一种用于间接ELISA试验的样品稀释液

摘要

本申请公开了一种样品稀释液及其在间接ELISA试验中的应用。本申请的稀释液中含有蛋白终浓度60-100μg/mL的杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物，其中，杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物中不含有检测靶标蛋白。本申请的样品稀释液，在其中添加杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物，使得采用本申请的样品稀释液进行稀释后的阴性样品的OD值下降，并可缩小不同阴性样品间的标准方差，从而降低了间接ELISA方法中判定结果的临界值，减少了假阳性和假阴性的出现，提高了检测结果的准确性。

说明书

技术领域

本申请涉及酶联免疫检测领域，特别是涉及一种用于间接酶联免疫检测的稀释液。 

背景技术

酶联免疫吸附测定法（简写ELISA）是指固相吸附技术和免疫酶标抗体（或抗原）技术相结合的一种方法。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本的抗体或抗原与固相载体表面的抗原或抗体起反应，即抗原与抗体的免疫反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应结合在固相载体上。借助底物显示特异结合的标记抗体（或抗原）上的酶活性，用酶与底物反应后生成的有色产物进行光密度测定，达到抗原或抗体定量的目的。 

间接ELISA方法检测抗体主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病菌或病毒的检测。间接法的优点是只要变换包被就可利用同一酶标抗体建立检测相应的抗体的方法。目前常用的包被抗原有：原核表达特异蛋白、真核表达特异蛋白以及酵母菌表达特异蛋白。真核表达特异蛋白时多采用昆虫细胞表达体系，利用携带有特异蛋白核苷酸序列的重组杆状病毒感染昆虫细胞，表达出目的蛋白。由于真核表达系统表达目的蛋白的量少且不易纯化，因此多直接采用感染重组杆状病毒的昆虫细胞裂解液作为抗原包被ELISA板。但采用此种抗原包被的主要问题与缺陷是阴性血清OD值偏高，即背景值偏高，且阴性血清样品的偏离度大，易造成假阳性的出现；同时在确定阴阳性临界值时，由于因偏离度大，使得标准方差较大，导致其临界值也偏高，一般来说，临界值是按约30份已验证为阴性的血清样品平均OD值加上3倍的标准方差来确定，标准方差大自然导致临界值偏高。这样就可能将抗体滴度低的阳性样品判为阴性，即假阴性的出现。 

发明内容

本申请的目的是提供一种样品稀释液，以及该样品稀释液在ELISA检测中的应用。 

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案： 

本申请公布了一种样品稀释液，该稀释液中含有蛋白终浓度60-100μg/mL的杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物，其中，杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物中不含有检测靶标蛋白。优选的杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物的蛋白终浓度为80μg/mL。 

进一步的，稀释液中还含有重量比1%的牛血清白蛋白。 

进一步的，稀释液的基础缓冲液为PBS缓冲液。需要说明的是，稀释液的基础缓冲液是指，稀释液中作为主要溶剂的部分。 

优选的，PBS缓冲液的pH值为7.4，PBS缓冲液中含有重量比0.5%的吐温-20。 

进一步的，稀释液中还含有重量比0.05%-0.3%的硫柳汞。 

本申请的一个实现方式中，杆状病毒为HTA杆状病毒。 

本申请的另一面还公布了本申请的稀释液在间接ELISA试验中的应用。需要说明的是，此处说的，“本申请的稀释液在间接ELISA试验中的应用”具体包括，采用本申请的稀释液对ELISA检测中的样品，包括受检血清样品、阳性参照样品和阴性参照样品等进行稀释处理。 

本申请的另一面公布了一种间接ELISA试验试剂盒，该试剂盒中含有本申请的稀释液。可以理解，在不影响稀释液的活性的情况下，完全可以将本申请的稀释液制成试剂盒，以便使用。 

本申请的再一面公布了一种间接ELISA试验方法，该方法包括采用常规稀释液对样品进行稀释处理，其中，稀释处理包括，向常规稀释液中添加蛋白终浓度60-100μg/mL的杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物，并且，杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物中不含有检测靶标蛋白。其中，样品包括受检血清样品或者阳性参照样品或阴性参照样品。需要说明的是，此处的常规稀释液是指通常实验室中用于对ELISA检测样品进行稀释处理的溶液。 

进一步的，在添加杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物的同时，向稀释液中添加重量比1%的牛血清白蛋白，体积比0.5%的吐温-20，以及重量比0.05%-0.3%的硫柳汞。 

