一株能产生除草活性物质的铜绿假单胞菌菌株及其粗毒素制备方法

摘要

本发明涉及一种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株(编号CB-4)，及其粗毒素的制备方法，属于微生物应用于农业植物保护领域。此菌株粗毒素对马唐、反枝苋、稗草、狗尾草、虎尾草等杂草均有很强的抑制效果，尤其是对马唐的种子萌发根茎长的IC

说明书

技术领域

本发明为一株铜绿假单胞菌菌株(编号CB-4)及其次生代谢产物用于控制杂草的方法，属于微生物应用于农业植物保护领域。 

背景技术

全世界约有3万余种杂草，其中1800多种能够对各种农业作物造成危害，每年会造成作物总产量约9.7％的损失。化学除草剂是目前常用的防治杂草的方法，但长期使用，其弊端也日益突出，如杂草产生抗药性、水体土壤污染、残留不易降解等。开发研制无污染、安全的新型除草剂已成为当务之急。生物除草剂具有对目标杂草以外的植物影响小、环境负效应小、安全性高的特点而备受人们的青睐，尤其是微生物除草剂以其开发周期短、成本低而越来越显示出独特的优势。微生物除草剂分为微生物活体除草剂和微生物次生代谢产物除草剂。次生代谢产物除草剂具有结构新颖、相对于活体制剂更易保存、多靶标作用位点、环境中易于降解等优点。 

近年来从自然界筛选出具有除草活性的细菌，成为生物除草剂开发研究的热点。已发现的具有除草效果的细菌主要包括如下几个属：假单胞菌属(Pseudomonas)，欧文氏菌属(Erwinia)，黄杆菌属(Flavobacterium)，柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，无色杆菌属(Achromobacter)，肠杆菌属(Enterobacter)，产碱杆菌属(Alcalligenes)等。其中假单胞菌属有Zidack等发现丁香假单胞菌菜豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.phaseolicola)能使Kudzu叶片黄枯，局部坏死；Kenedy等报道荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)D7菌株可抑制旱雀麦(Bromustectrom L.)的生长；美国Banowetz等发现五株荧光假单胞菌(P.fluorescens)能够产生一种抑制早熟禾种子萌发物质。通过检索，尚未发现以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)提取物用做除草剂的相关文献报道。 

本发明为一种铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株(编号CB-4)，及其粗毒素的制备方法。此菌株粗毒素对马唐、反枝苋、稗草、狗尾草、虎尾草等杂草均有很强的抑制效果，尤其是对马唐的种子萌发根茎长的IC₅₀分别达到299.25mg·L^-1和210.11mg·L^-1。而且具有安全环保，对农作物无害等特点。 

权利要求 

1、一种铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2012年1月10日，保藏编号：CGMCC No.5721，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 

2、权利要求1所述铜绿假单胞菌菌株(编号CB-4)，其特征在于：此菌株粗毒素对马唐、反枝苋、稗草、狗尾草、虎尾草等杂草均有很强的抑制效果。 

3、权利要求1所述的铜绿假单胞菌菌株(编号CB-4)粗毒素的制备方法。 

发明内容

一、一株铜绿假单胞菌菌株 

编号CB-4，(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2012年1月10日，保藏编号：CGMCC No.5721，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。此菌株由河北衡水市郊外农田中顶腐玉米病灶处分离得到，经生理生化实验和16S rDNA序列比对鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。此菌株形态为直形、两头钝圆的杆菌，大小0.5～0.8μm×1.5～3.0μm，一端生鞭毛，革兰氏染色为阴性，吲哚阴性，硝酸盐还原阳性，适宜生长温度35-37℃，可产生水溶性色素，将LB固体培养基染成蓝绿色。首次发现此菌株产生的粗毒素对马唐、反枝苋、稗草、狗尾草、虎尾草等杂草均有很强的抑制效果，相同浓度粗毒素施用于玉米、小麦、大豆、高粱植株均未见明显药害。CB-4菌株粗毒素具体除草效果见具体实施方式。 

