犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试纸及制备方法

摘要

本发明公开了一种犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试纸及制备方法。该检测试纸包括样品吸收区、金标探针区、固相化抗体区、吸水区和支撑板，样品吸收区、金标探针区、固相化抗体区和吸水区铺设在支撑板上并依次相互部分重叠；样品吸收区包被有狂犬病毒抗原；金标探针区包被金标探针1和金标探针2，分别为胶体金标记的狂犬病毒单克隆抗体和兔IgG；固相化抗体区依次有对照线C1（包被羊抗兔IgG抗体）、测试线T（包被羊抗犬IgG抗体）、对照线C2（包被羊抗兔IgG抗体）和对照线C3（包被羊抗鼠IgG抗体）。本发明的试纸检测快速，准确率高，特异性强，携带、操作简便，根据对照线颜色深浅来判断狂犬病毒抗体水平高低。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测试纸及制备方法，具体涉及一种犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫 层析检测试纸及制备方法。

背景技术

狂犬病是由狂犬病毒（Rabies virus，RV）引起的人畜共患传染病，其主要宿主为犬、猫 等动物。典型症状为恐水症，又称：恐水病。本病极为凶险，病死率几乎为100%。我国是狂 犬病的高发国家，居世界第二位，仅次于印度。我国平均每年有1500多病例，约半数发生 在广西、湖南、贵州三省，在这三省犬携带RV率高达2.3%。外观健康犬脑内带毒率约5.88～ 13.13%，对人类的健康造成很大威胁。随着经济的发展和人民生活水平的提高，宠物犬的数 量在不但增加，犬的活动区域也在不断扩大。从宠物医疗市场得到的信息，人们迫切希望了 解宠物犬接种狂犬疫苗后犬是否获得抗体的保护，而目前狂犬病毒抗体的检测工作因受检测 条件和费用的限制，并没有得到广泛的应用。

目前，国内外用于实验动物包括犬、猴、鼠等狂犬病毒抗体检测的方法和相应的试剂盒， 有一定的研究和报道。但是现有检测狂犬病毒抗体的方法包括ELISA方法、荧光免疫法、放 射免疫法及化学发光法等都存在相应的弱点。ELISA方法虽然灵敏度高，但判读结果需要一 定的仪器设备。荧光免疫法、放射免疫法及化学发光法等均耗时长，且也需要一定的实验仪 器，另外，放射免疫法还存在放射性同位素污染的问题。而胶体金免疫层析法刚好可以避免 以上几种检测方法的缺点。该方法是一种很成熟的实验检测方法，以其特异性强、成本低， 操作简便，结果可靠、可单份或成批测定、不需任何仪器等优点已被广泛接受。现有关于狂 犬病毒抗体胶体金检测试纸的专利中一般都是1条对照线（或质控线），结果判读是根据检测 线颜色深浅进行，不能进行抗体水平高低的判定。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种犬抗狂犬病毒IgG抗体胶 体金免疫层析检测试纸。该试纸采用胶体金标记的狂犬病毒单克隆抗体和胶体金标记的兔 IgG做探针，包被羊抗犬IgG抗体、羊抗兔IgG抗体和羊抗鼠IgG抗体，结合样品吸收区的 狂犬病毒抗原进行抗狂犬病毒IgG抗体的检测。

本发明的另一目的在于提供上述犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试纸的制备 方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试纸，包括样品吸收区、金标探针区、 固相化抗体区、吸水区和支撑板，样品吸收区、金标探针区、固相化抗体区和吸水区铺设在 支撑板上并依次相互部分重叠；所述的样品吸收区包被有狂犬病毒抗原，包被量优选为5～ 50μg；所述的金标探针区包被有金标探针1和金标探针2；所述的金标探针1为胶体金标记 的狂犬病毒单克隆抗体，其标记量优选为每mL胶体金标记5～20μg单抗；所述的金标探针 2为胶体金标记的兔IgG，其标记量优选为每mL胶体金标记1～10μg兔IgG；所述的固相化 抗体区（自金标探针区至吸水区方向）依次有对照线C1、测试线T、对照线C2和对照线C3； 所述的对照线C1包被有羊抗兔IgG抗体，包被量优选为0.05～0.5μg；所述的检测线T包被 有羊抗犬IgG抗体，包被量优选为0.5～5μg；所述的对照线C2包被有羊抗兔IgG抗体，包 被量优选为0.5～5μg；所述的对照线C3包被有羊抗鼠IgG抗体，包被量优选为1～5μg。

