一种W2000蘑菇呼吸袋栽培种液体原种的优化配方及制备工艺

摘要

本发明公开了一种W2000蘑菇呼吸袋栽培种液体原种的优化配方及制备工艺。本发明液体原种培养基采用以下配方：玉米淀粉38-48g/L，黄豆粉10-15g/L，KH

说明书

技术领域

本发明属于食用菌菌种技术领域，特别涉及一种W2000蘑菇呼吸袋栽培种液体原种的优化配方及制备工艺。

背景技术

双孢蘑菇是世界性生产与消费的食用菌，我国双孢蘑菇年产量占世界的50%以上，2012年达246万吨，产值100多亿元。近年来由于劳动力成本的提高，双孢蘑菇的工厂化种植成为蘑菇种植发展的趋势。福建省农业科学院食用菌研究所是国内唯一专注于研发双孢蘑菇菌种选育与制种工艺的科研单位，选育的As2796蘑菇菌株二十年来一直是国内蘑菇种植的主栽品种（占90%以上），适合传统的人工种植模式；而2012年选育出W2000蘑菇新菌株，具有产量高、重生少、出菇集中、潮次明显等特点，比较适合国内工厂化种植。传统的小制种户各自为阵，依赖人工的制种模式生产的蘑菇栽培种质量不稳定，成为制约国内蘑菇工厂化种植发展的瓶颈。采用固体原种制作呼吸袋蘑菇栽培种的新工艺（专利号：ZL200910111583.4），选用W2000进行蘑菇呼吸袋栽培种的工厂化生产，批量生产出质量优良适合工厂化种植的W2000呼吸袋蘑菇栽培种，有望解决国内蘑菇工厂化种植面临的种源问题。

目前，固体原种容易存在隐性污染、颗粒大、结块不够松散等造成呼吸袋栽培种污染、接种速度慢、走菌不均等问题。因此，有必要开发培养时间短、菌龄一致、接种方便的液体菌种培养方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种可代替固体原种进行蘑菇呼吸袋栽培种生产的W2000液体原种的优化配方及制备工艺, 本发明可制备出活力强的W2000液体原种代替固体原种用于呼吸袋栽培种的生产，可以解决固体原种容易存在隐性污染、颗粒大、结块不够松散等造成呼吸袋栽培种污染、接种速度慢、走菌不均等问题，从而进一步提升呼吸袋栽培种生产效率和工艺水平并降低了生产成本。

本发明的技术方案如下：

一种W2000蘑菇呼吸袋栽培种液体原种的优化配方，其特征在于：液体培养基主要成分：玉米淀粉38-48g/L，黄豆粉10-15g/L，KH₂PO₄ 2.5-3.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8-1.2g/L。 

其中，所述的配方进行W2000液体原种的制备，适宜培养条件为发酵温度 22-25℃，摇瓶转速180-220 r/min，初始pH 6.3-6.6，发酵时间6-7d。

一种W2000蘑菇呼吸袋栽培种液体原种的的制备工艺，其特征在于包含以下步骤：

1）、W2000母液制备：

a、母液培养基制备；

分别准确称量100g 马铃薯，50g 麸皮，红糖 10g，蛋白胨2g，KH₂PO₄ 2g ，MgSO₄·7H₂O 0.75g ；向马铃薯和麸皮加0.3L蒸馏水加热至沸腾，20min用四层纱布过滤，弃马铃薯渣和麸皮渣，得到马铃薯和麸皮混合滤液备用。向混合滤液添加2.0g KH₂PO₄和0.75g MgSO₄·7H₂O，搅拌均匀，倒入1L量筒中，用蒸馏水补足混合液至1L，即为母液培养基。

