一种鸡传染性法氏囊病活疫苗泡腾片免疫佐剂

摘要

一种鸡传染性法氏囊病活疫苗泡腾片免疫佐剂，属于兽用生物制品技术领域。该免疫佐剂每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖30～80g、中药黄酮20～50g、维生素6～10g、明胶4～6g和蔗糖40～70g。本发明的免疫佐剂具有以下优点：1.本发明所制备的免疫佐剂，具有耐热效果，可提高疫苗运输、储藏等便利性。2.采用本发明免疫佐剂所制备的疫苗在免疫注射时可以减少应激反应，降低鸡群疾病感染风险。3.采用本发明免疫佐剂制备疫苗，可以大大提高活疫苗的使用效果，快速的产生中和抗体。

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鸡传染性法氏囊病活疫苗泡腾片免疫佐剂。

背景技术

随着集约化养禽业的兴起和国际贸易的增加，禽病流行日趋严重，造成家禽的高死亡率，严重制约着养鸡业的发展，造成世界养鸡业严重的损失，危及经济发展、食品安全和社会稳定。鸡传染性法氏囊病(Infection bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infection bursal disease virus，IBDV) 引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病，主要感染3-12周龄的青年鸡，该病毒主要在法氏囊的淋巴细胞内增殖，并且对其它免疫器官造成不同程度的损伤，最终导致鸡的法氏囊萎缩而引起鸡的免疫抑制。该病无明显的季节性，一年四季均可发生，常通过被污染的饲料、饮水、粪便、鸡舍用具、人员衣服等途径而传播，潜伏期为1-5天，出现症状后第3天开始死亡，4-6天是死亡高峰期，以后逐渐停止死亡，发病率可达90%以上，死亡率不等，一般为10%-50%。本病在临床上可以导致体重减轻、生长缓慢和骨骼肌出血等症状，卫生条件较差的情况下常伴发其他疾病，死亡率进一步提高，雏鸡个体小，抗病力差，一旦发生疫病，则传染快，死亡率高，死亡率达80%以上，损失更大，给养鸡业带来了巨大的经济损失。

疫苗是由免疫原性较好的病原微生物经繁殖和处理后制成的制品，接种动物机体后，刺激机体产生特异性抗体，当体内的抗体滴度达到一定数值后，就可以抵抗这种病原微生物的侵袭、感染，起到预防这种疾病的作用。随着我国养禽业的迅猛发展，对鸡传染性法氏囊病的防治越来越重要。

多糖是中药活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的能力。此外，中药多糖对低等生物的生产和贮藏具有特殊的保护作用。中药多糖富含羟基，可以和低等活性生物结合，构建多维网络空间氢键结构，在活性生物表面形成保护膜，实现对活性生物的保护作用。

维生素是机体代谢中必不可少的有机化合物。机体犹如一座极为复杂的化工厂，不断地进行着各种生化反应。其反应与酶的催化作用有密切关系。酶要产生活性，必须有辅酶参加。已知许多维生素是酶的辅酶或者是辅酶的组成分子。因此，维生素是维持和调节机体正常代谢的重要物质。维生素是动物生长过程中不可缺少的营养物质之一，尤其在应激发生的情况下维生素的作用更加明显。适当的食用维生素可以降低动物应激，减少疾病发生率，提高动物抗病能力。

黄酮类化合物是自然界中存在的多元酚类物质，也是自然界药用植物中的主要活性成分之一。它是指具有15个碳原子并以C6-C3-C6的方式构成的三环天然有机物，是植物在长期自然选择中产生的二级代谢产物，现在已分离鉴定的有4000多种。它广泛存在于果蔬、中草药中，无毒副作用，它具有显著的清除机体内自由基、抗老化、抗突变、调血脂降血压等药理保健功能，是一类极具开发前景的天然有机抗氧化剂，这些抗氧化活性物质可以减少和清除机体内自由基，具有预防疾病的作用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种鸡传染性法氏囊病活疫苗泡腾片免疫佐剂的技术方案，该免疫佐剂能够大幅度提高了机体的免疫力，刺激机体产生高效的中和抗体，提高了机体预防疾病的能力。

所述的一种鸡传染性法氏囊病活疫苗泡腾片免疫佐剂，其特征在于该免疫佐剂每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖30～80g、中药黄酮20～50g、维生素6～10g、明胶4～6g和蔗糖40～70g，所述的中药多糖和中药黄酮从以下中药组合物中提取得到：穿心莲、怀牛膝、茯苓、板蓝根、甘草、荨麻、问荆和黄芪。

