樟属植物提取物在制备治疗或预防肿瘤的药物或保健品中的应用

摘要

本发明公开了樟属植物提取物的新用途——樟属植物（包括肉桂、坚叶樟、毛叶樟、芳樟、阴香、黄樟）提取物在制备治疗或预防肿瘤药物或保健品中的应用。本发明还提供了樟属植物提取物的制备方法。研究表明，樟属植物提取物能够激活Nrf2信号通路，促进抗氧化和II相解毒酶的表达，增加细胞内谷胱甘肽水平，增强细胞内还原能力，并能够抑制致癌物砷和活性氧H2O2引起的细胞毒性。因此，可将其制备成相应的口服制剂和注射剂，并用于肿瘤的预防。

说明书

技术领域

本发明涉及樟属植物提取物的新用途，具体涉及樟属植物提取物在制备治疗或预防肿瘤的药物或保健品中的应用。

背景技术

随着社会的发展，人类生活水平和医疗环境的改善，人类寿命得到了显著的延长，但经济高速发展的同时，环境污染严重，导致恶性肿瘤的发病率也在提高，严重威胁人类健康，给国家和社会带来沉重的负担。在尚无有效药物实现对恶性肿瘤有效治疗的前提下，研发具有预防作用的药物和保健品，防止疾病的早期形成和发生成为有效的应对策略。

核转录因子Nrf2（Nuclear factor-erythroid 2-related factor2）是调节细胞氧化还原平衡的重要转录因子，通过与抗氧化酶和II相解毒酶启动子区域抗氧化反应原件（ARE）结合调控细胞氧化还原平衡，其目标基因包括编码GST、UGT、γGCS、NQO1的II相解毒酶，及GCL、HO-1等内源性抗氧化蛋白。当机体暴露于亲电性异物、化学致癌物、内源性氧化剂等对机体有损伤作用的物质下，Nrf2便会被激活并通过上调抗氧化酶和II相解毒酶清除有害物，保护机体免受毒物的损伤（Lau et al.,Pharmacol.Res.,2008,58,262-270)。因此，通过激活Nrf2信号通路，增强机体自身清除毒物和致癌物的能力，能够预防多种疾病的发生，例如恶性肿瘤。

在氧化应激状态下，面对内源性和外源性毒物对机体的侵害，利用外源性Nrf2激动剂上调机体Nrf2水平，能够增强机体自身防御能力，预防内源性活性氧、外源性致癌物等毒物对机体的损伤，对于预防恶性肿瘤的发生具有重要意义（Magesh et al.,Med.Res.Rev.,2012,32,4,687-726）。激活Nrf2信号通路，能够上调II相解毒酶水平，清除致癌物或降低其毒性，抑制致癌物诱导的DNA损伤、基因突变，通过上调Nrf2表达，能够增加细胞内谷胱甘肽水平，增强抗氧化酶活性，清除细胞内活性氧，抑制细胞脂质过氧化，从而预防恶性肿瘤的发生。因此，具有Nrf2激动作用的单体化合物、植物提取物等能够有效预防恶性肿瘤的发生率。

樟属（Cinnamomum），为樟科的一属，约250种，分布于热带亚洲、澳大利亚至太平洋岛屿和热带美洲。我国约有46种，主产南方各省区，种数最多是云南，其次是广东和四川，其中肉桂、柴桂、华南桂、川桂是重要药材。樟属植物中主要含有挥发油、黄酮、苯丙素等化学成分。

发明内容

针对上述现有技术，本发明公开了樟属植物提取物的新用途——樟属植物（包括肉桂、坚叶樟、毛叶樟、芳樟、阴香、黄樟）提取物，在制备治疗或预防肿瘤的药物或保健品中的应用。本发明还提供了樟属植物提取物的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的发明人通过研究发现，樟属植物（包括肉桂、坚叶樟、毛叶樟、芳樟、阴香、黄樟）提取物，能够激活Nrf2信号通路，并能保护细胞抵抗致癌物砷和活性氧双氧水产生的细胞毒性，因此，可以以上述樟属植物提取物为原料制备预防肿瘤的保健品，也可以制备治疗肿瘤的药物（经查阅文献，迄今为止未见有樟属植物提取物激活Nrf2信号通路的报道，亦未见樟属植物用于肿瘤预防和治疗的报道）。

