一种基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法

摘要

本发明公开了一种基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，该方法首先将滚环扩增引物固定到芯片上成微阵列，然后用β-葡萄糖基转移酶处理待检测基因组DNA，将基因组DNA中所有5hmC进行糖基化修饰，再用亚硫酸钠处理修饰后DNA，然后将检测不同C位点的开环探针置于同一反应管中进行杂交连接；再将连接后产物同芯片杂交，固定芯片的特异引物以连接探针为模板进行滚环扩增，最后不同荧光检测探针同芯片杂交：根据芯片不同矩阵点荧光的类型和强弱，判断出基因组DNA不同C位点是否发生了羟甲基化及其频率大小。该方法可操作性强，特异性强，灵敏度高，检测结果准确，检测效率高，且检测成本低，应用范围广泛。

说明书

技术领域

本发明属于基因芯片技术，特别设计基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的 方法。

背景技术

早在上世纪70年代，Penn等人首次发现在哺乳动物DNA中存在5-羟甲基化胞嘧啶（5hmC） (Pennetal.,1972)。然而由于研究方法的落后，5hmC一直没有受到应有的重视。直到2009 年，Kriaucionis和Tahiliani两位科学家证实小鼠的Purkinje细胞，颗粒神经元以及胚胎 干细胞存在5hmC(Kriaucionis and Heintz,2009;Tahiliani et al.,2009)，在哺乳动 物的其他组织中同样检测到大量5hmC的存在(Globisch et al.,2010)，人们才意识到5hmC 对于调节机体生理生化的重要性研究。因此，5hmC已成为表观遗传学研究的热点。然而，如 何调控基因组5hmC的含量以及如何高效检测基因组特定位点的5hmC状态，则对其调控的分 子机制显得尤为重要。对于前者，新近发现TET蛋白家族使人们对5hmC有了更深入的了解， TET是一种能够催化5甲基胞嘧啶产生5羟甲基胞嘧啶的加氧酶。TET蛋白家族有3个成员， 分别是Tet1，Tet2和Tet3。它们都含有一个序列保守的C-端催化结构域片(Ito et al.,2010; Tahiliani et al.,2009)，并具有2-氧化戊二酸和2价铁原子依赖型双加氧酶的典型特征 (Aravind and Koonin,2001;Loenarz and Schofield,2009)。通过调控TET的表达来调节 特定基因的5hmC含量，来实现5hmC参与信号通路调控的机制研究。而对于高效检测基因组 特定位点的5hmC状态，目前只能检测有限的5hmC位点，或者检测结果存在假阳性，检测结 果不准确以及检测成本高的限制。因此，很有必要在现有技术的基础之上，研究设计一种基 于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法。

发明内容

发明目的：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种检测结果准确，高通量， 高特异性，高灵敏度，成本低，操作简便易行的5-羟甲基化胞嘧啶的检测方法。

技术方案：为了实现以上目的，本发明所采取的技术方案为：

一种基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其包括以下步骤：

（1）首先将滚环扩增引物固定到芯片上成微阵列；

（2）然后用β-葡萄糖基转移酶处理待检测基因组DNA，将待检测基因组DNA中所有5-羟 甲基化胞嘧啶进行糖基化修饰，再用亚硫酸钠处理糖基化修饰后的DNA，DNA中所有未发生羟 甲基化胞嘧啶C反转成尿嘧啶U，而糖基化修饰5-羟甲基化胞嘧啶不被反转；

然后将检测不同C位点的开环探针I和开环探针II放置于同一反应管中，并进行杂交连接， 若特定C位点发生羟甲基化，则开环探针I能连接成环（从而可用于检测5-羟甲基化胞嘧啶）； 若未发生羟甲基化，则开环探针II能连接成环（可用于检测尿嘧啶U）；

（3）再将步骤（2）连接成环后产物同步骤（1）芯片杂交，固定芯片的滚环扩增引物以 步骤（2）中的连接成环后产物为模板进行滚环扩增；然后采用不同荧光检测探针同芯片杂交， 根据芯片不同矩阵点荧光的类型和强弱，检测出待测基因组DNA中不同C位点是否发生了羟甲 基化及其频率大小，从而实现快速检测待测基因组DNA中5-羟甲基化胞嘧啶。

作为优选方案，以上所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其 中步骤（1）所述的滚环扩增引物长23bp，其包括5’端8个T和3’端15bp，近3’端15bp 与开环探针I或开环探针II的5’端的15bp序列互补。

作为优选方案，以上所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，所 述芯片是普通玻璃片或是微球，其表面是聚丙烯酰胺修饰；被固定的扩增引物5’端为丙烯 酰胺基团修饰。

