基于羧基化碳纳米粒子和DNA相互作用测定溶菌酶的方法

摘要

一种溶菌酶含量的检测方法，属于化学发光适体传感器技术领域，用于细胞及生物样品中溶菌酶含量的检测。利用羧基化碳纳米粒子修饰氨基化磁珠，得碳纳米粒子修饰磁珠；用化学发光试剂ABEI对溶菌酶适体进行修饰，制备标记适体。在溶菌酶存在下，标记适体与溶菌酶结合，再将溶菌酶-标记适体作用后的溶液与碳纳米粒子修饰磁珠混合，磁性分离后上清液在H2O2和Co2+存在下产生化学发光，从而实现了溶菌酶的检测。本发明方法简单、成本低。

说明书

技术领域

    本发明属于化学发光适体传感器领域，具体为一种基于羧基化碳纳米粒子和DNA相互作用测定溶菌酶的方法。

背景技术

   溶菌酶（Lysozyme，Lyz）又称为胞质酶（Muramidase）或N-乙酰胞壁质多糖水解酶（N-axetylmuramide glycanhydrolase）。因为溶菌酶可以水解革兰氏阳性菌的细胞壁阻断胞壁质多糖达到破坏细胞壁的效果，因此具有杀菌的效果。溶菌酶是动物和人类免疫系统中必不可少的，在不同的组织中其含量是不同的，在疾病发生时与正常情况下含量有所不同。组织中溶菌酶含量降低容易引起许多疾病。因此溶菌酶含量检测具有重大的意义。

    目前测定溶菌酶的传统方法灵敏度不高，操作复杂，不容易满足实际检测要求。适体（适配体、适配子）是利用指数富集配基的系统进化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）技术筛选出来的。其能够与目标蛋白质等进行高亲合性、高特异性的结合，其特异性可与抗原抗体相媲美。同时适体稳定、便宜、易合成、可再生，因而近年来成为蛋白质分析的有力工具之一。目前利用适体的识别进行溶菌酶检测方法主要有酶切信号放大技术、电化学发光适体技术、DNA酶技术等[Xu Hun, Huaicheng Chen, Wei Wang. Design of ultrasensitive chemiluminescence detection of lysozyme in cancer cells based on nicking endonuclease signal amplification technology. Biosensors and Bioelectronics, (2010), 26:248; Haiyan Wang, Wu Gong, Zhian Tan, Xunxun Yin, Lun Wang. Label-free bifunctional electrochemiluminescence aptasensor for detection of adenosine and lysozyme. Electrochimica Acta, (2012), 76:416; Aptamer?DNAzyme hairpins for amplified biosensing. Carsten Teller, Simcha Shimron, Itamar Willner. Analytical Chemistry. (2009), 81 (21): 9114]。这些方法各有其优点，能不同程度的满足对溶菌酶的检测要求，但方法的灵敏度不高、操作复杂。所以必须发展一种灵敏度高，简单的新型检测方法。

发明内容

    鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测溶菌酶的化学发光适体传感器的制备方法，以及提供一种采用所述的化学发光传感器检测溶菌酶的方法。

    本发明是通过以下措施来实现的：基于羧基化碳纳米粒子和DNA相互作用化学发光适体传感器，其特征是包括以下步骤：

   (1) 利用戊二醛法将氨基化的溶菌酶DNA适体apt和化学发光试剂N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺（ABEI）进行交联，制备出标记适体（ABEI-apt）；

    (2) 用微波合成法制备羧基化碳纳米粒子（cCNP）；

   (3) 利用氨基与羧基的作用将羧基化碳纳米粒子与氨基化磁珠进行交联制备碳纳米粒子修饰磁珠（cCNP-MB）；

(4) 利用标记适体和碳纳米粒子修饰磁珠构成化学发光适体传感器。

本发明所述利用建立的化学发光适体传感器检测溶菌酶方法，其特征是：

    在ABEI-apt溶液中加入Mg²⁺离子，然后加入不同浓度的溶菌酶，恒温反应。取一定体积该溶液，加入碳纳米粒子修饰磁珠溶液中孵育反应后，磁性分离后上清液利用流动注射化学发光方法进行化学发光检测，以溶菌酶浓度为横坐标，化学发光信号强度为纵坐标，绘制标准曲线；测定未知样品的化学发光信号强度，根据标准曲线得到样品中溶菌酶的含量，从而实现对溶菌酶进行定量测定。