所述的一种鸡传染性法氏囊病活疫苗泡腾片免疫佐剂，其特征在于该免疫佐剂每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖40～60g、中药黄酮30～40g、维生素6～8g、明胶4.5～5.5g和蔗糖50～60g。

所述的一种鸡传染性法氏囊病活疫苗泡腾片免疫佐剂，其特征在于所述的维生素中含有维生素C 20～40%、维生素E 10～30%、维生素D3 5～15%、维生素B1 15～35%、维生素K 10～20%和维生素B2 5～20%。

所述的一种鸡传染性法氏囊病活疫苗泡腾片免疫佐剂，其特征在于所述的中药组合物中含有穿心莲10～30份、怀牛膝20～40份、茯苓10～20份、板蓝根10～30份、甘草10～30份、荨麻10～30份、问荆10～20份和黄芪10～30份。

所述的一种鸡传染性法氏囊病活疫苗泡腾片免疫佐剂，其特征在于所述的中药组合物中含有穿心莲15～25份、怀牛膝25～35份、茯苓12～18份、板蓝根15～25份、甘草15～25份、荨麻15～25份、问荆12～18份和黄芪15～25份。

所述的一种鸡传染性法氏囊病活疫苗泡腾片免疫佐剂，其特征在于所述的中药多糖和中药黄酮通过以下步骤制得：

a、按所述重量份称取穿心莲、怀牛膝、茯苓、板蓝根、甘草、荨麻、问荆和黄芪，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

c、将b中上清进行醇沉，沉淀即为粗制中药多糖，上清即为粗制中药黄酮；

d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4℃吸附过夜，吸附后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

e、将d中上清液进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；

f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥制得中药多糖；

g、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后经冷冻真空干燥制成中药黄酮。

上述的一种鸡传染性法氏囊病活疫苗泡腾片免疫佐剂，设计合理，与传统的免疫佐剂相比其具有以下优点：

1.本发明所制备的免疫佐剂，具有耐热效果，可提高疫苗运输、储藏等便利性。

2.采用本发明免疫佐剂所制备的疫苗在免疫注射时可以减少应激反应，降低鸡群疾病感染风险。

3.采用本发明免疫佐剂制备疫苗，可以大大提高活疫苗的使用效果，快速的产生中和抗体。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限止本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。

实施例1：中药多糖和中药黄酮的制备

a、按穿心莲20份、怀牛膝30份、茯苓20份、板蓝根10份、甘草10份，荨麻30份、问荆20份、黄芪30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

c、将b中上清进行醇沉，沉淀即为粗制中药多糖，上清即为粗制中药黄酮；

d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4℃吸附过夜，吸附后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

e、将d中上清经0.22um滤膜过滤除菌后，进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；

f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥即得到中药多糖；

g、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，再经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。

实施例2：中药多糖和中药黄酮的制备

将实施例1的步骤a的中药组合物改为穿心莲10份、怀牛膝20份、茯苓15份、板蓝根25份、甘草25份、荨麻10份、问荆15份和黄芪25份，其它步骤条件均与实施例1相同。

实施例3：

将实施例1的步骤a的中药组合物改为穿心莲30份、怀牛膝40份、茯苓10份、板蓝根30份、甘草30份、荨麻20份、问荆10份和黄芪15份，其它步骤条件均与实施例1相同。

实施例4：一种鸡传染性法氏囊病活疫苗泡腾片免疫佐剂的制备

在每1000ml磷酸缓冲液中加入中药多糖80g、中药黄酮50g、维生素8g（维生素C 1.8g、维生素E 1g、维生素D3 1g、维生素B1 2g、维生素K 1.2g、维生素B2 1g）、明胶5g和蔗糖50g，即得到鸡传染性法氏囊病活疫苗泡腾片用免疫佐剂。其中中药多糖和中药黄酮由实施例1制得。磷酸缓冲液由氯化钠6～10g，氯化钾0.05～0.5g，磷酸氢二钠1～1.2g，磷酸二氢钾0.05～0.5g，氯化钙0.05～0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.05～0.2g溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟得到。

实施例5：一种鸡传染性法氏囊病活疫苗泡腾片免疫佐剂的制备

在每1000ml磷酸缓冲液中加入中药多糖30g、中药黄酮20g、维生素6g（维生素C 1.2g、维生素E 1.8g、维生素D3 0.9g、维生素B1 1.2g、维生素K 0.6g、维生素B2 0.3g）、明胶4g和蔗糖40g，即得到猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用免疫佐剂。其中中药多糖和中药黄酮由实施例1制得。磷酸缓冲液由氯化钠6～10g，氯化钾0.05～0.5g，磷酸氢二钠1～1.2g，磷酸二氢钾0.05～0.5g，氯化钙0.05～0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.05～0.2g溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟得到。

