用于预测雌性对象中患上癌症的风险或诊断癌症的方法

摘要

本发明的主题是用于预测未患有癌症的雌性对象中患上癌症的风险或者诊断雌性对象中的癌症的方法，所述方法包括确定神经降压素原或其至少5个氨基酸的片段在从所述雌性对象获得的体液中的水平；和将神经降压素原或其片段的所述水平与患上癌症的风险相关联，其中水平升高预示患上癌症的风险增加或者用于诊断癌症，其中水平升高与癌症的诊断相关联，并且其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、胰腺癌和结肠癌。

说明书

技术领域

本发明的主题是用于预测未患有癌症的雌性对象中患上癌症的风 险或者诊断雌性对象中的癌症的方法，所述方法包括：

·确定神经降压素原或其至少5个氨基酸的片段在从所述雌性对 象获得的体液中的水平；和

·将神经降压素原或其片段的所述水平与患上癌症的风险相关 联，其中水平升高预示患上癌症的风险增加或者用于诊断癌症，其中 水平升高与癌症的诊断相关联，并且

其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、胰腺癌和结肠癌。

背景技术

神经降压素是源自于前神经降压素原前体的13个氨基酸的神经 肽，并与稳定的117个氨基酸的肽神经降压素原(P-NT)一起按化学 计量比例释放，成熟的激素与3种不同的受体结合，分别是神经降压 素受体1和2(Ntsr1和Ntsr2)以及神经降压素受体3(Ntsr3)，其中 神经降压素受体1和2是G蛋白偶联受体，神经降压素受体3是非G 蛋白偶联受体并且也被称为Sortillin-1(SORT1)。

神经降压素由小肠在外周释放，也由下丘脑在中央释放。神经降 压素的外周分泌受到食物摄取、尤其是脂肪的刺激，并且已知其能够 调节胃肠蠕动以及胰腺和胆汁的分泌。有趣的是，神经降压素作为抑 制食欲的激素而参与食欲控制，因为它经中央(脑室内)和外周(腹 腔内)注入大鼠之后，能够严重减少食物的摄取，这种效应似乎主要 是通过神经降压素-1受体(Ntsr1)介导的。在与正常体重人类对象相 比而言的肥胖者中，在液体脂肪餐后，餐后血浆神经降压素浓度降低 (Widen等，1992，Reg Peptides；在改良的假饲(MSF)和液体试验 餐后肥胖者中调节肽的血浆浓度(Plasma concentrations of regulatory peptides in obseity following modified sham feeding(MSF)and a liquid test meal))，这说明肥胖者中的神经降压素分泌调节失常。但是，还 没有大规模的研究探讨过神经降压素是否以及如何与肥胖程度相关。 有趣的是，P-NT在胃旁路手术(Roux-en-Y)后显著增加，据显示， 这是在大多数肥胖的2型糖尿病患者中能导致血糖正常的手术，但是 尚不知道神经降压素总的来说是否参与糖尿病的发展。此外，神经降 压素系统参与冠状动脉疾病和心肌梗死的发展，因为Ntsr3(SORT1) 基因的变异是人类中已知的最强的冠状动脉疾病常见易感基因之一。

肥胖和癌症之间在机制上的联系基本上是未知的，但是，主流理 论之一是过多的脂肪沉积会导致外周雄激素的芳构化增加，并由此导 致循环的雌激素水平升高。另外，据显示，肥胖的特征之一高胰岛素 血症会抑制肝脏产生性激素结合球蛋白(SHBG)，进而使雌激素和雄 激素两者的可生物利用的水平升高，这揭示了肥胖使常见形式的由性 激素引起的癌症形式例如乳腺癌和前列腺癌的风险增加的途径。有趣 的是，神经降压素和Nstr1两者的表达在恶性乳腺导管癌肿瘤中都很常 见，并且实验性地药理阻断或RNA沉默NTSR1能够使小鼠中的肿瘤 生长降低。