100mL量筒量100mL液体种子培养基倒入250mL三角瓶中，瓶口塞硅胶塞；0.1Mpa，121℃高压蒸汽灭菌20min；母液培养基冷却后置于超净工作台中紫外灯照射杀菌30min。

b、在无菌条件下，取W2000母种PDA斜面上的0.5cm×0.5cm大小菌块接入母液培养基中，25℃静置培养2d；

c、180r/min回旋振荡器发酵培养12d，完成W2000母液菌种的制备；

2)、W2000液体原种制备：

a、按每升液体原种培养基称取玉米淀粉38-48g，黄豆粉10-15g，KH₂PO4 2.5-3.5g，MgSO₄·7H₂O 0.8-1.2g； 

b、向黄豆粉加0.3L的蒸馏水加热至沸腾，20min用四层纱布过滤，弃豆渣，黄豆粉滤液备用；

c、向玉米淀粉加入0.3L的蒸馏水，搅拌均匀，边搅拌边加热至沸腾；

d、将黄豆粉滤液和玉米淀粉液混合，添加2.5-3.5g KH₂PO₄和0.8-1.2g MgSO₄·7H₂O，搅拌均匀，倒入1L量筒中，用蒸馏水补足混合液至1L，即为液体原种培养基；

e、用4mol/L NaOH碱液调节液体原种培养基酸碱度，使之初始pH为6.3-6.6；

f、100mL量筒量100mL液体培养基倒入250mL三角瓶中，瓶口塞硅胶塞；

g、0.1Mpa，121℃高压蒸汽灭菌20min；

h、液体原种培养基冷却后置于超净工作台中紫外灯照射杀菌30min；

i、在无菌条件下，将10mL的W2000母液菌种接入液体原种培养基中；

j、接种后置于22-25℃，180-220r/min回旋振荡器发酵培养6-7d。

 

本发明的优点是：

1）配方原料简单、易于获取，操作简便，制造成本低廉。

2）比固体原种培养时间短（40-50天缩短为6-7天），利于批量生产

3）活力接近固体原种，菌龄一致，避免结块问题、隐性污染等问题。

4）用液体原种生产呼吸袋栽培种接种简便，速度快，提高生产效率。

附图说明

图1为本发明制备工艺的流程图。

具体实施方式

以下为本发明的具体实施例，但本发明不仅限于此。

实施例1：

1、W2000母液菌种制备

a、分别准确称量150g 马铃薯，75g 麸皮，红糖 15g，蛋白胨3g，KH₂PO₄ 3g ，MgSO₄·7H₂O 1.13g ；

b、向马铃薯和麸皮加0.45L的蒸馏水加热至沸腾，20min后用四层纱布过滤，弃马铃薯渣和麸皮渣，得到马铃薯和麸皮混合滤液备用。

c、向混合滤液添加3g KH₂PO4和1.13g MgSO₄·7H₂O，搅拌均匀，倒入2L量筒中，用蒸馏水补足混合液至1.5L，即为母液培养基；

d、100mL量筒量100mL母液培养基倒入250mL三角瓶中，瓶口塞硅胶塞；

e、0.1Mpa，121℃高压蒸汽灭菌20min；

f、母液培养基冷却后置于超净工作台中紫外灯照射杀菌30min；

g、在无菌条件下，将PDA斜面上的0.5cm×0.5cm大小的双孢蘑菇W2000菌块接入母液培养基中，25℃静置培养2d；

h、静置培养2d后置于25℃，180r/min回旋振荡器发酵培养12d，完成W2000母液菌种的制备。

2、W2000液体原种培养基的制备

W2000母液菌种制备后，进行W2000液体原种培养基的制备，方法如下：

a、按每升液体原种培养基称取玉米淀粉40g，黄豆粉12g，KH₂PO₄ 3g，MgSO₄·7H₂O 1g。 

b、向黄豆粉加0.3L的蒸馏水加热至沸腾，20min用四层纱布过滤，弃豆渣，黄豆粉滤液备用。

c、向玉米淀粉加入0.3L的蒸馏水，搅拌均匀，边搅拌边加热至沸腾；

d、将黄豆粉滤液和玉米淀粉液混合，添加3g KH₂PO₄和1g MgSO₄·7H₂O，搅拌均匀，倒入1L量筒中，用蒸馏水补足混合液至1L，即为液体原种培养基；

e、用4mol/L NaOH碱液调节液体原种培养基酸碱度，使之初始pH为6.5；

f、100mL量筒量100mL液体培养基倒入250mL三角瓶中，瓶口塞硅胶塞；

g、0.1Mpa，121℃高压蒸汽灭菌20min；

h、液体原种培养基冷却后置于超净工作台中紫外灯照射杀菌30min；

i、在无菌条件下，将10mL液体种子接入液体原种培养基中；

j、接种后置于25℃，200r/min回旋振荡器发酵培养7d，完成W2000液体原种的制备。

3、结果

用本方法制备的W2000液体原种进行呼吸袋栽培种的生产，相对一般固体原种具有制种时间短、活力强、接种效率高、种源成本大幅降低、走菌速度快、成本率高等优点，具体指标如表1所示：