作为优选方案，以上所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，步 骤（2）所述的开环探针I和开环探针II均为合成的寡核苷酸，开环探针I和开环探针II均由4 部分组成，分别包括30bp的C位点检测部分、17bp的通用荧光检测探针杂交部分、15bp的通 用扩增引物杂交部分以及5bp的连接序列部分；其中开环探针I和开环探针II的C位点检测部分 和通用荧光检测探针杂交部分不同，而通用扩增引物杂交部分和连接序列部分的序列长度和 组成均相同。以上所述的开环探针I和开环探针II的C位点检测部分，其中仅对应C位点互补碱 基开环探针I为A，而开环探针II为G，其余序列相同。

作为优选方案，以上所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，步 骤（2）所述的连接成环是指开环探针I或与开环探针II分别与对应的C位点所在序列互补 配对后，开环探针I或与开环探针II的5’和3’端在连接酶作用下被连接起来。

作为优选方案，以上所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，步 骤（3）所述的滚换扩增，是指连接成环的探针与芯片固定的滚环扩增引物杂交后，扩增引物 以连接成环的探针为模板进行引物延伸反应。

作为优选方案，以上所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，步 骤（3）所述的不同荧光检测探针是指若C位点碱基为C或mC则荧光探针为Cy3标记，若C 位点碱基为hmC则荧光探针为Cy5标记。

以上所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，具体的操作工艺流 程如图1所示：

(a)为开环捕获探针结构示意图（探针5’端为G用来检测hmC位点，若为A则用来检测 C和mC位点）。其中1是待检测5hmC位点所在序列的互补序列；2为芯片通用滚环扩增引 物的结合位置；3为芯片通用荧光检测探针的杂交位置；4为1与2间连接序列。

(b)将检测5hmC位点的不同捕获探针和待测基因组DNA（经糖基化、亚硫酸钠处理后， 探针5’端为G）置于同一管中进行配对；

(c)单管中多个开环探针捕获不同5hmC位点并连接成环。5hmC1、5hmC2、5hmC3…… 5hmCn为基因组DNA上不同5hmC位点;P1、P2、P3……Pn为不同开环检测探针。

(d)闭环探针与芯片上的滚环扩增引物杂交并进行在片滚环扩增。

(e)通用荧光探针与扩增产物杂交，然后根据芯片不同矩阵点荧光的类型和强弱，检测 出待测基因组DNA中不同C位点是否发生了羟甲基化。

有益效果：本发明提供的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法和现有 技术相比具有以下优点：

a.本发明能够实现基因组5-羟甲基化胞嘧啶（5hmC）位点的高通量检测，本发明将大量 不同开环探针在同一个反应管中识别不同C位点的5hmC，并能在识别后连接成闭环探针，随后 芯片上特异扩增引物识别该特异闭环探针，并以该闭环探针为模板进行在片滚环扩增，最后 通过特异通用荧光检测探针识别放大的模板，通过荧光信号的类型和有无即可实现对5hmC位 点的高通量检测。

b.本发明检测5hmC位点信息的特异性与灵敏度高。由于开环检测探针与对应的5hmC 位点之间具有惟一对应关系，这种探针设计特点可保证检测探针能特异性识别5hmC位点所在 序列信息，从而可保证检测5hmC位点信息的准确性，克服现有技术检测结果假阳性等结果不 准确的不足。并且，由于滚环扩增同普通的PCR扩增相比，具有扩增单分子DNA的能力，同 时通过滚环扩增还能实现对检测信号成千上万倍的放大，因而具有灵敏度与特异性极高的特 点，这种滚环扩增的特点可实现对微量样本的高灵敏检测，取得了很好的技术效果。

c.成本低，对于芯片的检测来说，不同位点需要不同荧光探针是造成检测试验成本高的 主要因素，而本发明中同一张芯片只需要2个通用荧光检测探针即可实现对不同C位点的识 别，可极大降低试验成本；另外芯片制备简单、操作方便。

具有可推广应用的优点。

d.重复性好，由于本检测方法的整个操作过程具有标准化操作流程，且通过大量实验优 选设计出的探针及杂交均属特异性设计，可保证检测芯片的重复性。

附图说明

图1是本发明提供的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶方法的工艺流程图。

图2是按本发明提供的方法，同时检测4只小鼠的BDNF基因的3个不同羟甲基化胞嘧啶位 点，40572，41685和42178的芯片结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修 改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

以下实施例1至3所用到的探针及其引物的序列如表1所示：

序号 名称 序列 序列1 (1)hmC开环检测探针骨架 5′-ggtccgacgaccagactcccgaccagactccactgg-3′ 序列2 (2)非hmC开环检测探针骨架 5′-ggtccgacgaccagactccctcaagcactggggagc-3′ 序列3 (3)hmC通用荧光检测探针 5′-Cy5-cgaccagactccactgg-3′ 序列4 (4)非hmC通用荧光检测探针 5′-Cy3-ctcaagcactggggagc-3′ 序列5 (5)双引物滚环通用引物 5′-ggtccgacgaccagac-3′ 序列6 (6)滚环扩增引物 5′-tttttttt+被检测位点自cgcg始15碱基序列-3′