乳腺癌细胞中神经降压素受体1(NTSR1)的表达水平已被用于 确定患有乳腺癌的对象的预后(US 2011/0305633)。另外，同一作者 指出，当前尚未描述出循环的神经降压素与胰腺、前列腺、或髓样甲 状腺肿瘤的分期之间的明确的关联性，这可能是由于肝脏对神经降压 素的快速清除。有趣的是，已发现，在一组51名患侵袭性乳腺导管癌 的患者中，所有肿瘤中有91％肿瘤的神经降压素受体1(NTSR1)为阳 性，但所有肿瘤中只有31％肿瘤在所述组织中的神经降压素为阳性 (Souaze等.Caner Research(2006)，66：(12)pages 6243-6249)。

有一些证据可表明神经降压素和神经降压素受体参与了癌的生 长，尤其是参与肺癌、胰腺癌和结肠癌的生长(Carraway等，Peptides (2006)，272445-2460)。据报道，胰腺癌患者血清中的NT水平显著升 高(Picheon等，Anticancer Research(1999)，191445-50)。有趣的是， 该组发现，对于胰腺癌和前列腺癌两者而言，NT水平随着疾病的进展 而降低。相反地，对此，Meggiato等(Tumori(1996)，82；592～5，)发现 NT的血浆水平在胰腺癌中是正常的，但在诊断为胰腺炎的病例中却是 升高的。

Belting等，Cancer，Epidemiology，Biomarkes & Prevention已报道 了血管活性肽用于预测男性中的癌症风险的应用。测定了来自马尔默 饮食与癌症研究的参与者(1768名男性和2293名女性)的空腹血浆中 的MR-pro-ANP、MR-pro-ADM以及和肽素，所述参与者于1991-1994 年接受基线检查前没有癌症。作者表明，在女性中，生物标志物与癌 症发生率之间没有联系。

发明内容

本发明的主题是研究用于预测癌症发生率和预测癌症复发风险的 NT的预测和诊断能力。为了解决这个问题，在所述瑞典前瞻性世代研 究(马尔默饮食与癌症研究)中测定了空腹血浆中神经降压素原的稳 定的片段，并将该生物标志物的基线水平与15年随访期间的乳腺癌发 生率相关联。

令人惊奇的是，据显示，对于女性而言，神经降压素是强有力且 高度显著的生物标志物，用于预测未患有癌症的雌性对象中患上癌症 的风险或者诊断雌性对象中的癌症。

因此，本发明的主题是用于预测未患有癌症的雌性对象中患上癌 症的风险或者诊断雌性对象中的癌症的方法，所述方法包括：

·确定神经降压素原或其至少5个氨基酸的片段在从所述雌性对 象获得的体液中的水平；和

·将神经降压素原或其片段的所述水平与患上癌症的风险相关 联，其中水平升高预示患上癌症的风险增加或者用于诊断癌症，其中 水平升高与癌症的诊断相关联，

其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、胰腺癌和结肠癌。

在本发明的具体实施方案中，所述癌症是乳腺癌。

因此，本发明的主题是确定女性对获得癌症例如乳腺癌的易感性。

本研究中获得的数据还揭示了雄性对象中患上癌症的风险与神经 降压素原或其至少5个氨基酸的片段在从所述雄性对象获得的体液中 的水平之间的关联性；然而，对于目前的数据集来说，这种关联性不 是那么显著的。因此，本发明的方法的值也适用于雄性对象，但是在 本研究中，与雌性相比，所观察到的效果对于雄性来说不是那么强的。

附图说明

图1示出了典型的P-NT剂量/信号曲线。

图2：Kaplan Meier图，示出了在a)低于和高于P-NT中位数 (109pmol/l)以及b)四分位数(Q)1与四分位数4(低于79pmol/l 和高于150pmol/l)的女性中诊断的累积的乳腺癌。

具体实施方式

此处使用的术语“对象”是指有生命的人类或非人类的生物体。 在本文中，优选地，所述对象是人类对象。

术语“水平升高”的意思是在一定的阈值水平之上的水平。

在本发明的一个实施方案中，神经降压素原或其至少5个氨基酸 的片段在体液中的水平是神经降压素原或其至少5个氨基酸的片段的 空腹水平。空腹水平的意思是采取血样前12小时没有摄取食物。