所述的支撑板的材料优选为粘有一层聚氯乙烯衬膜的聚乙烯板；所述的样品吸收区的材 料优选为玻璃纤维膜；所述的金标探针区的材料优选为聚酯膜；所述的固相化抗体区的材料 优选为硝酸纤维素膜；所述的吸水区的材料优选为吸水滤纸。

上述犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，包括如下步骤：将胶 体金标记的狂犬病毒单克隆抗体和胶体金标记的兔IgG分别喷涂于聚酯膜上；在硝酸纤维素 膜上依次包被对照线C1（包被羊抗兔IgG抗体）、测试线T（包被羊抗犬IgG抗体）、对照线 C2（包被羊抗兔IgG抗体）和对照线C3（包被羊抗鼠IgG抗体）；在玻璃纤维膜上包被狂犬 病毒抗原；将玻璃纤维膜、聚酯膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装到支撑板上得到犬抗狂犬 病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试纸。

优选的，所述的犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试纸的制备方法包括如下步 骤：

（1）狂犬病毒抗原的制备：将狂犬病毒悬液接种到已长成单层的Vero细胞上，35℃培 养5～6天后，每隔3天连续收取培养上清液3次；将收集的病毒悬液浓缩40倍，并加入体 积浓度为1/3000的甲醛溶液灭活病毒；将灭活的病毒悬液于5000r/min离心30分钟去沉淀， 上清液通过Sepharose 4FF层析柱进行纯化得狂犬病毒抗原。

（2）本发明的狂犬病毒单克隆抗体可以商购，或按照本领域的常规方法制备，如参照文 献（曹雪涛,精编免疫学实验指南[M].北京:科学出版社,2009）公开的方法制备，包括下述 步骤：

1）将前述纯化的狂犬病毒抗原常规免疫Balb/c小鼠，当小鼠血清ELISA效价达到1:10000 以上时，取脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）以5×10⁷：1×10⁷的比例进行融合；用HAT选择性 培养基筛选杂交瘤细胞；用ELISA方法和间接免疫荧光（IFA）方法进行阳性杂交瘤细胞的 筛选；将筛选到的阳性杂交瘤细胞经三次有限稀释得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株及狂 犬病毒单克隆抗体；

2）将步骤1）制得的狂犬病毒单克隆抗体经硫酸铵沉淀，纯化，制得纯化的抗狂犬病毒 单克隆抗体。

（3）胶体金标记狂犬病毒单克隆抗体的方法：分别取半径为10～40nm浓度为0.01%的 胶体金20mL及狂犬病毒单克隆抗体100～400μg，在pH8.5～9.2的条件下通过磁力搅拌振荡 使其结合，加牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇20000（PEG20000）作为稳定剂，且使得BSA 最终质量浓度为0.1～5%，PEG20000最终质量浓度为0.01～0.1%，采用离心法除去未结合的 狂犬病毒单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体 金－狂犬病毒单克隆抗体复合物。

（4）胶体金标记兔IgG的方法：分别取半径为10～40nm浓度为0.01%的胶体金20mL 及兔IgG 20～200μg，在pH8.5～9.2的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白 （BSA）和聚乙二醇20000（PEG20000）作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓度为0.1～5%， PEG20000最终质量浓度为0.01～0.1%，采用离心法除去未结合的兔IgG和未稳定的胶体金 颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金－兔IgG复合物。

（5）将胶体金标记的狂犬病毒单克隆抗体和胶体金标记的兔IgG分别喷涂于聚酯膜上： 用20mL含1%BSA的PBS（0.01M，pH7.4）分别洗涤胶体金－狂犬病毒单克隆抗体复合物 和胶体金－兔IgG复合物，离心除去上清液，得到深红色沉淀，纯化后的沉淀用2mL含1%BSA 的PBS溶解，用喷涂设备分别涂于聚酯膜上，冻干。