  所述的流动注射化学发光流路如图1所示。A：样品/空白溶液（磁性分离后上清液）；B：载流-缓冲溶液；C：CoCl₂溶液；D: H₂O₂；V：注射阀；F：化学发光流通池；PMT：光电倍增管；BPCL：化学发光分析仪；PC：计算机。

  本发明研制的化学发光适体传感器和测定方法具有如下特点：

  通过静电斥力和π-π堆积作用之间的竞争作用，利用标记适体与羧基化碳纳米粒子非共价键自组装原理建立了一种化学发光适体传感器，利用溶菌酶引起溶液中标记适体浓度的变化，从而利用化学发光实现溶菌酶测定。

只需要一条DNA链就建立了溶菌酶的化学发光适体传感器，这种设计有着简单、快速的优势。另外，根据实验化学发光信号（图5）可以看出，当本发明的传感器用于检测凝血酶、ATP、BSA、可待因、可卡因和免疫球蛋白G时，其发光强度远远低于检测溶菌酶的化学发光信号，这说明该传感器具有很高的选择性来检测溶菌酶。因此，本发明涉及的化学发光传感器在构建检测蛋白质的研究方法中体现出良好的发展前景。

附图说明

  图1为本发明的流动注射化学发光流路图。

   图2为本发明的具体实验原理图。

   图3为溶菌酶与标记适体结合时间（Time）对化学发光信号（ΔI_CL）的影响情况图。

图4 为化学发光信号与溶菌酶浓度（C_lyz）的标准曲线。

  图5 为对样品（Sample）溶菌酶（a）、凝血酶（b）、ATP（c）、BSA（d）、可待因（e）、可卡因（f）和免疫球蛋白G（g）的检测结果。

具体实施方式

    以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

   本发明涉及的一种检测溶菌酶的化学发光传感器，将羧基化碳纳米粒子修饰氨基化磁珠（碳纳米粒子修饰磁珠），以其为捕获载体；用化学发光试剂ABEI对溶菌酶适体进行修饰，制备标记适体。在溶菌酶的存在下，标记适体与溶菌酶结合，得到溶菌酶-标记适体溶液；再将溶菌酶-标记适体溶液与碳纳米粒子修饰磁珠作用。未与溶菌酶反应的标记适体，通过静电斥力和π-π堆积作用之间的竞争作用，吸附在碳纳米粒子修饰磁珠表面，再利用磁分离技术，分离出溶液，溶液中只剩余反应的溶菌酶-标记适体；该溶菌酶-标记适体在双氧水、Co²⁺ 存在下产生化学发光（hυ），以此实现溶菌酶的检测。

   本发明是通过以下措施来实现的：一种检测溶菌酶的化学发光传感器的制备方法，包括以下步骤：

    （1）ABEI-apt的制备：

   所述ABEI-apt的制备，优选的，利用戊二醛为交联剂将氨基化的DNA适体（apt）与ABEI进行反应制备了ABEI-apt。具体过程如下：

  （a）20 μL 10^-6~10^-4 M的氨基化的DNA适体加入5%戊二醛的磷酸缓冲溶液中，持续搅拌2 h；

   （b）再加入1~10 mg ABEI溶液，在室温下搅拌过夜，即得。

   （2）羧基化碳纳米颗粒的制备：

   所述羧基化碳纳米粒子的制备，优选的，具体过程如下：

    （a）碳纳米粒子制备：

   优选的，将0.1~1.0 g壳聚糖溶解在10 mL水中，放入微波炉（900 W）加热5~15分钟（min）至溶液颜色改变。将上述溶液以13000 rpm离心30 min去除杂质，再用透析袋（截留分子量3000~10000）在纯净水中对其透析，持续2~6天去除残余壳聚糖，得碳纳米粒子。

   （b）利用碳纳米粒子制备羧基化碳纳米粒子：

   优选的，将0.5~2克碳纳米粒子与1.0 mL 63%的硝酸和1.0 mL二甲基甲酰胺混合后在100摄氏度下反应8小时。然后，将产物利用0.22 μM超滤膜进行过滤，将滤液离心10 min（14000 rmp条件下），并用二次蒸馏水洗涤三次，然后分散在二次蒸馏水中制备成浓度为2.0 mg/mL溶液，即得。