体液可以选自血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(csf)、和唾液。

在本发明的一个实施方案中，在从所述雌性对象采取体液样品时， 所述雌性对象从没有诊断的癌症。

在另一个实施方案中，在从所述雌性对象采取体液样品并且确定 患上癌症的复发风险或者诊断癌症的复发时，所述雌性对象已在之前 被诊断为患有癌症并已治愈。

在本发明的一个实施方案中，在从所述雌性对象采取体液样品时， 所述雌性对象已被诊断为患有心血管疾病或糖尿病。

所述心血管疾病可以选自心力衰竭、动脉粥样硬化、和高血压。

在本发明的另一个实施方案中，在从所述雌性对象采取体液样品 时，所述雌性对象已被诊断为患有2型糖尿病。

糖尿病的定义如下：在基线检查时具有物理诊断史、或在服用抗 糖尿病药物、或空腹全血血糖＞/＝6.1mmol/l(注意，这相当于血浆中的 7.0mmol/l)。

血压正常/高血压(HBP)的定义如下：

HBP：收缩压＞/＝140mmHg或舒张压＞/＝90mmHg或在服用抗高 血压药物。具有正常血压(BP)的对象是所有其他对象，即收缩压＜140 并且舒张压＜90并且没有服用抗高血压药物的对象。

目前的数据表明，在未患有盛行的糖尿病、盛行的乳腺癌、和盛 行的心血管疾病的女性中，神经降压素原或其片段的水平与癌症、特 别是乳腺癌之间存在着强关联性。

目前的数据还表明，在高血压女性中，神经降压素原或其片段的 水平与癌症、特别是乳腺癌之间存在着强关联性，所述高血压女性是 心血管疾病的常见高风险组。

此外，目前的数据还表明，在血压正常的女性中，神经降压素原 或其片段的水平与癌症、特别是乳腺癌之间存在着强关联性。此外， 目前的数据表明，在糖尿病女性中，神经降压素原或其片段的水平与 癌症、特别是乳腺癌之间存在着强关联性。

在本发明方法的具体实施方案中，另外确定至少一种临床参数， 所述临床参数选自：年龄、糖尿病的存在、目前吸烟。

体液中可能检测到的神经降压素原片段例如可以选自以下片段：

SEQ ID NO：1(神经降压素原1-147)

SESEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DFGSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ EDILDTGNDK NGKEEVIKRK IPYILKRQLY ENKPRRRYIL KRDSYYY

SEQ ID NO：2(神经降压素原1-125(大的神经调节肽N))

SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ EDILDTGNDK NGKEEVIKR KIPYIL

SEQ ID NO：3(神经调节肽N：)

KIPYIL

SEQ ID NO：4(神经降压素)

pyroQLYENKPRRP YIL

SEQ ID NO：5(神经降压素原1-117)

SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ EDILDTGNDK NGKEEVI

SEQ ID NO：6(神经降压素原1-132)

SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ EDILDTGNDK NGKEEVIKRK IPYILKRQLY EN

Seq ID NO：7(神经降压素原1-125)

SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ EDILDTGNDK NGKEEVIKRK IPYIL

SEQ ID NO：8(神经降压素原120-140)

KIPYILKRQL YENKPRRPYI L

SEQ ID NO：9(神经降压素原120-147)

KIPYILKRQL YENKPRRPYIL KRDSYYY

SEQ ID NO：10(神经降压素原128-147)

QLYENKPRRP YILKRDSYYY

在本发明方法的更具体的实施方案中，确定神经降压素原1-117 的水平。

在具体的实施方案中，用免疫检测法测定神经降压素原的水平。 更具体地，免疫检测法是按照Ernst等(Peptides(2006)，(27)1787-1793) 中的描述使用的。可用于确定神经降压素原或其至少5个氨基酸的片 段的水平的免疫检测法是基于本发明的结合物，所述结合物用于在雌 性对象的离体体液中，选择性测定针对根据SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10所述的任何神经降压素原序列中的至少一种的免疫反应性。