（6）硝酸纤维素膜的包被：在硝酸纤维素膜依次包被对照线C1、测试线T、对照线C2 和对照线C3；检测线T包被的是羊抗犬IgG抗体，包被量0.5～5μg，对照线C1包被的是羊 抗兔IgG抗体，包被量0.05～0.5μg，对照线C2包被的也是羊抗兔IgG抗体，包被量0.5～5μg， 对照线C3包被的是羊抗鼠IgG抗体，包被量1～5μg，每条线宽1～3mm。

（7）玻璃纤维膜的包被：将前述纯化的狂犬病毒抗原用适量的PBS（0.01M，pH 7.4） 溶解后包被在玻璃纤维膜上，包被量为5～50μg。

（8）试纸组装：用粘上一层聚氯乙烯衬膜的聚乙烯板作为支撑载体，上面依次铺设包被 有纯化的狂犬病毒抗原的玻璃纤维膜、金标探针的聚酯膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸，外面 用胶带包封制成。

除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分 比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量（mL/g）百分比；本 发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积（g/mL）百分比；其余为重 量/重量百分比。

上述犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试纸的使用方法，包括如下步骤：将该 试纸的样品吸收区一端浸入待检血清样品中，5～10分钟后判读结果：对照线C1、C2、C3 均出现红色，表示试纸有效；对比检测线T和对照线C1、C2的颜色，检测线T颜色较对照 线C2颜色深，表明抗体强阳性；检测线T颜色介于对照线C1和C2之间，表明抗体阳性； 检测线T颜色较对照线C1颜色浅或无颜色出现，表明血清中没有狂犬病毒抗体或抗体量不 足。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

（1）检测快速：检测时间只需5～10分钟，能够满足现场检测的需要。

（2）检测准确率高、特异性强：本反应试纸与其他犬易感病原体没有交叉反应，检测灵 敏度与ELISA基本相同。

（3）携带方便，操作简便：本发明不需要借助其它仪器设备，适合各级兽医院及个人使 用。

（4）检测试纸在常温下即可保存，无需特殊的设备和仪器。保存期可达2年，且检测重 复性好。

（5）检测结果根据检测线和对照线C1及C2的颜色比较，可以判断样品中的抗体水平高 低。

附图说明

图1是犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试纸平面结构区域图；其中，1-样品 吸收区，2-金标探针区，3-固相化抗体区，31-对照线C1，32-检测线T，33-对照线C2，34- 对照线C4，4-吸水区。

图2是犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试纸纵切面结构图（用具体材料代表 各个区域），其中，5-粘有一层聚氯乙烯衬膜的聚乙烯板（支撑板），6-玻璃纤维膜（样品吸 收区），7-聚酯膜（金标探针区），71-金标探针1，72-金标探针2，8-硝酸纤维素膜（固相化 抗体区），9-吸水滤纸（吸水区）。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行具体的说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的 技术方案，并非限定本发明的实质。

实施例1

犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试纸平面结构区域图如图1所示，试纸水平 面自下而上依次为：样品吸收区1、金标探针区2、固相化抗体区3和吸水区4，固相化抗体 区3包被有对照线C1 31、检测线T 32、对照线C2 33和对照线C3 34。

犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试纸纵切面结构图（用具体材料代表各个区 域），粘有一层聚氯乙烯衬膜的聚乙烯板5为支撑板，玻璃纤维膜6为样品吸收区，聚酯膜7 为金标探针区，硝酸纤维素膜8为固相化抗体区，吸水滤纸9为吸水区，聚酯膜7上包被有 金标探针1 71和金标探针2 72；玻璃纤维膜6、聚酯膜7、硝酸纤维素膜8、吸水滤纸9铺设 在聚乙烯板5上并依次相互部分重叠。

样品吸收区1的玻璃纤维膜上包被有纯化的狂犬病毒，包被量为5μg。金标探针1 71为 胶体金标记的狂犬病毒单克隆抗体，标记量为每mL胶体金标记5μg单抗，金标探针2 72为 胶体金标记的兔IgG，标记量为每mL胶体金标记1μg兔IgG。对照线C1 31包被的是羊抗兔 IgG纯化抗体，包被量0.05μg；检测线T 32包被的是羊抗犬IgG抗体，包被量0.5μg；对照 线C2 33包被的是羊抗兔IgG抗体，包被量0.5μg；对照线C3 34包被的是羊抗鼠IgG抗体， 包被量1μg。