  （3）碳纳米粒子修饰磁珠的制备：

    所述碳纳米粒子修饰磁珠的制备，具体过程如下：

    优选的，在小离心管中加入10~150 μL羧基化碳纳米粒子和2000 μL 0.1 M的咪唑缓冲液（pH为6.8），37℃下反应30 min，再加入1000 μL 含0.1 M的EDC、NHS和50 μL氨基化磁珠继续反应12 h。然后用磷酸缓冲溶液洗三次，定容至500 μL。制得碳纳米粒子修饰磁珠。

    利用DNA识别作用、静电斥力和π-π堆积作用之间的竞争作用，构建化学发光适体传感器，原理如图2所示。

   溶菌酶的检测：

  用所述化学发光适体传感器测定溶菌酶，具体过程如下：

    优选的，在ABEI-apt溶液中加入10.0 mM的Mg²⁺离子，然后加入不同浓度的溶菌酶，37℃恒温反应15 min。取1~5 μL该溶液，加入碳纳米粒子修饰磁珠溶液中58℃反应15 min后，取上清液进行化学发光检测。

    所述的取上清液进行化学发光检测所采用的化学发光流路图如图1所示。

   所述的化学发光检测化学发光实验条件，具体特征如下：

   (1) 检测体系的pH。优选的，当pH为11.5时，化学发光强度最大。所以，实验选用pH为11.5为最佳条件。

   (2) 检测体系的H₂O₂浓度。优选的，当H₂O₂浓度为1.5 mM时候，化学发光强度最大。所以，实验选用H₂O₂浓度为1.5 mM为最佳条件。

   (3) 检测体系的Co²+浓度。优选的，当Co²⁺浓度为0.1 mM时，化学发光强度最大。所以，实验选用Co²⁺浓度为0.1 mM为最佳条件。

   溶菌酶与标记适体作用时间。具体特征如下：

   优选的，在1～15 min范围内，化学发光信号强度随溶菌酶作用时间的增大而增强，直到15 min时达到极大值，大于15 min之后变化不大。因此实验确定结合的最佳时间为15 min。

   实施例：基于羧基化碳纳米粒子和DNA相互作用测定溶菌酶的方法。

  1. 实验部分

    1.1 仪器与试剂

   IFFM-E型流动注射化学发光分析仪（西安瑞迈分析仪器有限公司）；Lmax II/II384化学发光分析仪（美国MD公司）；THZ-82A气浴恒温振荡器（全坛市医疗仪器厂）。

    化学发光试剂（ABEI）购自阿拉丁试剂公司；氨基化磁珠（优选的，直径2～3 μm）购自天津倍思乐色谱技术开发中心；可卡因、可待因购自中国药品生物制品检定所；溶菌酶（Lysozyme，Lyz）、凝血酶、三磷酸腺苷（ATP）、牛血清白蛋白（BSA）和免疫球蛋白G均购自Sigma公司；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）购自Acros（New Jersey, USA）。

   所用人工合成DNA序列（购自北京赛百盛生物工程有限公司）如下。

   所述的DNA的部分序列为：

    5’-NH₂-（CH₂）₆-ATCTACGAATTCATCAGGGCTAAAGAGTGCAGAGTTCTTAG-3’（apt）（SEQ ID NO：1）。

   1.2实验步骤

   1.2.1ABEI-apt的制备：

    利用戊二醛为交联剂将氨基化的DNA适体（apt）与ABEI进行反应制备了ABEI-apt。具体过程如下：(1) 20 μL 10^-4 M的氨基化的DNA适体加入5%戊二醛的磷酸缓冲溶液中，持续搅拌2 h；(2) 再加入10 mg ABEI溶液，在室温下搅拌过夜。

    1.2.2羧基化碳纳米粒子的制备：

    （1）碳纳米粒子制备：

    将0.5 g壳聚糖溶解在10 mL水中，放入微波炉（900 W）加热9.5 min至溶液颜色改变。将上述溶液以13000 rpm离心30min去除杂质，再用透析袋（截留分子量8000）在纯净水中对其透析，持续4天去除残余壳聚糖，得碳纳米粒子。