在本发明的另一个实施方案中，可用于确定神经降压素原或其至 少5个氨基酸的片段的水平的免疫检测法是基于本发明的两种不同的 结合物，所述结合物用于在雌性对象的离体体液中，选择性测定针对 根据SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10所述的任何神经降压素原序列中 的两种不同的部分序列的免疫反应性。因此，在根据SEQ ID NO：1至 SEQ ID NO：10中任一个所述的神经降压素原的同一部分中，两种结合 物靶向不同的序列。

在本发明的具体实施方案中，免疫检测法可用于确定神经降压素 原或其至少5个氨基酸的片段的水平，其中两种不同的结合物特异性 地靶向根据SEQ ID NO：5所述的神经降压素原的N端部分1-117以选 择性测定针对该序列的免疫反应性，所述免疫检测法的特征在于所述 免疫反应性不是神经降压素(NT)(SEQ ID NO：4)或神经调节肽N (NMN)(SEQ ID NO：3)的免疫反应性。由此，通过使用两种不同的 结合物进行的夹心免疫检测法，免疫检测法仅特异性地识别神经降压 素原的N端肽，所述两种不同的结合物与所述N端序列的不同的部分 序列发生特异性结合，所述不同的部分序列含有完整的前神经降压素 原的第67-85位氨基酸和第121-140位氨基酸两者(如Ernst等(2006) 中的图1所示)。(对此，参见US2008/0280306——用于测定释放进 入到循环中的神经降压素的免疫检测法(Immunoassay for determining the release of neurotensin into the circulation)；以及Ernst等，神经降 压素原1-117：在人体循环中鉴定到的稳定的神经降压素前体片段 (Proneurotensin 1-117，a stable neurotensin precursor fragment identified in human circulation)，Peptides(27)，1787-1793(2006))。

在另一个具体实施方案中，上述免疫检测法的特征还可以在于， 在结合物是抗体的情况下，结合物是特异性的单抗隆抗体和/或亲和纯 化的多克隆抗体。其中的一种抗体可以以与固相结合的形式使用，该 固相优选地是各自的试管壁，并且第二抗体是标记的或可选择性标记 的抗体。可以用放射性同位素或通过化学发光、生物发光、荧光、或 通过本领域技术人员已知的酶标记进行所述标记。优选地，所述第二 抗体是通过化学发光标记的。

由于标记了两种抗体中的至少一种，因此，在将两种抗体结合到 根据SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10中任一个所述的神经降压素原之 后，产生了可测定的信号，这使得所产生的夹心复合物能够在测定溶 液中被检测到。(对此，参见US2008/0280306——用于测定释放进入 到循环中的神经降压素的免疫检测法(Immunoassay for determining the release of neurotensin into the circulation)；以及Ernst等，神经降压素 原1-117：在人体循环中鉴定到的稳定的神经降压素前体片段 (Proneurotensin 1-117，a stable neurotensin precursor fragment identified in human circulation)，Peptides(27)，1787-1793(2006))。

上述免疫检测法在实施例2中有更详细的概述。应当结合根据实 施例2所使用的测试和校准来看待所有的阈值和值。本领域技术人员 可能知道，阈值的绝对值可能受到所使用的校准的影响。这意味着， 应当在本文(实施例2)所使用的校准的背景下理解本文中给出的所有 值和阈值。人P-NT校准品可得自ICI-Diagnostics，Berlin，Germany。或 者，还可以用合成或重组的P-NT 1-117或其片段对该检测法进行校准 (同样参见Ernst等，2006)。

根据本发明的方法，用于确定雌性对象中患上乳腺癌的风险或诊 断雌性对象中的乳腺癌的阈值为高于78pmol/l PNT，优选为100pmol/l， 更优选为150pmol/l。在具体实施方案中，所述阈值为约100pmol/l。 这些阈值与上面提到的校准方法相关。P-NT值超过所述阈值，意味着 该对象患上癌症的风险增加或者已患有癌症。