二、铜绿假单胞菌CB-4菌株粗毒素的制备方法 

1、种子液制备，培养基配方：葡萄糖-10g，蛋白胨-10g，NaCl-5g，KCl-0.1g，MgSO₄-0.1g，蒸馏水1000mL，调pH至6.5-7.2。 

将按上述配方配制好的培养基倒入250mL三角瓶，每瓶100mL，121℃高压灭菌30min，冷却后在超净台内，无菌操作条件下，接种保存在-80℃甘油中的铜绿假单胞菌CB-4菌株，接种量1％，接种后放37℃，转速180rpm的摇床中培养24h，即为种子液。 

2、发酵罐发酵，发酵罐培养液配方：葡萄糖-1％，蛋白胨-1％，NaCl-0.5％，KCl-0.01％，MgSO₄-0.01％，pH6.5-7.2。 

70L发酵罐按70％装上述培养基，装料后在120℃，0.12MPa下灭菌30分钟。冷却至30℃左右后按1％的比例接种制备好的种子液；培养温度37℃，通气量1∶1(v/v·min)，发酵至72小时完毕。 

3、将发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取48h，期间不断震荡使其充分萃取，之后分液得到乙酸乙酯相，减压浓缩至干，得到的黄绿色油膏状物质即为粗毒素。 

具体实施方式

实例1： 

将铜绿假单胞菌菌株(CB-4)粗毒素加蒸馏水分别稀释成1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100mg·L^-1，各加1％的吐温80作为助剂，以茎叶处理法进行除草生物活性测定。具体方法是：口径φ7cm、高10cm塑料杯中(杯底有小孔)装入8cm深的蛭石，每杯中均匀撒入已催芽的马唐种子，覆盖1cm后的蛭石，播种后的塑料杯转移至磁盘中，保持0.5cm的水层，25℃，光照3800Lx，湿度70％条件下培养，至马唐生长至2叶片约2～3cm时供实验用。喉头喷雾器均匀喷洒各药剂，每盆马唐喷洒0.4mL，处理48h后观察结果，按下列公式计算死亡率。死亡率如表1。 

表1不同浓度铜绿假单胞菌菌株(CB-4)粗毒素处理马唐死亡率 

其IC₅₀为335.25mg·L^-1，毒力回归方程为y＝3.7185x-4.4369，相关系数R²＝0.979。 

实例2： 

将铜绿假单胞菌菌株(CB-4)粗毒素加甲醇溶解，分别稀释成62.5、125、250、375、500、750、1000mg·L^-1，以抑制种子萌发法测定除草生物活性。具体方法是：在φ5cm的培养皿内放入皿底大小的滤纸片，每皿加不同浓度的CB-4菌株粗毒素甲醇溶液各2mL，放通风处完全干透后各加蒸馏水2mL，每皿播种10粒经催芽的马唐种子，以甲醇作为对照。48h后测量根芽长度，按下列公式计算抑制率。抑制率如表2 

表2不同浓度铜绿假单胞菌菌株(CB-4)粗毒素对马唐种子萌发抑制效果 

粗毒素抑制马唐根长的IC50为299.25mg·L^-1，毒力回归方程为y＝2.5795x-1.3336，相关系数R²＝0.9501。抑制马唐茎长的IC50为210.11mg·L^-1，毒力回归方程为y＝2.3192x-0.4867，相关系数R²＝0.945。 

实例3： 

近年来蛋白核小球藻常作为除草剂筛选的模式生物。250mL三角瓶SE培养基装100mLSE培养基灭菌，接种1mL蛋白核小球藻种液(购自中科院淡水藻种库)，分别加入不同浓度的粗毒素甲醇溶液各0.2mL，使藻液中的粗毒素浓度分别为500、50、10、5mg·L^-1，设甲醇对照，光照3700Lx，温度25℃培养7天，每天用紫外分光光度计在最大吸收波长680nm处测定藻液吸光度。结果如表3。 

表3不同浓度铜绿假单胞菌菌株(CB-4)粗毒素处理蛋白核小球藻 

见随着时间的增长，CB-4菌株粗毒素对蛋白核小球藻的抑制作用越来越明显，较高浓度的粗毒素可以非常有效的抑制蛋白核小球藻的生长。