上述犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试纸的制备方法如下：

（1）狂犬病毒抗原的制备：将狂犬病毒悬液接种到已长成单层的Vero细胞上，35℃培 养5～6天后，每隔3天连续收取培养上清液3次；将收集的病毒悬液浓缩40倍，并加入体 积浓度为1/3000的甲醛溶液灭活病毒；将灭活的病毒悬液于5000r/min离心30分钟去沉淀， 上清液通过Sepharose 4FF层析柱进行纯化得狂犬病毒抗原。

（2）狂犬病毒单克隆抗体的制备方法，包括下述步骤：

1）将前述纯化的狂犬病毒常规免疫Balb/c小鼠，当小鼠血清ELISA效价达到1:10000 以上时，取脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）以5×10⁷：1×10⁷的比例进行融合；用HAT选择性 培养基筛选杂交瘤细胞；用ELISA方法和间接免疫荧光（IFA）方法进行阳性杂交瘤细胞的 筛选；将筛选到的阳性杂交瘤细胞经三次有限稀释得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株及狂 犬病毒单克隆抗体；

2）将步骤1）制得的狂犬病毒单克隆抗体经硫酸铵沉淀，纯化，制得纯化的狂犬病毒单 克隆抗体。

（3）胶体金标记狂犬病毒单克隆抗体的方法：分别取半径为40nm浓度为0.01%的胶体 金20mL及狂犬病毒单克隆抗体100μg，在pH8.5的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加 牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇20000（PEG20000）作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓 度为0.1%，PEG20000最终质量浓度为0.01%，采用离心法除去未结合的狂犬病毒单克隆抗 体和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金－狂犬病毒单克 隆抗体复合物。

（4）胶体金标记兔IgG的方法：分别取半径为40nm浓度为0.01%的胶体金20mL及兔 IgG 20μg，在pH8.5的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白（BSA）和聚乙 二醇20000（PEG20000）作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓度为5%，PEG20000最终质 量浓度为0.1%，采用离心法除去未结合的兔IgG和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心 管底部的深红色沉淀为胶体金－兔IgG复合物。

（5）将胶体金标记的狂犬病毒单克隆抗体和胶体金标记的兔IgG分别喷涂于聚酯膜上： 用20mL含1%BSA的PBS（0.01M，pH 7.4）分别洗涤胶体金－狂犬病毒单克隆抗体复合物 和胶体金－兔IgG复合物，离心除去上清液，得到深红色沉淀，纯化后的沉淀用2mL含1%BSA 的PBS溶解，用喷涂设备分别涂于聚酯膜上，冻干。

（6）硝酸纤维素膜的包被：在硝酸纤维素膜依次包被对照线C1、测试线T、对照线C2 和对照线C3；检测线T包被的是羊抗犬IgG抗体，包被量0.5μg，对照线C1包被的是羊抗 兔IgG抗体，包被量0.05μg，对照线C2包被的也是羊抗兔IgG抗体，包被量0.5μg，对照线 C3包被的是羊抗鼠IgG抗体，包被量1μg，每条线宽1～3mm。

（7）玻璃纤维膜的包被：将前述纯化的狂犬病毒抗原用适量的PBS（0.01M，pH 7.4） 溶解后包被在玻璃纤维膜上，包被量为5μg。

（8）试纸组装：用粘上一层聚氯乙烯衬膜的聚乙烯板作为支撑载体，上面依次铺设包被 有纯化的狂犬病毒抗原的玻璃纤维膜、金标探针的聚酯膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸，外面 用胶带包封后切成2～4mm宽的试纸。