    （2）利用碳纳米粒子制备羧基化碳纳米粒子：

   将2克碳纳米粒子与1.0 mL 63%的硝酸和1.0 mL二甲基甲酰胺混合后在100摄氏度下反应8小时。然后，将产物利用0.22 μM超滤膜进行过滤，将滤液离心10 min（14000 rmp条件下），并用二次蒸馏水洗涤三次，然后分散在二次蒸馏水中制备成浓度为2.0 mg/mL溶液。

   1.2.3碳纳米粒子修饰磁珠的制备：

  在小离心管中加入150 μL羧基化碳纳米粒子和2000 μL 0.1 M的咪唑缓冲液（pH为6.8），37℃下反应30 min，再加入1000 μL 含0.1 M的EDC、NHS和50 μL氨基化磁珠继续反应12 h。然后用磷酸缓冲溶液洗三次，定容至500 μL。制得碳纳米粒子修饰磁珠。

   溶菌酶的检测：

   在ABEI-apt溶液中加入10.0 mM的Mg^2 +离子，然后加入不同浓度的溶菌酶，37℃恒温反应15 min。取5 μL该溶液，加入碳纳米粒子修饰磁珠溶液中58℃反应15 min后，取上清液进行化学发光检测。

    化学发光检测实验所用的流动注射化学发光流路如图1所示。四个输送管路中：两个用来输送样品和载流-缓冲溶液，另两个输送CoCl₂（Co²⁺）和H₂O₂溶液。用六通阀采样品进行注射，每次采样体积为100 μL，所注射的样品随着载流在第一个交汇处混合，然后该混合物再在第三个交汇处与CoCl₂ + H₂O₂ 混合溶液在流通池前段混合，发生化学反应产生化学发光，利用光电倍增管检测发光信号，从而根据化学发光信号的强度来确定所测溶液的浓度，以此来测定样品中溶菌酶的含量。

   1.3结果与讨论

    (1) 检测体系的pH。当pH为11.5时，化学发光强度最大。所以，实验选用pH为11.5为最佳条件。

   (2) 检测体系的H₂O₂浓度。当H₂O₂浓度为1.5 mM时候，化学发光强度最大。所以，实验选用H₂O₂浓度为1.5 mM为最佳条件。

   (3) 检测体系的Co²⁺浓度。当Co²⁺浓度为0.1 mM时，化学发光强度最大。所以，实验选用Co²⁺浓度为0.1 mM为最佳条件。

    (4) 溶菌酶与标记适体作用时间。如图3所示，在1～15 min范围内，化学发光信号强度随溶菌酶作用时间的增大而增强，直到15 min时达到极大值，大于15 min之后变化不大。因此实验确定结合的最佳时间为15 min。

  在优选的条件下，不同浓度溶菌酶与化学发光信号之间成一定线性关系，得到了检测溶菌酶的标准曲线，线性范围及线性方程。当溶菌酶的浓度在1.0×10^-10～1.0×10^-8 M之间时，体系的化学发光信号随着溶菌酶浓度的增大而增大（图4）。线性回归方程为ΔI_CL = 691.45 C+ 78.2（ΔI_CL为体系的化学发光信号；C为溶菌酶的浓度，10^-9 M；n= 7，R = 0.9989）。该方法检测限为3.0×10^-11 M （3σ）。对浓度2.0×10^-9 M 的溶菌酶进行7次平行重复测定的RSD为3.7%，表明本法有较好的重现性。

    选择凝血酶、ATP、BSA、可待因、可卡因和免疫球蛋白G作为检测化学发光适体传感器对溶菌酶检测的对比物。如图5所示：将方法检测浓度为2.0×10^-9 M溶菌酶、溶菌酶、可待因、免疫球蛋白G和BSA，以及1.0×10^-5 M ATP 、可卡因，并将化学发光信号进行比较。可以看出，检测凝血酶、ATP、BSA、可待因、可卡因和免疫球蛋白G的化学发光信号远远低于检测溶菌酶的化学发光信号（图 5），说明该化学发光适体传感器具有足够高的选择性来测溶菌酶。

  从上述实施例可以看出，通过静电斥力和π-π堆积作用之间的竞争作用，利用标记适体与羧基化碳纳米粒子非共价键自组装原理构建了化学发光适体传感器，建立了检测溶菌酶方法。利用一条DNA链实现溶菌酶测定，方法简单。

   上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、代替、组合、简化，较为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。