实施例6：泡腾材料的制备

a、酸性材料的制备

按重量份分别称取柠檬酸15份、乳糖10份、EDTA 15份、亮蓝指示剂0.5份，将上述成分充分混合，40～65℃烘干后过8～12目筛，制得酸性颗粒备用；

b、碱性材料的制备

按重量份分别称取碳酸氢钠15份、乳糖10份、亮蓝指示剂1份，将上述成分充分混合，40～65℃烘干后过8～12目筛，制得碱性颗粒备用；

c、将上述碱性材料与酸性材料按1:1混合均匀，并加入0.5～1重量份的左旋咪唑，经Co-60辐射灭菌制得泡腾材料。

实施例7：免疫佐剂的使用方法

1.鸡传染性法氏囊病毒悬液制备

（1）生产用毒种制备：

将已长成单层的DF-1细胞，弃去细胞生长液，按细胞生长液1%量接种病毒，37℃吸附1小时，加入细胞维持液，置37℃继续培养，40小时后开始观察，当细胞病变达到80%时，收获细胞培养物，置-20℃保存。

（2）制苗材料的选择：选择生长良好的DF-1单层细胞。

（3）制苗用细胞毒液的繁殖：

将已长成良好单层的DF-1细胞，弃去生长液，用pH 值7.2-7.6的DMF12维持液将生产用毒种稀释3-4倍，按生长液量的1%接种稀释后的病毒，37℃吸附1小时，加细胞维持液，置37℃继续旋转培养。接毒后，每天观察细胞病变情况，病变细胞达80%时，即可收获细胞培养物，反复冻融3次，置-20℃以下冻结保存。

2.冻干制剂制备

将无菌检验和病毒含量检测合格的细胞毒液，混合于同一灭菌容器内，按1:1（V:V）比例加入实施例4或5中制备的免疫佐剂，充分混匀后定量分装，冷冻真空干燥制成鸡传染性法氏囊病冻干制剂。

3.泡腾片制备　

将按上述制备的鸡传染性法氏囊病冻干制剂与实施例6得到的泡腾材料按按重量比2:1～3混合均匀后，用压片机压制成片剂，定量分装。

上述的细胞生长液含90%DMEM/F12、10%胎牛血清、90～110U/ml抗菌素，pH 7.2～7.3、DO 30～60%；细胞维持液含98%DMEM/F12、2%胎牛血清、90～100U/ml抗菌素，pH 7.2～7.3、DO 30～50%。

试验例1 本发明鸡传染性法氏囊病活疫苗泡腾片免疫佐剂的应用

1材料

1.1 鸡传染性法氏囊病活疫苗泡腾片

    由鸡传染性法氏囊病毒冻干制剂和鸡传染性法氏囊病活疫苗泡腾片免疫佐剂制得。

1.2 试验用鸡  200日龄海兰蛋种鸡2000只；10日龄三黄肉鸡2000只。

2 方法

2.1 将2000只200日龄海兰蛋种鸡分为两组，第一组1000只，作为实验组，在饲喂全价饲料（参考鸡饲养标准NY/33-2004）的同时饲喂本发明所制备的鸡传染性法氏囊病活疫苗泡腾片10片；第二组1000只，作为对照组，只饲喂全价饲料。试验实施期记录各组产蛋率、受精率、死淘率、鸡传染性法氏囊抗体水平等指标，观察期为四周。

2.2将2000只10日龄三黄肉鸡分为两组，第一组1000只，作为实验组，在饲喂全价饲料（参考鸡饲养标准NY/33-2004）的同时饲喂本发明所制备的鸡传染性法氏囊病活疫苗泡腾片10片；第二组1000只，作为对照组，只饲喂全价饲料。试验实施期记录各组平均日增重、死淘率和鸡传染性法氏囊抗体水平等指标，观察期为四周。

3 结果

3.1 崩解时限结果

取1片泡腾片，置盛有200ml水的250ml烧杯中，水温15-25℃，观察并记录完全溶解的时间，结果见表1。

表1 崩解时限检验结果

3.2 200日龄海兰蛋种鸡试验结果，见表2。

表2 200日龄海兰蛋种鸡试验结果

3.3 10日龄三黄肉鸡试验结果，见表3。

表3 10日龄三黄肉鸡试验结果

4 结论

综上所述，本发明佐剂所制备的鸡传染性法氏囊病活疫苗泡腾片，鸡群使用时可提高鸡传染性法氏囊抗体效价，提高产蛋率，提高种蛋受精率，提高肉鸡日增重，降低鸡群死淘率。