在本发明的一个实施方案中，所述方法被执行一次以上，以便监 测雌性对象中患上乳腺癌的风险或者以便监测治疗过程。在一个具体 实施方案中，执行所述监测以便评估所述雌性对象对所采取的预防性 和/或治疗性措施的响应。

在本发明的一个实施方案中，使用所述方法以便将所述雌性对象 分级成风险组。

根据任何前述实施方案，本发明的主题也是用于预测雌性中患上 癌症的风险或鉴定患上癌症的风险增加的雌性对象的方法，其中神经 降压素原或其至少5个氨基酸的片段在从所述雌性对象获得的体液中 的水平被单独或与其他有预测用途的实验室或临床参数联合用于预测 对象发生不良事件的风险，这是通过选自以下备选方案的方法实现的：

·与“健康”或“明显健康”对象人群中全部预先确定的样品中 的神经降压素原或其至少5个氨基酸的片段在从所述雌性对象获得的 体液中的水平的中位数进行比较，

·与“健康”或“明显健康”对象人群中全部预先确定的样品中 的神经降压素原或其至少5个氨基酸的片段在从所述雌性对象获得的 体液中的水平的四分位数进行比较，

·基于Cox比例风险分析进行计算，或通过使用风险指数计算例 如NRI(净重新分类指数)或IDI(综合鉴别指数)进行计算。

本发明还包括用于执行本发明的方法的装置。因此，在该装置中 实施上文所述的检测法。所述装置是一种自动装置，该装置使得能够 测定所施加的生物发光和化学发光，正如上文中为本发明的检测法所 描述的。优选地，所述装置使得能够进行报告基因检测、ATP监测、 发光免疫检测(LIA)、酶测定、和细胞发光/氧化爆发。因此，按照本 发明，该装置可被称为多模式光度计。该装置的特征还在于，优选被 置于试管中的一种或多种样品能够以链式测定一次或连续测定多次， 甚至能够在很长的一段测试时间内进行测定。此外，本发明的装置的 特征在于珀尔帖冷却检测器、容积可变的注射器、管室中的温度控制、 以及还有控制所述装置的软件单元，所述软件优选地是TubeMaster。 这样的装置的一个实例是Autolumat LB953多管光度计(Berthold Technologies GmbH & Co.KG，Bad Wildbad，Germany)。

本发明的主题也是用于执行本发明的方法的现场即时测试 (poin-of-care)装置。在所述现场即时测试装置中实施如前所述的检 测法。现场即时测试是通过使用可运输、便携、且手持的仪器来完成 的，所述仪器能够执行本发明的方法。因此，能够在非常短的时间内、 在待检查的对象所在位置处或附近进行测定和各自的分析。本发明的 现场即时测试装置的特征在于免疫层析测量仪，该测量仪能够检测检 测法中所使用的结合物的至少一种可光学检测的标签(标记)。

本发明还包括用于执行本发明的方法的检测法和/或试剂盒。检测 法如前所述，而用于执行免疫检测法的各自的试剂盒除了检测法本身 以外，还可以由本领域技术人员已知的惯用的辅助试剂例如缓冲液和 洗涤液组成。

在具体的实施方案中，除了本领域技术人员已知的惯用的辅助试 剂例如缓冲液和洗涤液以外，用于执行本发明的检测法的试剂盒还可 以由以下成分组成，特别是

i)第一免疫试剂，其包括被固定在固相(优选为试管壁)上的针 对人神经降压素原的部分序列的第一种特异性的结合物，在特定的实 施方案中，所述第一种结合物是针对序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10中的任一个，

ii)第二免疫试剂，其包括溶解和标记形式(优选地，第二抗体是 通过化学发光标记的)的针对人神经降压素原的部分序列的第二种特 异性的结合物，在特定的实施方案中，所述第二种结合物是针对SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10中的任一个，条件是第二种结合物靶向与第一 种结合物的靶向序列不同的序列，和

iii)标准和校准溶液，其含有确定的量的肽制品，所述肽制品具有 所述第一和第二特异性抗体的结合位点。

在本发明的另一个实施方案中，用于执行前述检测法的装置或试 剂盒可以提供基于所述检测法的现场即时测试，以预测未患有癌症的 雌性对象中患上癌症的风险或者诊断雌性对象中的癌症。

