基于胶原水凝胶构建体内肿瘤工程化人卵巢癌肿瘤模型

摘要

本发明公开了一种基于可注射型胶原水凝胶复合人卵巢癌细胞于裸鼠皮下以注射形式无创性构建体内肿瘤工程化人卵巢癌肿瘤模型的应用研究。首次以可注射型胶原水凝胶支架为基底材料，复合人卵巢癌细胞SKOV3于裸鼠皮下无创性构建体内肿瘤工程化人卵巢癌肿瘤模型，并与传统的无支架材料条件下单独注射细胞方式构建的人卵巢癌肿瘤模型对比，通过对肿瘤模型进行检测，结果表明，基于可注射型胶原水凝胶构建的人卵巢癌肿瘤恶性程度更高，与人体卵巢癌肿瘤更为接近，且这种方式构建的体内肿瘤模型创伤性小。采用该法构建的肿瘤模型成瘤性好，成瘤率达到95%，相比于传统的方式提高了15%左右，对于进一步的研究提供更为可靠的肿瘤模型。

说明书

技术领域

本发明涉及一种医学肿瘤模型——基于胶原水凝胶构建体内肿瘤工程化人卵巢癌肿瘤模型，具体地说是以可注射型胶原水凝胶为三维支架材料利用肿瘤工程技术于裸鼠体内构建人卵巢癌模型的应用。

背景技术

现有的肿瘤模型研究主要基于两种，一是体外模型, 即建立二维肿瘤模型；二是建立动物模型，主要是人肿瘤载荷瘤裸鼠模型。

就动物模型而言，传统建模方式是将人肿瘤细胞直接注入裸鼠皮下，这种方法容易造成细胞的流失，而且由于无基质的支持，细胞间的连接不紧密，因此成瘤性较差，成瘤存在着一定的几率。究其原因，可能是由于忽视了细胞与基质间的相互作用这一重要环节，难以提供与人体内肿瘤相仿的微环境。这对于重现人体肿瘤细胞局部黏附、侵袭以及远处转移有很大的影响。另一方面，体外模型研究也证明材料的引入，为肿瘤细胞提供了三维环境，与体内环境更为接近，但是体外培养缺乏体内基质细胞的支撑，且空间有限，难以重现体内肿瘤微环境。因此，需要进一步的改进体内模型的构建方式，以便模拟更为接近肿瘤细胞的微环境，构建更为真实可靠的肿瘤模型，为肿瘤的进一步研究奠定基础。 

发明内容

本发明的目的是以可注射型胶原水凝胶支架为基底材料，复合人卵巢癌细胞SKOV3于裸鼠皮下无创性构建体内肿瘤工程化人卵巢癌肿瘤模型，对于进一步的医学研究及应用提供更为可靠的肿瘤模型。

本发明引入了肿瘤工程技术，利用肿瘤工程技术构建体内肿瘤模型主要是将肿瘤细胞接种于胶原水凝胶支架材料上，然后直接注入动物体内构建肿瘤模型。体内构建的重点在于选择可降解性支架材料，一方面为细胞提供暂时支持物，随着支架的降解吸收，可产生新的组织，这相当于重现体内肿瘤的形成过程；另一方面，基于凝胶的可注射性，不会对动物造成创伤，因此这项技术具有较好的应用前景。

本发明的技术方案如下：

基于胶原水凝胶构建体内肿瘤工程化人卵巢癌肿瘤模型，所述的体内工程化人卵巢癌肿瘤是按照以下方法构建的：

1、人卵巢癌肿瘤细胞的获取：人卵巢癌肿瘤细胞株SKOV3购置于ATCC；SKOV3复苏后，加入含有10%的胎牛血清的DMEM完全培养液（Gibco 公司），37℃、5% CO₂培养箱培养，24小时后换液，继续培养，传代4-6次扩增细胞数量；

2、材料配制：                                                型胶原水凝胶（由四川大学生物材料工程研究中心馈赠），用0.5M的冰乙酸，4℃缓慢溶解配制成7mg/mL，使用时用1M 的NaOH调成pH值为中性，37℃条件下放置4~5分钟以上由液相变为固相凝胶；

3、将细胞接种于支架材料：把已经扩增的SKOV3细胞用0.25%的胰蛋白酶消化下来，离心去上清，再加入液状胶原水凝胶，浓度为10⁷个细胞/mL；

4、裸鼠移植瘤的构建：把细胞—材料复合体以200uL量注射于6-8周大的裸鼠左右侧腋部皮下，形成一小丘表示接种成功，体内植入30天，构建体内肿瘤工程化卵巢癌肿瘤模型。