进一步的，在对样品进行稀释处理后，将稀释的样品在37℃恒温孵育30-90分钟。 

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于： 

本申请的样品稀释液，在其中添加杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物，使得采用本申请的样品稀释液进行稀释后的阴性样品的OD值下降，并可缩小不同 阴性样品间的标准方差，从而降低了间接ELISA方法中判定结果的临界值，减少了假阳性和假阴性的出现，提高了检测结果的准确性。 

具体实施方式

本申请的发明人发现，导致阴性血清OD值偏高的主要原因可能是，由于ELISA板是直接采用感染重组杆状病毒的昆虫细胞裂解液包埋的，而阴性血清样品中可能含有除目的蛋白之外的能够与杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物蛋白抗体结合的其它杂蛋白，从而导致阴性血清OD值偏高，阴性血清样品偏离度大，影响检测的准确性。针对该发现，本申请的发明人提出了一种构思，即在现有常规的血清稀释液的基础上，在其中添加蛋白终浓度60-100μg/mL的杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物，当然，可以理解，在稀释液中添加的杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物中是不含有检测靶标蛋白的。 

通过添加不含检测靶标蛋白的杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物，使得阴性血清样品中能够与杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物蛋白抗体结合的其它杂蛋白直接本申请的稀释液中的蛋白抗体结合，避免杂蛋白与ELISA板上除目的蛋白之外的蛋白结合，从而降低阴性样品的OD值，缩小不同阴性样品间的标准方差，进而降低间接ELISA方法中判定结果的临界值，最终减少假阳性、假阴性的出现，提高检测结果的准确性。 

需要说明的是，本申请中所提到的细胞裂解物或细胞裂解液是指，对培养的细胞进行破碎裂解后所获得的混合液体，其中细胞的破碎处理与常规的处理方法相同；并且除去不必要的固体杂质，在细胞破碎裂解后还需过滤、沉淀、离心，以去除细胞膜或细胞壁碎片。 

为了能够更有效的降低阴性样品的OD值，缩小不同阴性样品间的标准方差，本申请的发明人对样品稀释液的组分进行了大量的优化，其中一个优选实现方式中，杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物的蛋白终浓度为80μg/mL，并且稀释液中还含有重量比1%的牛血清白蛋白，优选的采用含体积比0.5%的吐温-20的pH值为7.4的PBS缓冲液作为基础缓冲液，并且更优选的还在稀释液中添加重量比0.05%-0.3%的硫柳汞。需要说明的是，以上方案是本申请的一种优选实施方案，可以理解，在以上组分用量的基础上进行试验允许的调整，从而获得与本申请相当的效果，同样也在本申请的保护范围内。 

还需要说明的是，本申请的一种实现方式中，添加的杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物具体为HTA杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物。其中昆虫细胞系是目前真核表达中常用的昆虫细胞表达体系，在本申请中不做具体限定；HTA杆状 病毒也是真核表达中常用的载体，可以理解，在采用不同的病毒载体时，同样的采用相应的病毒感染的昆虫细胞裂解物即可。总的来说，在本申请的向血清样品中添加杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物的基本构思下，或者，在样品稀释液中添加杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物的基本构思下，对载体或细胞系的具体选择都在本申请的发明构思保护范围内。 

还需要说明的是，本申请的间接ELISA试验方法，正是基于本申请的发明构思所得出的，即在对受检血清样品或者参照样品进行常规的稀释处理过程中，向其中添加蛋白终浓度60-100μg/mL的杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物，当然，杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物中也是不含有检测靶标蛋白的。同样这样的稀释处理步骤，其效果与采用本申请的样品稀释液对样品进行稀释，其效果是相当的。 

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本申请进行进一步的说明，不应理解为对本申请的限制。 

实施例一  HTA杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物的获取 

1、实验材料 

1.1菌株与质粒 

大肠杆菌(E.coli)DH5α、DH10Bac(含Bacmid和Helper两种质粒)、pFastBac HTA质粒均为Invitrogen公司产品；pMD18-T质粒为大连宝生物工程有限公司产品；昆虫细胞Sf9传代细胞由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心提供。 

1.2主要试剂 

SF-900Ⅱ培养基和脂质体Ⅱ均为Invitrogen公司产品；Pierce BCA Protein Assay Kit蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo公司。 

1.3质粒DNA的转座 

将质粒pFastBac HTA转入感受态大肠杆菌DH10Bac中，涂于含庆大霉素、卡那霉素、四环素、X-gal和IPTG的筛选平板上，37℃培养48h，挑取白色菌落，提取质粒，并用pUC/M13引物做PCR鉴定，同时进行酶切鉴定，其中pUC/M13引物为市售引物，PCR鉴定也是常规方法即可。 