本发明的主题也是神经降压素或神经降压素受体的结合物，所述 结合物可用于预防或治疗雌性对象中的癌症。

因此，在另一个实施方案中，本发明提供了神经降压素或神经降 压素受体的结合物，所述结合物可用于制备用于预防或治疗雌性对象 中的癌症的药物。

在本发明的一个实施方案中，所述结合物使神经降压素的生物活 性降低至70％或更低。

在本发明的一个实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、肺癌、胰腺 癌和结肠癌。

根据本发明，神经降压素的结合物选自：抗体例如典型的全长免 疫球蛋白IgG、或包含至少重链和/或轻链的F可变结构域的抗体片段 例如化学偶联的抗体(抗原结合片段)，包括但不限于Fab片段，包 括Fab小型抗体、单链Fab抗体、带有表位标签的单价Fab抗体例如 Fab-V5Sx2；用CH3结构域二聚化的双价Fab(小型抗体)；双价Fab 或多价Fab，例如通过借助于异源结构域多聚化而形成的，例如通过 dHLX结构域的二聚化而形成的，例如Fab-dHLX-FSx2；F(ab′)2片段， scFv片段，多聚化的多价或/和多特异性scFv片段，双价和/或双特异 性双抗体，(双特异性T细胞桥联抗体)，三官能抗体，多价 抗体，例如来自与G不同的类型；单结构域抗体，例如源自于骆驼或 鱼的免疫球蛋白的纳米抗体。

根据本发明，神经降压素受体的结合物选自：抗体例如典型的全 长免疫球蛋白IgG、或包含至少重链和/或轻链的F可变结构域的抗体 片段例如化学偶联的抗体(抗原结合片段)，包括但不限于Fab片段， 包括Fab小型抗体、单链Fab抗体、带有表位标签的单价Fab抗体例 如Fab-V5Sx2；用CH3结构域二聚化的双价Fab(小型抗体)；双价 Fab或多价Fab，例如通过借助于异源结构域多聚化而形成的，例如通 过dHLX结构域的二聚化而形成的，例如Fab-dHLX-FSx2；F(ab′)2片 段，scFv片段，多聚化的多价或/和多特异性scFv片段，双价和/或双 特异性双抗体，(双特异性T细胞桥联抗体)，三官能抗体， 多价抗体，例如来自与G不同的类型；单结构域抗体，例如源自于骆 驼或鱼的免疫球蛋白的纳米抗体，或肽类拮抗剂例如[D-Trp¹¹]-神经降 压素、[Tyr(Me)¹¹]-神经降压素(例如由Quiron等描述的)，或非肽类 拮抗剂，例如左卡巴斯汀、SR-48692(NTS1选择性)、SR-142948(非 选择性)、SR-142948A、CP 96345、[3H]SR-48692、SR 48692、SR-48527 和SR-49711，或结合物骨架(scaffold)例如基于四连接素的非Ig骨架 (例如US2010/0028995中所描述的)、纤连蛋白骨架(例如EP1266025 中所描述的)、基于脂质运载蛋白的骨架(例如WO2011/154420中所 描述的)、泛素骨架(例如WO 2011/073214中所描述的)、转移骨架 (transferring scaffold)(例如US 2004/0023334中所描述的)、蛋白A 骨架(例如EP 2231860中所描述的)、基于锚蛋白重复域的骨架(例 如WO 2010/060748中所描述的)、微量蛋白(microprotein)(优选为 形成半胱氨酸结的微量蛋白)骨架(例如EP 2314308中所描述的)、 基于Fyn SH3结构域的骨架(例如WO 2011/023685中所描述的)、基 于EGFR-A结构域的骨架(例如WO 2005/040229中所描述的)和基于 Kunitz结构域的骨架(例如EP 1941867中所描述的)。