本发明是基于发明人的实验研究而完成的。研究分三大部分：

一、     卵巢癌细胞的培养  

    人卵巢癌细胞SKOV3购买于ATCC（美国菌种保藏中心），采用DMEM培养基培养，加10%胎牛血清。细胞长至融合度80%以上进行传代。每两天换液一次。细胞放置于37℃、5% CO₂培养箱中进行培养。

二、可注射型胶原水凝胶的制备

胶原水凝胶的制备方法：从新生牛皮中通过梯度法提取型胶原，用0.5M的冰乙酸溶解，配制成7mg/mL溶液放置于4℃，使用时1M 的NaOH（氢氧化钠）调成pH值为中性。在37℃条件下放置4~5分钟以上可完成液固相转变，成为固体状水凝胶。

三、体内肿瘤工程化卵巢癌肿瘤模型的构建实验

把已经扩增的对数期肿瘤细胞用0.25%的胰蛋白酶消化下来，离心去上清，再接种于胶原水凝胶材料中，浓度为10⁷个细胞/mL。然后将细胞——材料复合体以200uL量分别注射于6-8周大的裸鼠左右侧腋部皮下，形成一小丘表示接种成功，构建6只裸鼠肿瘤模型，体内植入30天，构建体内肿瘤工程化卵巢癌肿瘤模型。对照组为传统方式构建的肿瘤模型，即直接将浓度为10⁷个细胞/mL的细胞悬液200uL注入裸鼠皮下。

裸鼠皮下原位种植2周后，可触及到实体肿块，瘤块生长30天，猝死裸鼠，取出完整肿瘤，可见胶原水凝胶条件下形成肿瘤的组织不规则，质韧，相比于传统构建的卵巢癌肿瘤更大。通过病理学检查显示，见细胞核大深染、多形性，核仁明显，并见有大面积肿瘤坏死灶和新生的肿瘤血管，这符合实体肿瘤的病理组织学特征。采用免疫组化和WB法（蛋白质印迹法）检测与肿瘤组织恶性程度相关的蛋白—MMp2（基质金属蛋白酶2）, MMp9（基质金属蛋白酶9）, laminin（层粘连蛋白）和fibronectin（纤维连接蛋白）的表达，Real-time pCR（实时定量荧光聚合酶链式反应）检查缺氧相关指标HIF-1α（缺氧诱导因子-1α）和肿瘤血管生成相关因子VEGF-A（血管内皮生长因子-A）的表达。

结果表明，与对照组比较，采用胶原水凝胶材料构建的肿瘤工程化模型恶性程度更高，与人体肿瘤更为接近；采用胶原水凝胶植入构建体内肿瘤模型创伤性小，具有较好的应用前景。总之，本发明首次采用胶原水凝胶材料构建的肿瘤工程化人卵巢癌模型进行了研究，实验表明，与未加材料的对照组比较，采用胶原水凝胶材料构建的肿瘤工程化模型与人体肿瘤更为接近，且创伤性小，具有较好的应用前景。

本发明的优点：

1、 方法简便，重复性好，成瘤率高；以可注射型胶原水凝胶为介质将肿瘤细胞注入裸鼠体内，操作方法与传统方法一样，简便易行，获得的肿瘤成瘤率在95%以上（50只裸鼠，成瘤47只），相比于传统的仅注射细胞（50只裸鼠，成瘤41只）的方式提高了15%左右，对于进一步的研究可提供更为可靠的肿瘤模型。

2、安全性好；胶原水凝胶生物安全性已得到普遍认可，裸鼠的存活主要与接种的肿瘤细胞的性质有关，与胶原水凝胶关系不大。基于可注射型胶原水凝胶构建的人卵巢癌肿瘤恶性程度更高，与人体卵巢癌肿瘤更为接近，且这种方式构建的体内肿瘤模型创伤性小。