1.4重组Bacmid质粒DNA的提取与制备 

将上述单个白色菌落接种于含庆大霉素、卡那霉素及四环素的LB培养液中扩大培养，离心收集菌体，提取重组Bacmid质粒DNA，用TE缓冲液溶解质粒。 

1.5重组质粒转染昆虫细胞 

将8μL脂质体Ⅱ加入到100μL不含添加剂、抗生素和血清的SF-900Ⅱ昆虫细胞培养液中，室温放置0.5h以上。同时取1μL上述重组Bacmid质粒DNA加入到100μL不含抗生素和血清的SF-900Ⅱ昆虫细胞培养液中，轻轻混匀。将上述两种溶液混合，轻轻混匀，并在室温下孵育15～30min。将约210μL的Bacmid-脂质体混合物逐滴加入无培养液的Sf9细胞上，27℃培养3～5h，弃含Bacmid-脂质体的培养液，加入不含抗生素和血清的SF-900Ⅱ昆虫细胞培养液，27℃继续培养，3d后收集含杆状病毒的培养上清，此时的杆状病毒称为HTA杆状病毒，并用其感染正常Sf9细胞，至出现细胞病变后，收集细胞。 

1.6HTA杆状病毒感染的昆虫细胞的超声裂解及浓度的测定 

将上述1.5小节中所述病变昆虫细胞收集后，用pH7.4，0.015M磷酸盐缓冲液轻轻重悬细胞，然后用pH7.4，0.015M磷酸盐缓冲液重悬细胞，使细胞浓度达到5×10⁶个细胞/mL。设置用hielsher UP400S超声破碎仪将其参数设制为Cycle：0.3，Amplitude%：85，超声破碎10分钟，然后14000g离心30分钟，收集上清，采用Thermo公司的Pierce BCA Protein Assay Kit蛋白浓度测定试剂盒测定上清的蛋白浓度。 

实施例二  样品稀释液的制备 

在pH值为7.4的1升PBS缓冲液中加入5毫升的吐温-20、10克牛血清白蛋白、2克硫柳汞，并加入终浓度为80μg/mL的实例一中第1.6小节的HTA杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物，该杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物中不含有目标蛋白。 

实施例三  非洲猪瘟VP54蛋白间接ELISA方法检测血清样品 

（1）包被：将含非洲猪瘟VP54蛋白基因的杆状病毒感染昆虫细胞，并经超声破碎，10000rmp离心10分钟，取上清并测定浓度。用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液，使得包被浓度2.5μg/mL，每孔50μL，4℃包被过夜。 

（2）洗涤：弃去包被液，拍干。每孔加洗涤液300μL，3min后弃洗涤液，拍干。如此重复3次。 

（3）封闭：每孔加封闭液100μL，37℃孵育2h，弃封闭液，拍干。每孔加洗涤液300μL，3min后弃洗涤液，拍干。如此重复3次。 

（4）阴、阳性血清样品都采用两种不同稀释法分组进行孵育：将非洲猪瘟阳性血清和7个非洲猪瘟阴性的田间血清样品，分别用本申请实施例二的样 品稀释液和常用的PBST抗体稀释液分别在EP管中稀释20倍，置于37℃温箱孵育60分钟。然后加入上述包埋好的ELISA板条内，每孔50μL，置于37℃温箱孵育60分钟。 

（5）洗板：弃孔中液体，拍干。每孔加洗涤液300μL，3min后弃洗涤液，拍干。如此重复5次。 

（6）HRP标记兔抗猪lgG孵育：用洗液稀释成说明书中建议的工作浓度1:5000，每孔50μL，置于37℃温箱孵育1h。 

（7）洗板：弃孔中液体，拍干。每孔加洗涤液300μL，3min后弃洗涤液，拍干。如此重复5次。 

（8）显色：加底物液，每孔50μL，37℃避光放置5min。 

（9）终止：加终止液终止显色反应，每孔50μL，用酶标仪测定OD₄₅₀值。检测结果见表1。 

表1  不同稀释液处理的样品的OD比较 

结果显示，采用PBST作为血清稀释液的阴性样品平均OD值为0.53，其标准方差为0.05；而采用本申请的样品稀释液稀释的阴性样品平均OD值为0.4795，其标准方差为0.0188。结果表明采用本申请的样品稀释液可明显缩小不同阴性样品间的标准方差。若按阴性样品检测OD值的平均值与其3倍标准方差之和作为临界判定OD值的话，则采用PBST作为血清稀释液的临界判定OD值为0.674，而采用本申请的样品稀释液的临界判定OD值为0.536。由此可减少因临界值过大引起的假阳性和假阴性的出现，使检测结果更准确。 

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。