实施例

实施例1

抗体的制备

用于免疫的肽/偶合物

合成了用于免疫的肽(JPT Technologies，Berlin，Germany)，所 述肽具有额外的N端半胱氨酸残基以将所述肽与牛血清白蛋白(BSA) 偶合。通过使用Sulfo-SMCC(Perbio-science，Bonn，Germany)将所 述肽与BSA共价偶联。根据Perbio的手册执行偶联步骤。

标记的抗体(LA)肽(P-NT 1-19)：

H-CSDSEEEMKALEADFLTNMH-NH2

固相抗体(SPA)肽(P-NT 44-62)：

H-CNLNSPAEETGEVHEEELVA-NH2

按照如下方法生成抗体：

将BALB/c小鼠用100μg肽-BSA偶合物于第0天和第14天进行 免疫(被乳化在100μl完全弗氏佐剂中)，并用50μg于第21天和第 28天进行免疫(在100μl不完全弗氏佐剂中)。在执行融合实验前3 天，通过一次腹腔内注射和一次静脉内注射给予，动物接受50μg溶解 在100μl盐水中的偶合物。

用1mL 50％聚乙二醇将来自免疫后小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系 SP2/0的细胞在37℃下融合30秒。在洗涤后，将细胞接种于96孔细 胞培养板中。通过在HAT培养基(补充有20％胎牛血清和HAT补充 物的RPMI1640培养基)中生长来选择出杂交克隆。在两周之后，HAT 培养基被替换成HT培养基用于传代3次，然后返回到正常的细胞培养 基中。

在融合后3周时，对细胞培养上清中的抗原特异性IgG抗体进行 初次筛选。测试为阳性的微量培养物被转移到24孔板中进行增殖。在 再次测试之后，用有限稀释技术将所选择的培养物克隆化和再克隆化， 并确定亚型。

(Lane，R.D.“用于提高分泌单克隆体的杂交瘤的生产的短时间聚 乙二醇融合技术(A short-duration polyethylene glycol fusiontechnique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas)”， J.Immuμnol.Meth.81：223-228；(1985)；Ziegler，B.等“通过细胞荧光计和 单克隆GAD抗体的补体依赖性抗体介导的细胞毒性进行检验时，不能 在大鼠胰岛细胞的表面上检测到谷氨酸脱羧酶(GAD)(Glutamate decarboxylse(GAD)is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies)”，Horm. Metab.Res.28：11-15，(1996))。

单克隆抗体的产生

通过标准抗体生产方法(Marx等，Monoclonal Antibody Production (1997)，ATLA 25，121)产生抗体，并通过蛋白质A-层析法进行纯化。 根据SDS凝胶电泳分析，抗体的纯度为＞95％。

实施例2

用于定量人神经降压素原的免疫检测法

使用的技术是基于吖啶酯标记的夹心包被管发光免疫检测法。

标记的复合物(示踪剂)：将100μg(100μl)LA(1mg/ml溶于 PBS，pH7.4)与10μl吖啶NHS酯(1mg/ml溶于乙腈，InVent GmbH， Germany)(EP 0353971)混合并在室温下孵育20分钟。将标记的LA 在Bio-Sil SEC 400-5(Bio-Rad Laboratories，Inc.，USA)上通过凝胶过 滤HPLC进行纯化。纯化的LA被稀释在(300mmol/l磷酸钾、100mmol/l NaCl、10mmol/l Na-EDTA、5g/l牛血清白蛋白，pH 7.0)中。终浓度 约为每200μl含800.000相对光单位(RLU)的标记的复合物(约20ng 标记的抗体)。用AutoLumat LB 953(Berthold Technologies GmbH & Co. KG)测定吖啶酯化学发光。

固相：用SPA(1.5μg SPA/0.3ml 100mmol/l NaCl、50mmol/l Tris-HCl，pH 7.8)包被聚苯乙烯管(Greiner Bio-One International AG， Austria)(室温下18小时)。在用5％牛血清白蛋白封闭之后，将所 述管用pH 7.4的PBS洗涤并真空干燥。

校准：

用含P-NT的人血清稀释液对检测法进行校准。将所集中的具有高 P-NT免疫反应性的人血清(InVent Diagostika，Henningsdorf， Germany)用马血清(Biochrom AG，Deutschland)进行稀释(检测标 准品)。

