一种快速表征剩余污泥碱性厌氧发酵过程与产物的方法

摘要

本发明公开了一种快速表征剩余污泥碱性厌氧发酵过程与产物的方法。其特点将流式细胞术与三维荧光光谱结合起来。通过流式细胞术快速表征剩余污泥碱性厌氧发酵过程中污泥细胞状态的变化，同时确定溶解性物质的主要来源；通过三维荧光光谱快速表征碱性发酵液中主要溶解性有机物（碳水化合物、蛋白质等）的含量变化；通过结合这两种技术，为剩余污泥碱性厌氧过程提供一种简单、快速、有效的表征方法。本发明方法对于旨在回收溶解性有机物作为反硝化碳源的剩余污泥碱性厌氧发酵过程，可以使试验过程得到准确、动态、高效的控制。

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速表征剩余污泥碱性厌氧发酵过程与产物的方法，属于污水处理厂污泥资源化与减量化的研究领域。 

技术背景

《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB18918-2002）对污水排放提出了更为严格的要求，这就需要大部分污水处理厂在现有污水处理的基础上对污水进行深度处理。在污水处理过程中，会有占污水处理量0.3-0.5%的剩余污泥（以含水率97%计）产生，若继续进行深度处理，污泥量会增加0.5-1倍。因此我国污水处理事业的蓬勃发展会使作为污水处理副产品的剩余污泥问题日益凸显。 

研究表明，剩余污泥除含有大量的微生物细胞之外，还含有微生物在生长代谢中分泌的胞外多聚物（EPS）。由于细胞壁能够保护细胞的完整性以及免于被微生物直接利用，因此污泥水解并释放胞内物质被认为是污泥减量技术中的限速步骤。污泥水解可以通过许多方法和技术进行强化，比如（1）物理方法，包括机械法和热处理法等；（2）化学方法，包括氧化法、酸碱法和投加解偶联剂等；（3）生物方法，包括消化和原、后生动物捕食；（4）联合方法，如热-碱联合等。这些方法和技术几乎均可以实现污泥固体溶解，絮体解絮以及细胞破裂。此外，细胞破裂、溶解过程中释放出来的物质可以进一步通过隐性生长被生物污水处理工艺所降解，同时带来剩余污泥干重的减少。 

近年来，对于剩余污泥厌氧发酵的研究越来越多。这是因为剩余污泥厌氧发酵不仅能实现污泥减量，还能为生物营养物去除工艺（BNR）提供外加碳源，特别是挥发性脂肪酸，以此来提高污水处理过程中氮磷的去除效率。近来的研究指出，在碱性条件下的剩余污泥厌氧发酵可以显著促进溶解性化学需氧量（SCOD）的增长，因此剩余污泥碱性厌氧发酵受到越来越多的关注。 

剩余污泥碱性厌氧发酵过程是一个时变、非线性、随机性的多变量耦合系统。涉及到微生物细胞生长代谢的复杂过程，影响因素复杂，参数间的相关性高。发酵过程中，污泥细胞状态和SCOD（包括多糖、蛋白质、挥发性脂肪酸）浓度等是直接反映发酵品质的重要生化过程参数。这些参数由发酵过程中添加的污泥种类和浓度决定，也与发酵过程环境参数（发酵pH值、溶解氧浓度、温度、搅拌速度）有关，相互之间关系复杂。如仅通过 对环境参数的检测来对发酵过程进行控制和调节，可能会由于控制或调节不当，轻则影响发酵过程的进行，重则使整个发酵过程失败。此外，上述直接反应发酵品质的生化过程参数，其定性和定量的表征仍利用传统测定方法进行，这些方法大多会造成时间和试剂的浪费，带来发酵过程调节和控制的滞后。 

针对这种情况，本发明将流式细胞术和三维荧光光谱技术结合起来，利用流式细胞术快速表征主要溶解性物质在发酵过程中的来源，以及碱性厌氧发酵对细胞完整性、透化性以及破裂的的作用程度；同时利用三维荧光光谱中类蛋白质荧光峰强度与溶解性有机物的相关性，对发酵液中溶解性有机物的含量变化进行快速表征。 

所述流式细胞技术，在发展初期主要应用于医学领域和微生物利用。近年来，随着荧光染料的不断改进和分析技术不断提高，流式细胞术成为环境研究领域一种不可或缺的工具。它不仅可以解决因活性污泥大多数微生物不可培养，无法用传统培养、观察和计数方法进行分析的问题，而且可是实现短时间内细胞（不论何种生理状态）的数据采集和多参数分析。目前，尚无可详细参考的有关使用流式细胞仪定量分析剩余污泥碱性厌氧发酵过程中污泥细胞数量和状态的报导。 

