莉酸含量分析 

对照植株和沉默植株分别取叶片提取茉莉酸并测定其含量，具体方法参照Shindy等用到的茉莉酸提取方法(Identification of Plant Hormones from Cotton Ovules.Plant Physiol.1975,55(3):550-554)。具体过程如下：分别取对照植株和沉默植株的叶片，用液氮研磨成粉末，称取0.1g粉末， 加入80%甲醇溶液600μl，于4℃并避光振荡24h后，在9000×g，4℃离心10分钟，取上清转入一支新的离心管中。再往沉淀中加入400μl80%甲醇溶液于4℃并避光振荡4h后，9000g，4℃离心10分钟。把上清与前一次的上清混合。把两次的有机相溶液用氮气吹干，加入200μl甲醇溶解。用HPLC液相色谱测定其茉莉酸浓度。结果表明GbHDTF1被干涉植株中，茉莉酸合成增加（参见附图5B）。这与在GbHDTF1被干涉植株中参与茉莉酸合成相关基因受诱导，茉莉酸下游响应相关基因及茉莉酸下游相关基因都受到不同程度的诱导相一致，表明GbHDTF1参与了茉莉酸合成的负调控。