表1 液体原种与一般固体原种生产透气袋栽培种产品技术指标对比

主要技术指标液体原种一般固体原种制种时间6-7天40-50天接种效率150袋/h80袋/h种源成本0.1元/袋0.6-0.8元/袋走菌速度17天20天成品率96.8%81.2%         

实施例2：

1、W2000母液制备

a、分别准确称量200g 马铃薯，100g 麸皮，红糖 20g，蛋白胨4g，KH₂PO₄ 4g ，MgSO₄·7H₂O 1.5g ；

b、向马铃薯和麸皮加0.6L的蒸馏水加热至沸腾，20min用四层纱布过滤，弃马铃薯渣和麸皮渣，得到马铃薯和麸皮混合滤液备用。

c、向混合滤液添加4g KH₂PO₄和1.5g MgSO₄·7H₂O，搅拌均匀，倒入2L量筒中，用蒸馏水补足混合液至2L，即为母液培养基；

d、100mL量筒量100mL母液培养基倒入250mL三角瓶中，瓶口塞硅胶塞；

e、0.1Mpa，121℃高压蒸汽灭菌20min；

f、母液培养基冷却后置于超净工作台中紫外灯照射杀菌30min；

g、在无菌条件下，将PDA斜面上的0.5cm×0.5cm大小的双孢蘑菇W2000菌块接入液体种子培养基中，25℃静置培养2d；

h、静置培养2d后置于25℃，180r/min回旋振荡器发酵培养12d，完成W2000母液菌种的制备。

2、W2000液体原种培养基的制备

W2000母液菌种制备后，进行W2000液体原种培养基的制备，方法如下：

a、按每升液体原种培养基称取玉米淀粉43.7g，黄豆粉13.8g，KH₂PO₄ 3.1g，MgSO₄·7H₂O 1.2g。 

b、向黄豆粉加0.3L的蒸馏水加热至沸腾，20min用四层纱布过滤，弃豆渣，黄豆粉滤液备用。

c、向玉米淀粉加入0.3L的蒸馏水，搅拌均匀，边搅拌边加热至沸腾；

d、将黄豆粉滤液和玉米淀粉液混合，添加3.1g KH₂PO₄和1.1g MgSO₄·7H₂O，搅拌均匀，倒入1L量筒中，用蒸馏水补足混合液至1L，即为液体原种培养基；

e、用4mol/L NaOH碱液调节液体原种培养基酸碱度，使之初始pH为6.3；

f、100mL量筒量100mL液体培养基倒入250mL三角瓶中，瓶口塞硅胶塞；

g、0.1Mpa，121℃高压蒸汽灭菌20min；

h、液体原种培养基冷却后置于超净工作台中紫外灯照射杀菌30min；

i、在无菌条件下，将10mL的W2000菌种母液接入液体原种培养基中；

j、接种后置于25℃，200r/min回旋振荡器发酵培养6.5d，完成W2000液体原种的制备。

实施例3：

1）、W2000母液制备：

a、母液培养基制备；

分别准确称量100g 马铃薯，50g 麸皮，红糖 10g，蛋白胨2g，KH₂PO₄ 2g ，MgSO₄·7H₂O 0.75g ；向马铃薯和麸皮加0.3L蒸馏水加热至沸腾，20min用四层纱布过滤，弃马铃薯渣和麸皮渣，得到马铃薯和麸皮混合滤液备用。向混合滤液添加2.0g KH₂PO₄和0.75g MgSO₄·7H₂O，搅拌均匀，倒入1L量筒中，用蒸馏水补足混合液至1L，即为母液培养基。