所述三维荧光光谱技术是利用物质分子在特定波长的光照射情况下可以产生荧光的特性，进行该物质定性和/或定量分析的技术。该技术具有灵敏度高，测量简单，重现性好，取样量少，时间短等优点，被广泛用于天然水体水质监测、污水处理厂水质快速监测分析以及饮用水处理中消毒副产物的监测等领域。研究表明，剩余污泥胞外主要成分为蛋白质和碳水化合物，其中以蛋白质的含量为最多。在剩余污泥碱性厌氧发酵过程中，通过三维荧光测定，可以快速得到发酵液中类蛋白峰的荧光强度，根据不同的激发Ex/发射Em波长可分为类酪氨酸（Ex/Em=275/310nm和275/340nm）和类色氨酸（280/340nm）荧光，其中，与类色氨酸相比，类酪氨酸的荧光强度在碱性条件下较不稳定，因此，可以利用三维荧光光谱中类色氨酸蛋白质荧光强度对剩余污泥碱性厌氧发酵液中溶解性有机物含量变化进行表征，且目前尚无该方面研究的详细报导。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速表征剩余污泥碱性厌氧发酵过程与产物的方法。 

本发明特点是将流式细胞术与三维荧光光谱技术结合起来。利用流式细胞术快速表征碱性厌氧发酵过程中污泥细胞状态的变化，同时确定溶解性物质的主要来源；利用三维荧光光谱快速表征碱性发酵液中主要溶解性有机物（碳水化合物、蛋白质等）的含量变化。 

本发明的目的在于解决活性污泥中大多数微生物不可培养，无法用传统培养、观察和 计数方法对细胞数量和生理状态进行评价的问题；同时解决现有方法在表征发酵过程中溶解性有机物耗时耗材的问题。建立一种利用流式细胞仪结合三维荧光光谱，快速表征剩余污泥碱性厌氧发酵的方法。 

所述碱性厌氧发酵过程的初始剩余污泥浓度可为8-15g/L；初始混合液挥发性悬浮固体占悬浮固体总量的50%-70%。初始剩余污泥胞外多聚物主要为蛋白质，其次为多糖，二者质量比为3-5：1。 

所述碱性厌氧发酵过程的温度可为20-40℃。 

所述碱性厌氧发酵过程的pH可为8-10。 

所述碱性厌氧发酵过程的溶解氧可为<1mg/L。 

所述碱性厌氧发酵过程的搅拌方式为机械搅拌，搅拌速率为50-80rpm。 

本发明的第一方面提供了一种基于流式细胞技术，快速表征细胞数量和状态以及溶解性有机物来源的方法。在解决因活性污泥中大多数微生物不可培养，无法用传统培养、观察和计数方法分析剩余污泥碱性厌氧发酵过程中细胞数量和状态的问题的同时，获得碱性厌氧发酵过程中溶解性有机物的来源。 

本发明提供的基于流式细胞术的快速表征细胞数量和状态以及溶解性有机物来源的方法，所述方法包括为碱性厌氧发酵过程中，剩余污泥选择菌悬液制备方法，菌悬液的荧光染色方法，流式细胞分析方法以及溶解性有机物来源确定方法。 

所述第一方面的方法，步骤如下： 

第一，剩余污泥混合液在混匀后取样，取样后立即放于-20℃条件下保存。 

第二，将第一步保存的样品用磷酸盐缓冲溶液（pH7.2）稀释5倍。 

第三，将第二步稀释后的污泥样品，置于带有冷却系统的超声装置中，在90kJ/L的能量下进行超声处理，超声处理具体参数的选择可以在本领域技术范围内进行调整，这是本领域技术人员不需要付出创造性的劳动可以实现的。 

第四，将第三步处理后的样品以1:25的比例，在PBS中进行二次稀释，稀释后污泥样品菌悬液的浓度为10⁶-10⁷个细胞/ml。 

第五，将第四步处理后的样品过孔径为48μm的筛网，以去除少量较大体积絮体的杂质，以免堵塞流式细胞仪管口。过筛后的污泥样品即为所述第一方面方法所述菌悬液。 

第六，向第五步过筛处理后的菌悬液中加入荧光染料SYBR Green I，于室温下避光染色10min；而后加入荧光染料PI，于室温下避光染色5min。染色后，立即将样品上流式细胞仪检测，样品测试前用未染色的污泥样品作为阴性对照。 