实施例1

实现慢性炎性疼痛小鼠脊髓BDNF基因（NT_039207.8）68个CCGG序列首个C位点 （194-59366）羟甲基化胞嘧啶（hmC）状态的检测。

（1）针对上述68个CCGG序列首个C位点分别设计5’端带有丙烯酰胺修饰的特异性扩增引 物，稀释成20uM后固定于丙烯酰胺处理后的玻片上成为微阵列芯片。针对上述68个CCGG序列 每个C位点分别设计2个开环检测探针，分别为开环检测探针I和开环检测探针II（其中开环探 针I用来检测非hmC状态，开环探针II用来检测hmC状态。开环检测探针的主体序列见列表1。

（2）将1ug小鼠脊髓DNA经T4-BGT处理，即用β-葡萄糖基转移酶处理小鼠待检测基因组 DNA，将小鼠待检测基因组DNA中所有5-羟甲基化胞嘧啶进行糖基化修饰，再用亚硫酸钠处理 糖基化修饰后的DNA，DNA中所有未发生羟甲基化胞嘧啶C反转成尿嘧啶U，而糖基化修饰5-羟 甲基化胞嘧啶不被反转（操作步骤按照NEB公司EpiMark^TMBisulfiteConversionKit进行）。

（3）然后将上述136个开环探针稀释后，在20μL反应管至终浓度为1μM，并将上述处理 后基因组DNA置于该管中，42℃温浴30min后，在16℃用连接酶连接开环探针30min(按照 TAKARA公司T4连接酶说明书进行)。然后将连接产物置于上述步骤（1）芯片上，同特异扩增 引物37℃杂交30min后用Bst扩增酶37℃滚环扩增30min（按照NEB公司提供的Bst酶说明）。缓 冲液洗涤芯片3min后，用2μM双色通用荧光探针37℃杂交2，洗涤芯片5min后扫描芯片。根据 微阵列点荧光的颜色及信号强弱即可判断出每个CCGG序列首个C位点hmC状态。

结果表明，慢性炎性疼痛状态下，小鼠脊髓BDNF基因68个CCGG位点中有3个位点（314， 32906和41813）发生了羟甲基化（hmC型），57个位点为发生羟甲基化（mC和C型），8个位点（720， 2946，32281，34183，38096，42015，42363，58736）为杂合型（hmC、mC和C型）。而正常小 鼠脊髓BDNF基因68个CCGG位点中有1个位点（41813）发生了羟甲基化（hmC型），65个位点为 发生羟甲基化（mC和C型），2个位点（38096，42363）为杂合型（hmC、mC和C型）。因此，慢 性炎性疼痛小鼠脊髓BDNF基因发生了明显的羟甲基化增加现象。

如图2所示，按实施例1方法同时检测4只疼痛小鼠的BDNF基因（NT_039207.8）的3 个不同hmC位点（32131，32906和422363）的芯片结果。其中1代表待检测位点为hmC型； 2代表杂合型；3代表该位点为mC和C型。

实施例2

实现慢性类风湿疼痛病人血浆DNA的BDNF基因(AC_000143.1)33个CGCG序列的首个C 位点羟甲基化胞嘧啶（hmC）状态的检测。

（1）针对上述33个CGCG序列首个C位点分别设计5’端带有丙烯酰胺修饰的特异性扩 增引物，稀释成20uM后固定于丙烯酰胺处理后的玻片上成为微阵列芯片。然后针对上述33 个CGCG序列每个C位点分别设计2个开环检测探针，分别为开环检测探针I和开环检测探针 II（其中开环探针I用来检测非hmC状态，开环探针II用来检测hmC状态。开环检测探针的 主体序列见列表1。

（2）将1ug病人血浆DNA经T4-BGT处理，即用β-葡萄糖基转移酶处理小鼠待检测基因组 DNA，将小鼠待检测基因组DNA中所有5-羟甲基化胞嘧啶进行糖基化修饰，再用亚硫酸钠处理 糖基化修饰后的DNA，DNA中所有未发生羟甲基化胞嘧啶C反转成尿嘧啶U，而糖基化修饰5-羟 甲基化胞嘧啶不被反转（操作步骤按照NEB公司EpiMark^TMBisulfiteConversionKit进行）。 将66个开环探针稀释后，在20μL反应管至终浓度为1μM，并将上述处理后基因组DNA置于该 管中，42℃温浴30min后，在16℃用连接酶连接开环探针30min(按照TAKARA公司T4连接酶说 明书进行)。