3、来源丰富；胶原可从市场上购买。

附图说明

图1   体内卵巢癌肿瘤模型的大体观察图（A：胶原水凝胶复合SKOV3构建的模型；B：单纯SKOV3构建的模型）

图2   体内卵巢癌肿瘤模型组织学图片（HE染色）

     （A，C：胶原水凝胶复合SKOV3构建的模型；B，D：单纯SKOV3构建的模型，40X为放大40倍下观察，100X为放大100倍下观察）

图3   肿瘤坏死灶面积比及新生的肿瘤血管数（*p<0.05,**p<0.01）

图4  WB检测MMp2、MMp9、laminin和fibronectin表达（*p<0.05,**p<0.01, *** p<0.001）

     图5  Real-time pCR检测HIF-1α 和VEGF-A的表达（*p<0.05,**p<0.01, *** p<0.001）。

具体实施方式

一、卵巢癌细胞的培养

    人卵巢癌细胞SKOV3购买于ATCC，采用DMEM培养基培养，加10%胎牛血清。细胞长至融合度80%以上进行传代。每两天换液一次。细胞放置于37℃、5% CO₂培养箱中进行培养。

二、可注射型胶原水凝胶的制备

胶原水凝胶的制备方法：型胶原，从新生牛皮中通过梯度法提取，用0.5M的冰乙酸溶解，配制成7mg/mL溶液放置于4℃，使用时1M 的NaOH调成pH值为中性。在37℃条件下放置4~5分钟以上可完成液固相转变，成为固体状水凝胶。

三、体内肿瘤工程化卵巢癌肿瘤模型的构建实验

实验方案：

（1）实验动物模型的体内肿瘤工程化卵巢癌肿瘤模型制备

把已经扩增的对数期肿瘤细胞接种于胶原水凝胶材料中，制成10⁷个细胞/mL 水凝胶复合体。然后将细胞——材料复合体以200uL量分别注射于6-8周大的裸鼠左右侧腋部皮下，形成一小丘表示接种成功；对照组不加任何材料以相同数量的肿瘤细胞注射于相同位置的裸鼠皮下，体内植入30天，构建体内肿瘤工程化卵巢癌肿瘤模型。

瘤块生长第30天，猝死裸鼠，取出完整肿瘤，肿瘤的组织不规则，质韧。一部分 -80℃保存用于WB和Real-time pCR检测，另一部分用10% 福尔马林固定用于组织学切片。

（2）检测指标

① 肿瘤组织病理学观察：常规病理检察和统计肿瘤坏死面积比及肿瘤血管数；

② 免疫组化检测MMp2, MMp9, laminin和fibronectin肿瘤组织恶性程度的蛋白表达；

③ WB检测 MMp2, MMp9, laminin和fibronectin肿瘤组织恶性程度的蛋白表达；

④ Real-time pCR检查HIF-1α 和VEGF-A的表达。

（3）实验结果：

① 成瘤率及瘤体观察

分两次实验，第一次裸鼠用量为10只，第二次裸鼠用量为40只，两次结果表明胶原组成瘤率在95%以上（第一次成瘤10只，第二次成瘤37只），而对照仅为80%左右（第一次成瘤7只，第二次成瘤34只）。

如图1所示，结果可见采用可注射性胶原水凝胶构建的卵巢癌肿瘤瘤体更大，更为坚韧，形状不规则；而传统的单纯细胞构建的肿瘤瘤体较小。胶原组构建的肿瘤体积为167.6±46.8 mm²，对照组为72.35±28.7 mm²，可见胶原组形成的肿瘤比对照组大一倍以上。

② 肿瘤组织病理检查情况

如图2 HE（苏木精-伊红染色法）染色所示，胶原组细胞核大深染、多形性，核仁明显，并见有大面积肿瘤坏死灶及新生的肿瘤血管，这符合实体肿瘤的病理组织学特征。如图3所示，肿瘤坏死灶面积比及新生的肿瘤血管经统计分析胶原组明显比其他材料组及对照组高，p<0.05差异有统计学意义。

③ 肿瘤组织恶性程度相关蛋白MMp2, MMp9, laminin和fibronectin的蛋白表达

如图4所示，经WB检测肿瘤组织恶性程度相关蛋白MMp2, MMp9, laminin和fibronectin在胶原组蛋白阳性表达率相比于对照组高，经完全随机方差分析p<0.05，差异有统计学意义。说明基于胶原水凝胶构建的体内卵巢癌肿瘤恶性程度更高，成瘤性更好，与真实肿瘤更为接近。

④Real-time pCR检查肿瘤生成相关基因HIF-1α 和VEGF-A的表达

如图5 HIF-1α 和VEGF-A的表达所示，胶原组明显高于对照组（p<0.05）。说明基于胶原水凝胶构建的体内卵巢癌肿瘤恶性程度更高，可达到与真实肿瘤更为接近的肿瘤微环境。