100mL量筒量100mL液体种子培养基倒入250mL三角瓶中，瓶口塞硅胶塞；0.1Mpa，121℃高压蒸汽灭菌20min；母液培养基冷却后置于超净工作台中紫外灯照射杀菌30min。

b、在无菌条件下，取W2000母种PDA斜面上的0.5cm×0.5cm大小菌块接入母液培养基中，25℃静置培养2d；

c、180r/min回旋振荡器发酵培养12d，完成W2000母液菌种的制备；

2)、W2000液体原种制备：

a、按每升液体原种培养基称取玉米淀粉48g，黄豆粉10g，KH₂PO4 3.5g，MgSO₄·7H₂O 0.8g； 

b、向黄豆粉加0.3L的蒸馏水加热至沸腾，20min用四层纱布过滤，弃豆渣，黄豆粉滤液备用；

c、向玉米淀粉加入0.3L的蒸馏水，搅拌均匀，边搅拌边加热至沸腾；

d、将黄豆粉滤液和玉米淀粉液混合，添加3.5g KH₂PO₄和0.8g MgSO₄·7H₂O，搅拌均匀，倒入1L量筒中，用蒸馏水补足混合液至1L，即为液体原种培养基；

e、用4mol/L NaOH碱液调节液体原种培养基酸碱度，使之初始pH为6.6；

f、100mL量筒量100mL液体培养基倒入250mL三角瓶中，瓶口塞硅胶塞；

g、0.1Mpa，121℃高压蒸汽灭菌20min；

h、液体原种培养基冷却后置于超净工作台中紫外灯照射杀菌30min；

i、在无菌条件下，将10mL的W2000母液菌种接入液体原种培养基中；

j、接种后置于22℃，180r/min回旋振荡器发酵培养7d。

实施例4：

1）、W2000母液制备：

a、母液培养基制备；

分别准确称量100g 马铃薯，50g 麸皮，红糖 10g，蛋白胨2g，KH₂PO₄ 2g ，MgSO₄·7H₂O 0.75g ；向马铃薯和麸皮加0.3L蒸馏水加热至沸腾，20min用四层纱布过滤，弃马铃薯渣和麸皮渣，得到马铃薯和麸皮混合滤液备用。向混合滤液添加2.0g KH₂PO₄和0.75g MgSO₄·7H₂O，搅拌均匀，倒入1L量筒中，用蒸馏水补足混合液至1L，即为母液培养基。

100mL量筒量100mL液体种子培养基倒入250mL三角瓶中，瓶口塞硅胶塞；0.1Mpa，121℃高压蒸汽灭菌20min；母液培养基冷却后置于超净工作台中紫外灯照射杀菌30min。

b、在无菌条件下，取W2000母种PDA斜面上的0.5cm×0.5cm大小菌块接入母液培养基中，25℃静置培养2d；

c、180r/min回旋振荡器发酵培养12d，完成W2000母液菌种的制备；

2)、W2000液体原种制备：

a、按每升液体原种培养基称取玉米淀粉38g，黄豆粉10g，KH₂PO4 2.5g，MgSO₄·7H₂O 1.2g； 

b、向黄豆粉加0.3L的蒸馏水加热至沸腾，20min用四层纱布过滤，弃豆渣，黄豆粉滤液备用；

c、向玉米淀粉加入0.3L的蒸馏水，搅拌均匀，边搅拌边加热至沸腾；

d、将黄豆粉滤液和玉米淀粉液混合，添加2.5g KH₂PO₄和1.2g MgSO₄·7H₂O，搅拌均匀，倒入1L量筒中，用蒸馏水补足混合液至1L，即为液体原种培养基；

e、用4mol/L NaOH碱液调节液体原种培养基酸碱度，使之初始pH为6.5；

f、100mL量筒量100mL液体培养基倒入250mL三角瓶中，瓶口塞硅胶塞；

g、0.1Mpa，121℃高压蒸汽灭菌20min；

h、液体原种培养基冷却后置于超净工作台中紫外灯照射杀菌30min；

i、在无菌条件下，将10mL的W2000母液菌种接入液体原种培养基中；

j、接种后置于24℃，220r/min回旋振荡器发酵培养6d。