（3）然后将连接产物置于步骤（1）制备得到的芯片上，同特异扩增引物37℃杂交30min 后，用Bst扩增酶37℃滚环扩增30min（按照NEB公司提供的Bst酶说明）。然后用缓冲液洗涤芯 片3min，用2μM双色通用荧光探针37℃杂交2，洗涤芯片5min后扫描芯片。根据微阵列点荧光 的颜色及信号强弱即可判断出每个CGCG序列首个C位点的hmC状态。最后分析血浆BDNF基因 CGCG位点羟甲基化与慢性炎性疼痛的相关性。

结果表明，慢性类风湿疼痛病人BDNF基因的33个CGCG位点有4个位点（5760，6103，6250 和8666）发生了羟甲基化（hmC型），27个位点未发生羟甲基化（mC和C型），2个位点（5956 和9064）为杂合型（hmC、mC和C型）。而正常志愿者血样BDNF基因33个CCGG位点中仅有1个位 点（6250）为杂合型，其余32个位点未发生羟甲基化（mC和C型）。因此，相对与正常，慢性 类风湿疼痛病人血样BDNF基因发生了明显的羟甲基化增加现象。

实施例3

实现对慢性神经病理性疼痛小鼠脊髓DNA的BDNF基因19个CCGG序列（40945-59475） 首个C和COMT基因（NT_187012.1）10个CCGG序列(771-15422)首个C的hmC状态联合检测。

（1）针对上述的BDNF基因19个CCGG序列（40945-59475）首个C和COMT基因（NT_187012.1） 10个CCGG序列(771-15422)首个C，分别设计5’端带有丙烯酰胺修饰的特异性扩增引物，稀 释成20uM后固定于丙烯酰胺处理后的玻片上成为微阵列芯片。针对每个C位点分别设计2个开 环检测探针，分别为开环检测探针I和开环检测探针II（其中开环探针I用来检测非hmC状态， 开环探针II用来检测hmC状态。开环检测探针的主体序列见列表1。

（2）将1ug小鼠脊髓DNA经T4-BGT处理，即用β-葡萄糖基转移酶处理小鼠待检测基因组 DNA，将小鼠待检测基因组DNA中所有5-羟甲基化胞嘧啶进行糖基化修饰，再用亚硫酸钠处理 糖基化修饰后的DNA，DNA中所有未发生羟甲基化胞嘧啶C反转成尿嘧啶U，而糖基化修饰5-羟 甲基化胞嘧啶不被反转（操作步骤按照NEB公司EpiMark^TMBisulfiteConversionKit进行）。 将58个开环探针稀释后，在20μL反应管至终浓度为1μM，并将上述处理后基因组DNA置于该 管中，42℃温浴30min后，在16℃用连接酶连接开环探针30min(按照TAKARA公司T4连接酶说 明书进行)。

（3）然后将连接产物置于步骤（1）制备得到的芯片上，同特异扩增引物37℃杂交30min 后，用Bst扩增酶37℃滚环扩增30min（按照NEB公司提供的Bst酶说明）。用缓冲液洗涤芯片 3min，用2μM双色通用荧光探针37℃杂交2，洗涤芯片5min后扫描芯片。根据微阵列点荧光的 颜色及信号强弱即可判断出每个CGCG序列首个C位点hmC状态。最后分析BDNF基因19个CGCG位 点羟甲基化和COMT基因（NT_187012.1）10个CCGG位点与慢性炎性疼痛的相关性。

结果表明，慢性病理性疼痛状态下，小鼠脊髓BDNF基因19个CCGG位点中有1个位点(58210) 为hmC型，16个位点为mC和C型，其余2个位点(42178和57848)为杂合型。而正常小鼠脊髓BDNF 基因19个CCGG位点中有18个位点为mC和C型，其余1个位点（42178）为杂合型。COMT基因的10 个CCGG位点中，正常小鼠和疼痛小鼠均没有检测到羟甲基化发生。

因此，慢性炎性疼痛小鼠脊髓BDNF基因发生了明显的羟甲基化增加现象；而所检测的COMT 基因则没有发生羟甲基化发生。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  徐州医学院

<120>  一种基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法

<130>  001

<160>  5   

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

ggtccgacga ccagactccc gaccagactc cactgg             36

 

<210>  2

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

ggtccgacga ccagactccc tcaagcactg gggagc           36

 

<210>  3

<211>  17

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

cgaccagact ccactgg                              17

 

<210>  4

<211>  17

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

ctcaagcact ggggagc                            17

 

<210>  5

<211>  17

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  5

ggtccgacga ccagac                            16