其中，荧光染料SYBR Green I（可以对任意生理状态下的细胞进行染色，绿色荧光通道）为：用二甲基亚砜（DMSO）以1:30比例稀释SYBR Green I原液作为染料储备液，在2-4℃条件下保存。荧光染料PI（只能对细胞膜遭受破坏的死亡细胞进行染色，红色荧光通道）为：用超纯水将碘化丙啶（PI）固体粉末稀释至1mg/ml，同样在2-4℃条件下保存。染色时，SYBR Green I和PI荧光染料的加量分别为5μL/mL。 

第六步中所述的流式细胞仪，其发射波长为488nm的蓝光氩离子激光以及发射波长为635nm的红光二极管激光。绿色和红色荧光信号通过对数放大器进行收集。绿色荧光（FL1）和红色荧光（FL2）均被收集于绿色荧光与红色荧光的二维散点图上，由于两个荧光通道相邻，因此所获得的散点图需要经过适当补偿。 

第七，将第六步中获得的流式细胞二维散点图数据化，具体数据化方式属于本领域技术人员的常规选择，例如：Bacteria permeabilisation and disruption caused by sludge reduction technologies evaluated by flow cytometry，P.Foladori，water research，44(2010)4888-4899等，获得不同状态细胞在不同碱性厌氧发酵时间下的数量，并通过数量的变化，分析得到溶解性有机物的主要来源——胞外物质和/或胞内物质。 

第七步所述的溶解性有机物来源分析，是以初始污泥样品中的活性细胞（Nviable）、死亡细胞（Ndead）以及微小污泥絮体（Nflocs）数量之和作为碱性厌氧发酵过程初始的污泥细胞数量（N₀）。不同碱性厌氧发酵时间下N_viable、N_dead和N_flocs之和作为N_t，而N₀-N_t则为在剩余污泥碱性厌氧发酵过程中产生的细胞有机碎片N_debris。通过细胞有机碎片的产生和积累情况，确定发酵过程中溶解性有机物的主要来源。 

本发明提供的基于流式细胞术的快速表征细胞数量和状态以及溶解性有机物主要来源方法的优点： 

该方法解决了大多数活性污泥中微生物不可培养，无法用传统培养、观察和计数方法来评价污泥减量程度的问题，以及避免了现有污泥悬浮固体测定方法耗时费力的问题。除此之外，该方法还能通过细胞数量和状态变化的分析，快速给出碱性厌氧发酵过程中溶解性有机物的主要来源。在污泥样品采集保存后，该方法仅在30min内即可完成菌悬液制备、染色、分析以及获得结果，实现了剩余污泥碱性厌氧发酵过程中污泥微生物细胞数量和状态变化的快速表征。利用该方法不但可以得到污泥微生物细胞在碱性发酵过程的变化特征，还可以根据绿色荧光和红色荧光的二位散点图来分析碱性厌氧发酵过程中溶解性有机物的来源。该方法操作步骤简单，检测时间短，在污水处理以及污泥处理处置等研究领域 具有广阔的应用前景。 

本发明的第二方面提供了一种基于三维荧光光谱技术，快速表征剩余污泥碱性厌氧发酵液中溶解性有机物含量变化的方法。 

本发明提供的基于三维荧光技术的快速表征碱性厌氧发酵液中溶解性有机物质含量变化的方法，所述方法包括为发酵液预处理，三维荧光分析与数据处理以及荧光强度与溶解性有机物含量相关性判别方法。 

所述第二方面的方法，步骤如下： 

第一，剩余污泥混合液在混匀后取样，取样后立即放于-20℃条件下保存。 

第二，将第一步保存的样品在10000rpm，4℃条件下离心10min； 

第三，取第二步离心后样品的上清液，过0.45μm滤膜后保存于2-4℃条件下待测。至此发酵液预处理完毕。 

第四，将第三步过滤后的样品用水稀释1-10倍，得稀释液，稀释液中总有机碳（TOC）含量≈500mg/L。 

第五，取实验有效量的第四步稀释后的样品用三维荧光光谱仪中进行荧光强度的测定。 

所述三维荧光光谱测定，其激发波长λ_ex=200-500nm，发射波长λ_em=200-550nm，激发和发射狭缝宽度均为5nm，扫描速度为600nm/min。 

第六，以第五步中获得的三维荧光光谱数据为基础，绘制等高线图。等高线图以发射波长为横坐标，以激发波长为纵坐标，描述荧光强度随激发/发射波长的变化情况。并确定类色氨酸蛋白质物质（Ex/Em=280nm/340nm）的荧光强度。 