具体应用时，可以以樟属植物（包括肉桂、坚叶樟、毛叶樟、芳樟、阴香、黄樟）提取物为原料，添加医学上可接受的辅料，制成胶囊剂（包括软胶囊）、片剂、散剂、颗粒、口服液、酒剂、丸剂、微丸剂、合剂、酊剂等剂型，优选颗粒剂、胶囊剂、片剂；或者将樟属植物提取物进一步纯化制成注射制剂。也可以将樟属植物提取物与其它对肿瘤有治疗或预防作用的药物混合，再添加或不添加医学上可接受的辅料，制成胶囊剂（包括软胶囊）、片剂、散剂、颗粒、口服液、酒剂、丸剂、微丸剂、合剂、酊剂、注射剂等剂型。

所述樟属植物提取物，是通过以下方法制备得到的：

将樟属植物（包括肉桂、坚叶樟、毛叶樟、芳樟、阴香、黄樟）地上部分粉碎，用0～95％乙醇（体积百分数）回流提取1～8次，每次溶剂用量为药材重量的1～20倍，每次提取时间为0.5～10小时；合并提取液，过滤，回收乙醇，进行浓缩、干燥，即得樟属植物提取物。

优选的，用30～90%乙醇回流提取2～4次，每次溶剂的用量为药材重量的3～7倍，每次提取时间为2～4小时。

所述任意一种樟属植物提取物，均可以用于制备治疗或预防肿瘤的药物或保健品。

本发明的发明人完成了樟属植物（包括肉桂、坚叶樟、毛叶樟、芳樟、阴香、黄樟）提取物对Nrf2信号激活作用，及对致癌物砷和活性氧双氧水引起的细胞毒性的保护作用的研究。结果表明，上述樟属植物提取物能够在蛋白水平激活Nrf2，增加Nrf2及其下游基因NQO1和GCS的表达，通过增加细胞内谷胱甘肽的水平增强细胞还原能力。发明人还发现它们能够抑制致癌物砷和活性氧双氧水诱导的细胞毒性，表现出抑制细胞癌变的能力。下面以樟属植物，包括肉桂、坚叶樟、毛叶樟、芳樟、阴香、黄樟，介绍其对Nrf2信号通路及对致癌物砷和活性氧双氧水引起的细胞毒性的作用：

采用能够稳定表达含ARE依赖的荧光素酶质粒的MDA-MB-231-Luc细胞系，评价了樟属植物提取物对Nrf2的作用，结果表明樟属植物提取物具有激活Nrf2信号通路的作用(图1)。

选择人乳腺癌MDA-MB-231细胞作为检测细胞，评价樟属植物提取物对Nrf2信号通路的作用。蛋白质印迹分析结果表明，樟属植物提取物对能够上调Nrf2蛋白的表达，并能促进下游抗氧化和II相解毒酶蛋白NQO1和γGCS的表达（图2）。

选择人正常肺上皮HBE细胞，检测了樟属植物提取物对细胞内谷胱甘肽水平的影响。结果显示，樟属植物提取物对能增加细胞内谷胱甘肽水平（图3），增强细胞内还原能力和清除活性氧能力。

选择致癌物砷诱导的细胞毒性模型，评价樟属植物提取物对对人正常肺上皮HBE细胞的保护作用。经樟属植物提取物对处理后，细胞生存率显著高于未加药处理组，证明樟属植物提取物对能够抑制三价砷诱导的细胞毒性（图4），表明樟属植物提取物对可用于肿瘤的预防和治疗。

选择活性氧H₂O₂诱导的细胞毒性模型，评价樟属植物提取物对人正常肺上皮HBE细胞的保护作用。结果表明植物提取物能够抑制H₂O₂产生的毒性，提高细胞生存率（图5）。肿瘤的发生多与活性氧产生的毒性密切相关，该结果证明樟属植物提取物可用于肿瘤的预防和治疗。附图说明

图1：ARE依赖的荧光素酶报告试验表明樟属植物提取物对能够激活Nrf2信号通路，图中的樟属植物提取物浓度单位为μg/mL,萝卜硫素2.5μM为阳性对照,其中A为肉桂，B为坚叶樟，C为毛叶樟，D为芳樟，E为阴香，F为黄樟。