用人神经降压素原校准品(ICI-Diagnostics，Berlin，Germany)对 该标准品进行校准。或者，可以用合成或重组的p-NT 1-117或其片段 对该检测法进行校准(同样参见Ernst等，2006)。

神经降压素原的免疫检测法：

用移液器将50μl样品(或校准品)吸到SPA包被的管中，在加入 标记的LA(200μl)之后，将所述管在18-25℃下孵育16-22小时。通 过用洗涤液(20mmol/l PBS，pH 7.4，0.1％Triton X-100)洗涤5次(每 次1ml)以去除未结合的示踪剂。

用LB 953测定管结合的LA。

图1示出了典型的P-NT剂量/信号曲线。

实施例3

群体研究

方法

我们测定了来自2559名女性参与者的空腹血浆中的P-NT，这些 参与者属于于1991-1994年接受马尔默饮食与癌症研究的基线检查的 人群(平均年龄58±6岁，女性占59％)。我们用多变量调整(所有 传统的心血管危险因素，糖尿病危险因素，并且在癌症分析中还有癌 症的遗传性)后的Cox比例风险模型来将基线P-NT(与log转换后的 P-NT每增加一个标准偏差对应的风险比率)与发生每个研究终点的第 一次事件的时间相关联，中位随访时间超过12年。终点是通过瑞典国 家医院出院登记处、瑞典心肌梗死登记处、马尔默卒中登记处和瑞典 癌症登记处检索到的。通过这些登记处检索到的终点是经过验证的并 发现是准确的(同样参见Belting等，Cancer Epidemiol Biomarkers Prev； 1-10._2012AACR))。

研究中女性的临床特征

描述性统计

表1

表2

问卷+日记记录：根据问卷或日记记录本得到的基线时的抗高血压治疗 (C02、C03、C07、C08、C09)

表3

糖尿病(空腹血糖＞6.0或者问卷调查后为糖尿病)

表4

目前为吸烟者

表5

女性中PNT的四分位数：

PNT(pmol/1)

在示出的所有亚组分析中，四分位数浓度几乎相同。

P-NT与乳腺癌的预测

我们评估了P-NT与乳腺癌之间的关系(表6)。在女性中，P-NT 与乳腺癌之间存在着强的联系。在全面调整后的模型中，P-NT每增加 一个SD就伴随着未来乳腺癌的风险增加35％，并且P-NT的顶部与底 部四分位数鉴定到了在乳腺癌的风险方面超过2倍的差异(参见表6 和表7)。

表6

用于基线P-NT与乳腺癌的发生率的多变量Cox比例风险模型

表7

乳腺癌-女性

(排除了具有任何癌症史的女性，2140名女性/135次事件)

图2：Kaplan Meier图，示出了在a)低于和高于P-NT中位数 (109pmol/l)以及b)四分位数(Q)1与四分位数4(低于79pmol/l 和高于150pmol/l)的女性中诊断的累积的乳腺癌。

图2a和2b的说明：P-NT增加表示乳腺癌发展的长期风险增加。 由于排除了任何在基线当天(采血)具有癌症史的女性，因此，PNT 高度预示着未来乳腺癌的发展。总体而言，来自Q4的女性发展乳腺癌 的风险比来自Q1的女性高2倍。

在基线时有和没有糖尿病/高血压的女性中的亚组分析

糖尿病的定义：在基线检查时具有物理诊断史、或在服用抗糖尿 病药物、或空腹全血血糖＞/＝6.1mmol/l(注意，这相当于血浆中的 7.0mmol/l)。

血压正常/高血压(HBP)的定义：

HBP：收缩压＞/＝140mmHg或舒张压＞/＝90mmHg或在服用抗高 血压药物。正常血压：所有其他对象。

在方程中使用相同的变量，我们研究了用于预测癌症的不同的女 性亚组(排除了具有任何癌症史的女性)：表8。

表8

在所有亚组中，P-NT显著地预示着乳腺癌的发展。在更健康的女 性中，P-NT的预测能力略强。