第七，将第六步中依据等高线图获得的类色氨酸蛋白质物质荧光强度做自然对数变换，并与通过变换后类色氨酸荧光强度的大小判别发酵过程中溶解性有机物含量的变化。 

本发明提供的基于三维荧光光谱技术的快速表征剩余污泥碱性厌氧发酵液中溶解性有机物含量变化方法的优点： 

该方法避免了现有污泥发酵液中溶解性有机物测定方法耗时耗材费力的问题。在发酵液样品采集保存后，该方法仅在30min内即可完成发酵液预处理、三维荧光分析以及结果获取，实现了剩余污泥碱性厌氧发酵过程中溶解性有机物含量变化的快速表征。该方法操作步骤简单，检测时间短，在污水处理及污泥处理处置研究中具有广阔的应用前景。 

本发明中两种技术的结合在于，在第一种技术中，并不只单纯为了获得微生物数量，而是通过微生物不同生理状态细胞的变化，给出发酵过程中溶解性有机物的来源，并结合 第二种技术，表征不同来源溶解性有机物的主要组成。即，结合本发明的第一方面和第二方面的方法，可以从污泥细胞数量及状态，发酵液有机物质变化及来源等方面快速表征剩余污泥碱性厌氧发酵过程与产物，为该发酵过程的运行、调节和控制提供快速、灵敏、环境友好的方法。 

附图说明

图1为本发明提供的第一方面方法在流式细胞仪上得到的二维散点图区域示例，其中区域1是代表死亡细胞的红色荧光区域；区域2代表微小污泥絮体区域，同时含有红色和绿色荧光，该区域内既包含活性细胞也包含死亡细胞；区域3是背景噪声区域；区域4是代表活性细胞的绿色荧光区域。 

图2为利用本发明提供的第一方面方法在流式细胞仪上获得的，不同发酵时间下，剩余污泥碱性厌氧发酵过程的流式细胞示意图。 

图3为将图2中不同状态细胞数量数据化后的结果。 

图4为本发明提供的第二方面方法在三维荧光光谱仪上获得的，不同发酵时间下，剩余污泥碱性厌氧发酵过程中发酵液的三维荧光光谱图，其中PeakA为类酪氨酸荧光峰；PeakB为类色氨酸荧光峰；PeakC为类富里酸荧光峰。 

图5为本发明提供的第二方面方法中，类色氨酸荧光强度做自然对数变换后随发酵时间变化的曲线。 

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式进行说明。 

剩余污泥来源：剩余污泥取自河北省廊坊市某生活污水处理厂的贮泥池。将剩余污泥置于4℃冰柜中，静止放置24h后，测定该污泥的初始条件：污泥浓度（混合液悬浮固体）为12.2g/L；混合液挥发性悬浮固体所占比例为55%；胞外总蛋白质和碳水化合物含量分别为2.9g/L和0.6g/L；污泥初始pH为6.8-7.1。 

剩余污泥水解酸化条件：pH9.0±0.2，温度为室温25℃，机械搅拌速度60rpm，溶解氧浓度<1mg/L。 

流式细胞仪分析遵循本发明的第一方面方法所述的步骤（参见发明内容部分）。分析结果如图2所示，通过软件数据化处理后，可得图3。从图3中可以得到剩余污泥在碱性厌氧发酵的前六天中，细胞碎片的积累较少，因此可以判断，该段时间，发酵液中溶解性有机物的来源主要是胞外物质（阶段I），而随着发酵的继续进行，溶解性有机物的主要来源随着细胞破裂和有机碎片的积累，转变为以胞内物质为主（阶段II）。 

三维荧光光谱测定遵循本发明的第二方面方法所述的步骤（参见发明内容部分），测定结果图4所示。根据图4所得的三维荧光光谱，将其中类色氨酸物质的荧光强度做自然对数变换，如图5所示。 

将图5中类色氨酸物质的荧光强度与利用现有测定技术测得的溶解性有机物的浓度进行相关性分析，可得类色氨酸物质的荧光强度与溶解性化学需氧量、溶解性碳水化合物以及溶解性蛋白质存在很好的相关性。其中，阶段I的相关系数R²均大于0.9（n=20）；与阶段I相比，阶段II的相关系数R²虽然较低，但是也在0.7-0.8之间（n=20），这是由于在阶段II中可生物降解性低于胞外多聚物的胞内物质开始成为溶解性有机物质的主要来源所致（如图3所示）。此外，当碱性厌氧发酵过程进行到第2d时，类色氨酸荧光强度的产生速率降低（如图5所示），这是因为在第2天时，开始出现少量细胞碎片的积累（如图3所示），这也表明，胞内物质的释放可以减缓溶解性有机物的产生速率。同时也说明，基于流式细胞仪得到的溶解性有机物来源的方法具有一定的合理性。 

此外，本发明方法具有很好的重复性，平均误差小于20%（n=20）。