图2：蛋白质印迹分析表明樟属植物提取物能够在蛋白水平激活Nrf2其下游基因，图中的樟属植物提取物浓度单位为μg/mL,萝卜硫素2.5μM为阳性对照，其中A为肉桂，B为坚叶樟，C为毛叶樟，D为芳樟，E为阴香，F为黄樟。

图3：樟属植物提取物能够增加细胞内谷胱甘肽水平，图中萝卜硫素2.5μM为阳性对照，樟属植物浓度分别为：肉桂(60μg/mL)，坚叶樟(60μg/mL)，毛叶樟(90μg/mL)，芳樟(60μg/mL)，阴香(90μg/mL)，黄樟(400μg/mL)。

图4：樟属植物提取物能够降低砷(As)诱导的细胞毒性（*p<0.05）,其中A为肉桂(60μg/mL)，B为坚叶樟(60μg/mL)，C为毛叶樟(90μg/mL)，D为芳樟(60μg/mL)，E为阴香(90μg/mL)，F为黄樟(400μg/mL)。

图5：樟属植物提取物能够降低双氧水(H₂O₂)诱导的细胞毒性（*p<0.05）,其中A为肉桂(60μg/mL)，B为坚叶樟(60μg/mL)，C为毛叶樟(90μg/mL)，D为芳樟(60μg/mL)，E为阴香(90μg/mL)，F为黄樟(400μg/mL)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，下述实施例仅为说明之目的，并非用于限制本发明。

实施例1：樟属植物提取物对Nrf2信号通路的激活作用

方法：（1）樟属植物提取物的制备

樟属植物（分别为肉桂、坚叶樟、毛叶樟、芳樟、阴香、黄樟，共进行6种樟树植物提取物的制备）地上部分200g，粉碎，75%乙醇800mL，提取2次，每次1小时，合并提取液，浓缩干燥即得6种樟树植物提取物，用于活性评价。

（2）人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞系的培养

人乳腺癌细胞MDA-MB-231购自美国模式培养物集存库（ATCC），采用含10%胎牛血清(FBS)、2mMHEPES和6ng/mL胰岛素的MEM培养基，置于37℃，5%CO₂培养箱中培养。

（3）ARE依赖的荧光素酶报告试验

将MDA-MB-231-Luc细胞接种于96孔板上，24小时后加入不同浓度的待测化合物，处理16小时，采用细胞裂解液[0.1M磷酸钾和1mM二硫苏糖醇]裂解细胞，用检测液(25mM双甘氨肽，15mM硫酸镁，500μMATP，250μM荧光素和250μM辅酶A)，测定荧光强度。

结果：如图1所示，樟属植物提取物能够显著增强ARE依赖的荧光素酶活性，在任一提取物最佳浓度下，强度是空白对照组的4倍，阳性对照药物萝卜硫素(2.5μM)是空白对照组的2倍。上述结果表明，六种樟属植物（包括肉桂、坚叶樟、毛叶樟、芳樟、阴香、黄樟）提取物能够诱导Nrf2信号通路，对机体具有更好的保护作用。

实施例2：樟属植物提取物能够上调Nrf2及以下游基因蛋白水平的表达

方法：蛋白质印迹分析(Westernblot)检测细胞中蛋白水平的变化

将MDA-MB-231细胞接种于直径35mm培养皿中，培养至密度达到70%～80%后，加入不同浓度的樟属植物提取物（樟属植物提取物为实施例1制备）处理16h，PBS洗涤2次，加入细胞裂解液（50μg/ml抑肽酶,0.5mM苯甲基磺酰氟,1mM正钒酸钠,10mM氟化钠,10mMβ-磷酸甘油），收集蛋白并采用Bradford法测定蛋白浓度。各取样品蛋白（100μg）上样，SDS-PAGE分离蛋白组分并采用电转移法将蛋白条带转移至硝酸纤维素薄膜上。薄膜经TBS配制5%的脱脂奶粉溶液室温封闭1h后，分别与各待测蛋白抗体4℃孵育过夜。经TBS洗涤后分别加入辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1h后,用增强型ECL化学发光进行蛋白分析。

结果：如图2所示，细胞经樟属植物提取物处理16h后，Nrf2及其下游抗氧化和II相解毒酶蛋白NQO1和γGCS蛋白水平呈现剂量依赖性增加，证实六种樟属植物（包括肉桂、坚叶樟、毛叶樟、芳樟、阴香、黄樟）提取物能够在蛋白水平上计划Nrf2信号通路。