实施例2：

除检测线T包被量为5μg；对照线C1包被量为0.5μg，对照线C2包被量为5μg，对照 线C3包被量为2μg，玻璃纤维膜纯化的狂犬病毒抗原包被量为20μg；金标探针1狂犬病毒 单克隆抗体标记量为每mL胶体金标记20μg单抗，金标探针2兔IgG标记量为每mL胶体金 标记10μg兔IgG；胶体金标记狂犬病毒单克隆抗体的方法：分别取半径为10nm浓度为0.01% 的胶体金20mL及狂犬病毒单克隆抗体400μg，在pH9.0的条件下通过磁力搅拌振荡使其结 合，加牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇20000（PEG20000）作为稳定剂，且使得BSA最终 质量浓度为2%，PEG20000最终质量浓度为0.05%，采用离心法除去未结合的狂犬病毒单克 隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金－狂犬病毒 单克隆抗体复合物；胶体金标记兔IgG的方法：分别取半径为10nm浓度为0.01%的胶体金 20mL及兔IgG 200μg，在pH9.0的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白（BSA） 和聚乙二醇20000（PEG20000）作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓度为2%，PEG20000 最终质量浓度为0.05%，采用离心法除去未结合的兔IgG和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物， 在离心管底部的深红色沉淀为胶体金－兔IgG复合物外，其余与实施例1相同。

实施例3

除检测线T包被量为2μg；对照线C1包被量为0.2μg，对照线C2包被量为2μg，对照 线C3包被量为5μg，玻璃纤维膜纯化的狂犬病毒抗原包被量为50μg；金标探针1狂犬病毒 单克隆抗体标记量为每mL胶体金标记10μg单抗，金标探针2兔IgG标记量为每mL胶体金 标记5μg兔IgG；胶体金标记狂犬病毒单克隆抗体的方法：分别取半径为20nm的浓度为0.01% 胶体金20mL及狂犬病毒单克隆抗体200μg，在pH9.2的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合， 加牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇20000（PEG20000）作为稳定剂，且使得BSA最终质量 浓度为5%，PEG20000最终质量浓度为0.1%，采用离心法除去未结合的狂犬病毒单克隆抗体 和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金－狂犬病毒单克隆 抗体复合物；胶体金标记兔IgG的方法：分别取半径为20nm浓度为0.01%的胶体金20mL及 兔IgG 100μg，在pH9.2的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白（BSA）和聚 乙二醇20000（PEG20000）作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓度为0.1%，PEG20000最终 质量浓度为0.01%，采用离心法除去未结合的兔IgG和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在 离心管底部的深红色沉淀为胶体金－兔IgG复合物外，其余与实施例1相同。

实施例4

犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试纸的使用方法：

检测时，抽取被测者少量血清样品用PBS（0.01M，pH 7.4）稀释一倍，将该试纸的样品 吸收区一端浸入稀释的样品中，5～10分钟后判读结果：对照线C1、C2、C3均出现红色， 表示试纸有效；对比检测线T和对照线C1、C2的颜色，检测线T颜色较对照线C2颜色深， 表明抗体强阳性；检测线T颜色介于对照线C1和C2之间，表明抗体阳性；检测线T颜色较 对照线C1颜色浅或无颜色出现，表明血清中没有狂犬病毒抗体或抗体量不足，应及时加强 免疫。

实施例5

本发明犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试纸与犬抗狂犬病毒IgG抗体ELISA 检测方法的比较：

应用实施例1、2、3制备的3种犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试纸（编号 为试纸1、2、3）与商品化法国SYNBIOTICS公司生产的犬狂犬病毒抗体检测试剂盒同时检 测犬血清样品30份、犬狂犬病毒抗体阴性血清、犬瘟热病毒抗体阳性血清、犬细小病毒抗体 阳性血清和不同稀释度的犬狂犬病毒抗体阳性参考血清。试纸使用方法按实施例4方法进行， ELISA试剂盒按照试剂盒说明书进行操作，检测结果见表1。

表1 本发明试纸与ELISA试剂盒的比较实验结果

检测结果显示，本发明实施例1、2、3制备的犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检 测试纸特异性好，与犬瘟热犬细小病毒阳性血清没有交叉反应；试纸敏感性不低于ELISA试 剂盒敏感性；检测的30份犬血清样本结果显示，本发明试纸与ELISA检测方法的符合率高 达96.67%（29/30）。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应 为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。