实施例3：樟属植物提取物增加细胞内谷胱甘肽水平

方法：（1）人正常肺上皮细胞HBE细胞的培养

人正常肺上皮细胞HBE购自美国模式培养物集存库（ATCC），采用MEM培养基，并向其中加入10%胎牛血清(FBS)，5%谷氨酰胺，置于37℃，5%CO₂培养箱中培养。

（2）细胞内谷胱甘肽含量的测定

将HBE细胞接种于直径35mm培养皿中，培养至密度达到70%～80%后，加入不同浓度的樟属植物提取物（樟属植物提取物为实施例1制备）处理24小时，PBS洗涤2次，加入0.5mL50mM磷酸钠和1mMEDTA缓冲液收细胞，超声1min，10000g离心15分钟，取上清液，按照谷胱甘肽测定试剂盒说明书操作，412nm测定吸光度并计算谷胱甘肽含量。

结果：如图3所示，六种樟属植物（包括肉桂、坚叶樟、毛叶樟、芳樟、阴香、黄樟）提取物能够显著增加细胞内谷胱甘肽水平，增强细胞内还原能力。

实施例4：樟属植物提取物能够抑制三价砷对人肺支气管上皮HBE细胞的毒性

方法：MTT法测定化合物对砷（As）诱导的细胞毒性的保护作用

将HBE细胞接种于96孔板上，加入不同浓度待测樟属植物提取物处理16小时，然后加入不同浓度的砷和待测浓度樟属植物提取物（樟属植物提取物为实施例1制备）处理24小时，加入MTT3小时后，590nm测定吸光度并计算细胞生存率。

结果：如图4所示，采用樟属植物提取物预处理细胞16小时，然后加入20μM、40μM的砷和樟属植物提取物处理细胞24小时，结果表明樟属植物提取物对HBE细胞具有保护作用，能够抑制砷诱导的细胞毒性。樟属植物提取物处理组的细胞生存率明显高于未加药物处理组。结果证明，樟属植物提取物（包括肉桂、坚叶樟、芳樟、阴香、黄樟）能够抑制致癌物砷诱导的毒性，能够用于肿瘤的预防和治疗。

实施例5：樟属植物提取物能够抑制活性氧双氧水（H₂O₂）对人肺支气管上皮HBE细胞的毒性

方法同实施例4。

结果：图5所示，采用相应浓度樟属植物提取物预处理细胞16小时，然后加入100μM、200μM的H₂O₂和相应浓度樟属植物提取物处理细胞24小时，结果表明樟属植物提取物对HBE细胞具有保护作用，能够抑制H₂O₂诱导的细胞毒性。樟属植物提取物处理组的细胞生存率明显高于未加药物处理组。结果证明，樟属植物提取物（包括肉桂、坚叶樟、芳樟、阴香、黄樟）能够抑制活性氧H₂O₂产生的神经细胞毒性，能够用于肿瘤的预防和治疗。

实施例6：肉桂提取物的制备

肉桂地上部分5kg，粉碎，用药材重量的3倍的90％乙醇回流提取2次，每次提取时间为4小时，合并提取液，过滤，回收乙醇，减压干燥，即得樟属植物提取物315g，收率为6.3%。

实施例7：芳樟提取物的制备

芳樟地上部分5kg，粉碎，用药材重量的5倍的75％乙醇回流提取3次，每次提取时间为3小时，合并提取液，过滤，回收乙醇，喷雾干燥，即得樟属植物提取物350g，收率为7.0%。

实施例8：黄樟提取物的制备

黄樟地上部分5kg，粉碎，用药材重量的7倍的35％乙醇回流提取4次，每次提取时间为2.5小时，合并提取液，过滤，回收乙醇，冷冻干燥，即得樟属植物提取物412g，收率为8.24%。

实施例9：片剂的制备

黄樟提取物（实施例8制备）20g，加入玉米淀粉30g，糊精15g，充分混匀，制颗粒，干燥，整粒，加适量滑石粉，压片，即得。

实施例10：胶囊剂的制备

黄樟提取物（实施例8制备）20g，加入淀粉20g、糊精15g，微晶纤维素8g，充分混匀，制颗粒，干燥，整粒，加入适量硬脂酸镁，装胶囊，即得。